耐熱性ペクチンリアーゼおよびそれを用いたペクチンの製造方法
【課題】植物材料から広義のペクチンを製造するにあたり、強酸のような比較的厳しい反応条件を使用することなく、かつ比較的高温条件において、高分子量を有するペクチンをより簡易にかつ効率良く製造することができる、耐熱性ペクチンリアーゼおよびそれを用いたペクチンの製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、耐熱性に優れるペクチンリアーゼおよび当該リアーゼを用いたペクチンの製造方法を提供する。本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、代表的には、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である。このペクチンリアーゼを植物材料に作用させることにより、比較的高分子量でなるペクチンを効率良く製造することができる。
【解決手段】本発明は、耐熱性に優れるペクチンリアーゼおよび当該リアーゼを用いたペクチンの製造方法を提供する。本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、代表的には、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である。このペクチンリアーゼを植物材料に作用させることにより、比較的高分子量でなるペクチンを効率良く製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物由来のペクチンリアーゼに関する。より詳細には、高温側に至適反応温度を有し、かつ高分子のポリメチルガラクチュロン酸および／またはポリガラクチュロン酸を含有するペクチンを効率良く製造し得る、耐熱性ペクチンリアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは、植物体の非木質化組織に多く含まれる酸性多糖であり、広義には、主にポリメチルガラクチュロン酸（狭義にはペクチンといわれることもある）と、その一部が脱メチルエステル化されたポリガラクチュロン酸（狭義にはペクチン酸と言われることもある）とで構成される。このようなペクチンは、例えば、増粘多糖剤またはゲル化剤として広く用いられている。
【０００３】
ペクチンは、レモンの皮、リンゴのような植物体に多く含まれており、木質化組織間を結合するための物質として知られている。また、その単離にあたっては、種々の方法が用いられている。例えば、従来では、当該植物体に塩酸または硝酸のような強酸を作用させることにより、木質化組織を構成するセルロース鎖との間の結合を切断して、ペクチンを取り出す方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような方法では、上記強酸を用いて６０℃〜８０℃の比較的高温条件下にて数十分から数時間処理する必要がある。このような厳しい条件での処理を要するので、高分子量のペクチンを製造するための工程管理は難しい。また、このような強酸の使用は、セルロース鎖とペクチンとの間の結合だけでなく、ペクチン自体の結合も部分的に切断することがあり、得られるペクチンは比較的低分子となる傾向にある。このため、得られたペクチンは、充分な粘性を得るために必要な高い分子量（例えば、１００，０００ｇ／モル以上）を達成することが困難であるという問題があった。
【０００５】
他方、このような強酸の使用を回避するために、ペクチンリアーゼおよび当該リアーゼ活性を有する微生物の使用も検討されている。
【０００６】
従来、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］活性を有する微生物由来の酵素として、糸状菌および細菌由来の酵素が知られている。しかし、従来のペクチンリアーゼは６０℃以上の反応温度での活性が著しく低いため、実際の用途は果汁の清澄化などに限定されている。
【０００７】
繊維加工分野においても、綿などの天然繊維を精錬する際に、セルロース鎖からペクチンを除去することが重要とされている。従来の精練は、一般に、高温下で水酸化ナトリウムが使用されていた。これに対し、現在、ペクチン酸リアーゼ［ＥＣ４．２．２．２］、ペクチンエステラーゼ［ＥＣ３．１．１．１１］などの酵素を利用したバイオ精錬法が行われている（例えば、特許文献２〜５参照）。しかし、これらのバイオ精錬で使用される酵素は、いずれもポリガラクチュロン酸（ペクチン酸）のみに作用し、ポリメチルガラクチュロン酸に作用するものではない。そのため、さらに精錬効率を高めるための技術が所望されている。
【特許文献１】特開平８−４８７０２号公報
【特許文献２】特開２００４−１４１０８１号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５７１号公報
【特許文献４】特開２００３−１８０３６４号公報
【特許文献５】特開２００２−８５０７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、植物材料から広義のペクチンを製造するにあたり、強酸のような比較的厳しい反応条件を使用することなく、かつ比較的高温条件において、高分子量のペクチンをより簡易にかつ効率良く製造することができる耐熱性ペクチンリアーゼおよびそれを用いたペクチンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を提供する。
【００１０】
一つの実施態様では、上記至適反応温度は６０℃から１０５℃である。
【００１１】
別の実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、下記の性質を有する：
（１）至適反応温度が７０℃から８０℃であり；そして
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【００１２】
また、別の実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、ｐＨ７の至適反応温度が８０℃である。
【００１３】
異なる実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、ｐＨ８の至適反応温度が７０℃である。
【００１４】
本発明はまた、植物材料に、上記ペクチンリアーゼを作用させる工程を包含する、ペクチンの製造方法を提供する。
【００１５】
一つの実施態様では、上記ペクチンリアーゼを作用させる工程が、５０℃から１０５℃の温度で行われる。
【００１６】
本発明はまた、バチラス属に属し、かつ至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、強酸のような比較的厳しい反応条件を使用することなく、植物材料からペクチンを効率良く製造することができる。また、本発明の耐熱性ペクチンリアーゼは、比較的高温側に至適反応温度を有するため、ペクチン製造における当該リアーゼの処理温度を低く抑える必要がない。そのため、ペクチン製造工程の管理が比較的容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
まず、本発明のペクチンリアーゼについて説明する。
【００２１】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、バチラス属に属する微生物に由来する。
【００２２】
このようなバチラス属に属する微生物は、至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する微生物であるか、あるいはバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する微生物である。
【００２３】
このような微生物の例としては、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３と命名された微生物が挙げられる。なお、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３は、１６ＳリボゾームＤＮＡ法により、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であることが確認されている。この微生物ＳＷＵ ＲＮ１３は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、平成１７年５月２６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８が付与されている。
【００２４】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、至適反応温度が、好ましくは６０℃以上、より好ましくは６０℃〜１０５℃、さらにより好ましくは６５℃〜１０５℃、またさらにより好ましくは７０℃〜８０℃である。さらに、当該ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、好ましくは、ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【００２５】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］はまた、後述する植物材料に作用させる際の反応系の至適反応ｐＨが７付近の場合、至適反応温度は８０℃であることが好ましく、あるいは後述する植物材料に作用させる際の反応系の至適反応ｐＨが８付近の場合、至適反応温度は７０℃であることが好ましい。
【００２６】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］はまた、広義のペクチン（すなわち、主にポリメチルガラクチュロン酸とポリガラクチュロン酸とで構成される酸多糖類）のうちポリメチルガラクチュロン酸に主に作用するものであり、より具体的には、ポリメチルガラクチュロン酸を構成する１つのメチルガラクチュロン酸ユニットと、それに隣接する他のメチルガラクチュロン酸ユニットとの間のα−１，４−結合を部分的に切断する能力を有する。また、本発明のペクチンリアーゼを用いて得られるペクチンは、酸処理法に比べ温和な条件で製造されるため、比較的高い分子量（例えば、１００，０００ｇ／モル以上）を保持している。
【００２７】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、例えば、上記バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８）から、当業者が通常用いる分離・精製手段で得ることができる。
【００２８】
なお、ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株は、以下の菌学的性質を有する（ＬＢ培地（培地組成：１％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％酵母エキス）上で３７℃で１日間培養した場合のコロニー形態を示す）：
直径：５ｍｍ
色調：クリーム色がかった白
形：円形
隆起状態：扁平状
周縁：不規則
表面の形状など：ラフ
透明度：不透明
粘稠度：バター様。
また、ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株がバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であることは、１６ＳリボゾームＤＮＡ法により確認した。
【００２９】
上記ペクチンリアーゼは、植物材料からペクチンを取り出すために使用される。したがって、上記ペクチンリアーゼを利用して、植物材料からペクチンを製造すること、あるいは植物材料からペクチンを除去することができる。上記ペクチンリアーゼを用いて植物材料からペクチンを製造する、あるいは除去するための方法について、以下に説明する。
【００３０】
本発明の方法においては、植物材料に、上記ペクチンリアーゼを作用させる。
【００３１】
本発明の方法に用いられる植物材料は、植物の全草であっても、あるいは植物の一部分であってもよい。このような植物部分としては、果実、根、茎、および葉が挙げられる。本発明の方法に用いられる植物材料は、ペクチンを含有する部位を含む限り、いかなる植物形態も使用可能である。さらに、本発明の方法に用いられる植物材料には、これらの全草または部位の抽出物（例えば、果汁も包含される）も包含される。本発明の方法に用いられる植物材料の形態は、未加工のもの、断片、細片または粉末のいずれをも包含する。さらに、本発明に用いられる植物材料は、乾燥物または生の状態のもののいずれをも包含する。未乾燥物、すなわち生の状態のものを用いることが好ましい。
【００３２】
本発明の方法に用いられる植物材料に適切な植物は、一般にペクチンを多く含有する植物、あるいは後述する精錬のような、ペクチンを含む基材が挙げられる。具体的な例としては、特にこれらに限定されないが、レモン、リンゴ、ミカン、バナナ、ブドウ、グレープフルーツ、アプリコット、サクランボ、スグリ、ナシ、ラズベリー、イチゴ、トマト、モモ、ならびにビードパルプ、綿および麻が挙げられる。ペクチンの製造を目的とする場合、レモンまたはリンゴが好ましく、例えば、ペクチン含量が多いとの理由からレモンの皮が特に好ましい。
【００３３】
本発明の方法においては、まず、上記植物材料と上記ペクチンリアーゼとを、例えば、緩衝液の存在下にて適宜混合する。植物材料に対する上記ペクチンリアーゼの量は、特に限定されないが、例えば、植物材料として５００ｇの乾燥レモンの皮を使用する場合、好ましくは５０ユニット〜１００，０００ユニットのペクチンリアーゼ、より好ましくは１００ユニット〜５０，０００ユニットのペクチンリアーゼ、さらにより好ましくは５００ユニット〜２５，０００ユニットのペクチンリアーゼが用いられる。使用するペクチンリアーゼの量が５０ユニットを下回ると、ペクチンを効率良く植物から取り出すことができない恐れがある。また、使用するペクチンリアーゼの量が１００，０００ユニットを上回っても、植物から取り出されるペクチンの量に変化はなく、むしろ植物材料に対するペクチンリアーゼの作用の効率を低下する恐れがある。なお、上記ペクチンリアーゼ１ユニット（Ｕ）とは、後述の実施例１に示す反応条件下で１分間に１μｍｏｌの４，５−不飽和ガラクチュロン酸を生成する酵素量として定義される。
【００３４】
本発明の方法においては、上記植物材料に対して上記ペクチンリアーゼを作用させる工程は、例えば、当業者に公知の加熱手段を用いることにより、好ましくは５０℃〜１０５℃、より好ましくは６０℃〜１０５℃、さらにより好ましくは６５℃〜１０５℃、またさらにより好ましくは７０℃〜８０℃の温度で行われる。
【００３５】
上記植物材料に対して上記ペクチンリアーゼを作用させる時間は、使用する植物材料および／またはペクチンリアーゼの量、反応温度などによって変動するため、必ずしも限定されないが、例えば、１時間〜２０時間であり、より好ましくは３時間〜１０時間である。
【００３６】
上記のように、植物材料にペクチンリアーゼを作用させた後、植物から取り出されたペクチンは、当業者に公知の手段により、分離・精製することができる。
【００３７】
このようにして、比較的分子量の高いペクチンを容易かつ効率的に製造することができる。
【００３８】
また、繊維加工分野においては、このようにして、綿、麻などの天然繊維を容易かつ効率的に精練することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００４０】
＜実施例１：ペクチンリアーゼの調製＞
大阪府立大学より分譲されたバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、平成１７年５月２６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８が付与された株）を、２００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩保存した。次いで、この培地を２リットルのＬＢ培地に移すとともに、シュガービートを添加して、４５℃でさらに４８時間培養した。培地を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍで１０分間）、その後、上清を集め、７０ｍｍの大きさのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製Ｎｏ．２）で濾過した。その後、最終濃度が８０ｗ／ｖ％となるように硫酸アンモニウムを添加し、撹拌して４℃で一晩放置した。次いで、この混合物を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、沈殿物を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、同様のリン酸緩衝液に対して４℃にて一晩かけて透析を行った。
【００４１】
その後、この混合物を、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製））にかけ、未吸着画分を得、これを限外濾過して濃縮した。濃縮物を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、同様のリン酸緩衝液に対して４℃にて一晩透析を行った。得られた溶液を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、さらに上清をカチオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ ＣＯＬＵＭＮ（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速３ｍｌ／分、液量１２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。吸着画分を集め、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）に対して４℃にて一晩透析を行った。
【００４２】
次いで、上記で得た画分を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＭＯＮＯ Ｓカラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速１ｍｌ／分、液量２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。次いで、酵素活性を示す画分に、最終濃度が３０ｗ／ｖ％となるように硫酸アンモニウムを添加した。得られた懸濁液を疎水クロマトグラフィー（フェニル−スパロース（ｐｈｅｎｙｌ−ｓｕｐｅｒｏｓｅ）カラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速０．５ｍｌ／分、液量２０ｍｌの３０ｗ／ｖ％〜０ｗ／ｖ％の硫酸アンモニウム水溶液のグラジエントを使用して行った。この酵素活性を示す画分を集め、さらに限外濾過にかけた後、ゲル濾過を行った（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、流速１ｍｌ／分）。さらに、ゲル濾過により得られた酵素活性を示す画分を、カチオン交換クロマトグラフィー（ＭＯＮＯ Ｓカラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速１ｍｌ／分、液量２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。酵素活性を示す画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、これらがほぼ均一であることを確認した（１０ｍｇ、１５ユニット／ｍｇ）。なお、精製工程中の酵素活性を、後述する４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成によりモニターした。得られた酵素画分の酵素的性質を評価し、その酵素的性質を表１にまとめて示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
上記精製工程で得られた酵素をＳＷＵ−ＲＮ１３と命名した。まず、このＳＷＵ−ＲＮ１３酵素がリアーゼ活性を有しているかを評価した。２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の、０．１％ポリメチルガラクチュロン酸（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ−９５６１）に酵素液（１ｍＵ）を添加して１０ｍｌとし、８０℃で反応させた。分光光度計で２３５ｎｍにおける時間毎の吸光度の増加を測定し、４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成をモニターした。図１に示すように、吸光度が時間経過に応じて増加しており、ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素はリアーゼ活性を有していることがわかった。
【００４５】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の基質特異性を評価するために、０％〜８６％の間の種々のメチル化度（０％、１０％、１６％、３１％、８６％）のポリメチルガラクチュロン酸を基質として用いたこと以外は上記と同様の組成の反応溶液を、８０℃で１０分間反応させ、上述と同様にして酵素活性を測定した。酵素活性をユニット／ｍｌとして示した。ここで、酵素１ユニット（Ｕ）とは、１分間に１μｍｏｌの４，５−不飽和ガラクチュロン酸を生成する酵素量として定義した。図２から、ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素が、ポリメチルガラクチュロン酸のメチル化度の上昇とともに活性が高くなることがわかった。
【００４６】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の至適ｐＨを調べるために、緩衝液のｐＨを１〜１１としたこと以外は、上記リアーゼ活性の測定に使用したものと同様の組成の反応溶液を８０℃で１５ 分間反応させた。なお、緩衝液としては、ｐＨ１〜３まではＮａ−酢酸−ＨＣｌ緩衝液を用い、ｐＨ４〜５まではＮａ−酢酸緩衝液を用い、ｐＨ６〜８まではＮａ−リン酸緩衝液を用い、そしてｐＨ９〜１１まではＮａ−炭酸緩衝液を使用した。上記と同様に、分光光度計で２３５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性を測定した。また、ＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ安定性を調べるために、上記酵素液を、上記各ｐＨで、４０℃で１６時間保持した後、上記と同様にして酵素活性を調べた。ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の活性および安定性についてのｐＨプロフィールおよび値を、図３および図４に示す。酵素活性の至適反応ｐＨは、８．０であった。そして酵素は、５．０〜８．０のｐＨ範囲で安定であった。
【００４７】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の至適温度を調べるために、上記リアーゼ活性の測定に使用したものと同様の酵素反応溶液を、ｐＨを７．０または８．０とし、４０〜１００℃の間の種々の一定温度で、１０分間反応させ、上記と同様に酵素活性を測定した。また、酵素の熱的安定性を調べるために、上記酵素反応溶液を、ｐＨ７．０で、上記の各温度で１時間保持した後、上記と同様にして酵素活性を調べた。ｐＨ７．０および８．０における酵素活性、およびｐＨ７．０での熱的安定性について温度のプロフィールをそれぞれ、図５、図６および図７に示す。至適反応温度は、ｐＨ８．０で７０℃であり、そしてｐＨ７．０で８０℃であった。また、この酵素の活性は、３０〜６０℃の温度の場合、ｐＨ７．０で１時間保持した後もなお顕著には損なわれなかった。
【００４８】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の各金属イオンによる酵素活性に対する影響を検討した。２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の、０．１％ポリメチルガラクチュロン酸（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ−９５６１）に、表２に示す種々の金属イオン溶液（最終濃度１ｍＭ）と酵素液（１ｍＵ）を添加して０．２ｍｌとし、８０℃で１０分間反応させ、上記と同様に酵素活性を測定した。金属イオンを添加しない場合およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（最終濃度１ｍＭ）を添加した場合を、それぞれコントロールとして同様に測定した。この結果を図８および表２に示す。ＳＷＵ−ＲＮ１３の酵素活性は、Ｃａ２＋およびＣｄ２＋で上昇したが、Ｈｇ２＋およびＦｅ３＋で非常に阻害された。
【００４９】
【表２】
【００５０】
＜実施例２：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
１４質量％の固形分を含む新鮮なレモンの皮（１０００ｇ）を冷凍し、自然解凍した。これに、１リットルのリン酸緩衝液（２０ｍｌ、ｐＨ７）および実施例１で得られたペクチンリアーゼ５００ユニットを添加し、５０℃にて５時間反応させた。
【００５１】
その後、不溶物をフィルター（アドバンテック社製Ｎｏ．６）で濾過し、水溶性画分を得た。この水溶性画分に３リットルのエタノールを添加し、沈殿物を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により得た。沈殿物を５０℃にて減圧乾燥して、１．０ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５２】
＜実施例３：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
レモンの皮とペクチンリアーゼとの反応に付与した温度を６０℃としたこと以外は、実施例２と同様にして１８ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５３】
＜実施例４：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
レモンの皮とペクチンリアーゼとの反応に付与した温度を７０℃としたこと以外は、実施例２と同様にして１５ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５４】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の耐熱性ペクチンリアーゼは、例えば、増粘多糖剤またはゲル化剤として広く用いられるペクチンの製造に有用である。本発明により製造されたペクチンは、食品加工分野、精錬などの繊維加工分野、紙・パルプ加工分野、およびバイオマス分解のような広範な技術分野に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３による４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成の経時変化を示すグラフである。
【図２】ｐＨ７．０かつ７０℃におけるメチル化されたＰＧＡについての、ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の基質特異性を示すグラフである。
【図３】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の至適反応ｐＨを示すグラフである。
【図４】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３について、４０℃で１６時間経過した後のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図５】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ７．０での至適反応温度を示すグラフである。
【図６】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ８．０での至適反応温度を示すグラフである。
【図７】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ７．０での熱的安定性を示すグラフである。
【図８】各金属イオンに対するペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の酵素活性の影響を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物由来のペクチンリアーゼに関する。より詳細には、高温側に至適反応温度を有し、かつ高分子のポリメチルガラクチュロン酸および／またはポリガラクチュロン酸を含有するペクチンを効率良く製造し得る、耐熱性ペクチンリアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは、植物体の非木質化組織に多く含まれる酸性多糖であり、広義には、主にポリメチルガラクチュロン酸（狭義にはペクチンといわれることもある）と、その一部が脱メチルエステル化されたポリガラクチュロン酸（狭義にはペクチン酸と言われることもある）とで構成される。このようなペクチンは、例えば、増粘多糖剤またはゲル化剤として広く用いられている。
【０００３】
ペクチンは、レモンの皮、リンゴのような植物体に多く含まれており、木質化組織間を結合するための物質として知られている。また、その単離にあたっては、種々の方法が用いられている。例えば、従来では、当該植物体に塩酸または硝酸のような強酸を作用させることにより、木質化組織を構成するセルロース鎖との間の結合を切断して、ペクチンを取り出す方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような方法では、上記強酸を用いて６０℃〜８０℃の比較的高温条件下にて数十分から数時間処理する必要がある。このような厳しい条件での処理を要するので、高分子量のペクチンを製造するための工程管理は難しい。また、このような強酸の使用は、セルロース鎖とペクチンとの間の結合だけでなく、ペクチン自体の結合も部分的に切断することがあり、得られるペクチンは比較的低分子となる傾向にある。このため、得られたペクチンは、充分な粘性を得るために必要な高い分子量（例えば、１００，０００ｇ／モル以上）を達成することが困難であるという問題があった。
【０００５】
他方、このような強酸の使用を回避するために、ペクチンリアーゼおよび当該リアーゼ活性を有する微生物の使用も検討されている。
【０００６】
従来、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］活性を有する微生物由来の酵素として、糸状菌および細菌由来の酵素が知られている。しかし、従来のペクチンリアーゼは６０℃以上の反応温度での活性が著しく低いため、実際の用途は果汁の清澄化などに限定されている。
【０００７】
繊維加工分野においても、綿などの天然繊維を精錬する際に、セルロース鎖からペクチンを除去することが重要とされている。従来の精練は、一般に、高温下で水酸化ナトリウムが使用されていた。これに対し、現在、ペクチン酸リアーゼ［ＥＣ４．２．２．２］、ペクチンエステラーゼ［ＥＣ３．１．１．１１］などの酵素を利用したバイオ精錬法が行われている（例えば、特許文献２〜５参照）。しかし、これらのバイオ精錬で使用される酵素は、いずれもポリガラクチュロン酸（ペクチン酸）のみに作用し、ポリメチルガラクチュロン酸に作用するものではない。そのため、さらに精錬効率を高めるための技術が所望されている。
【特許文献１】特開平８−４８７０２号公報
【特許文献２】特開２００４−１４１０８１号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５７１号公報
【特許文献４】特開２００３−１８０３６４号公報
【特許文献５】特開２００２−８５０７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、植物材料から広義のペクチンを製造するにあたり、強酸のような比較的厳しい反応条件を使用することなく、かつ比較的高温条件において、高分子量のペクチンをより簡易にかつ効率良く製造することができる耐熱性ペクチンリアーゼおよびそれを用いたペクチンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を提供する。
【００１０】
一つの実施態様では、上記至適反応温度は６０℃から１０５℃である。
【００１１】
別の実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、下記の性質を有する：
（１）至適反応温度が７０℃から８０℃であり；そして
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【００１２】
また、別の実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、ｐＨ７の至適反応温度が８０℃である。
【００１３】
異なる実施態様では、上記ペクチンリアーゼは、ｐＨ８の至適反応温度が７０℃である。
【００１４】
本発明はまた、植物材料に、上記ペクチンリアーゼを作用させる工程を包含する、ペクチンの製造方法を提供する。
【００１５】
一つの実施態様では、上記ペクチンリアーゼを作用させる工程が、５０℃から１０５℃の温度で行われる。
【００１６】
本発明はまた、バチラス属に属し、かつ至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、強酸のような比較的厳しい反応条件を使用することなく、植物材料からペクチンを効率良く製造することができる。また、本発明の耐熱性ペクチンリアーゼは、比較的高温側に至適反応温度を有するため、ペクチン製造における当該リアーゼの処理温度を低く抑える必要がない。そのため、ペクチン製造工程の管理が比較的容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
まず、本発明のペクチンリアーゼについて説明する。
【００２１】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、バチラス属に属する微生物に由来する。
【００２２】
このようなバチラス属に属する微生物は、至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する微生物であるか、あるいはバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する微生物である。
【００２３】
このような微生物の例としては、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３と命名された微生物が挙げられる。なお、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３は、１６ＳリボゾームＤＮＡ法により、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であることが確認されている。この微生物ＳＷＵ ＲＮ１３は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、平成１７年５月２６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８が付与されている。
【００２４】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、至適反応温度が、好ましくは６０℃以上、より好ましくは６０℃〜１０５℃、さらにより好ましくは６５℃〜１０５℃、またさらにより好ましくは７０℃〜８０℃である。さらに、当該ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、好ましくは、ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【００２５】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］はまた、後述する植物材料に作用させる際の反応系の至適反応ｐＨが７付近の場合、至適反応温度は８０℃であることが好ましく、あるいは後述する植物材料に作用させる際の反応系の至適反応ｐＨが８付近の場合、至適反応温度は７０℃であることが好ましい。
【００２６】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］はまた、広義のペクチン（すなわち、主にポリメチルガラクチュロン酸とポリガラクチュロン酸とで構成される酸多糖類）のうちポリメチルガラクチュロン酸に主に作用するものであり、より具体的には、ポリメチルガラクチュロン酸を構成する１つのメチルガラクチュロン酸ユニットと、それに隣接する他のメチルガラクチュロン酸ユニットとの間のα−１，４−結合を部分的に切断する能力を有する。また、本発明のペクチンリアーゼを用いて得られるペクチンは、酸処理法に比べ温和な条件で製造されるため、比較的高い分子量（例えば、１００，０００ｇ／モル以上）を保持している。
【００２７】
本発明のペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］は、例えば、上記バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８）から、当業者が通常用いる分離・精製手段で得ることができる。
【００２８】
なお、ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株は、以下の菌学的性質を有する（ＬＢ培地（培地組成：１％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％酵母エキス）上で３７℃で１日間培養した場合のコロニー形態を示す）：
直径：５ｍｍ
色調：クリーム色がかった白
形：円形
隆起状態：扁平状
周縁：不規則
表面の形状など：ラフ
透明度：不透明
粘稠度：バター様。
また、ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株がバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であることは、１６ＳリボゾームＤＮＡ法により確認した。
【００２９】
上記ペクチンリアーゼは、植物材料からペクチンを取り出すために使用される。したがって、上記ペクチンリアーゼを利用して、植物材料からペクチンを製造すること、あるいは植物材料からペクチンを除去することができる。上記ペクチンリアーゼを用いて植物材料からペクチンを製造する、あるいは除去するための方法について、以下に説明する。
【００３０】
本発明の方法においては、植物材料に、上記ペクチンリアーゼを作用させる。
【００３１】
本発明の方法に用いられる植物材料は、植物の全草であっても、あるいは植物の一部分であってもよい。このような植物部分としては、果実、根、茎、および葉が挙げられる。本発明の方法に用いられる植物材料は、ペクチンを含有する部位を含む限り、いかなる植物形態も使用可能である。さらに、本発明の方法に用いられる植物材料には、これらの全草または部位の抽出物（例えば、果汁も包含される）も包含される。本発明の方法に用いられる植物材料の形態は、未加工のもの、断片、細片または粉末のいずれをも包含する。さらに、本発明に用いられる植物材料は、乾燥物または生の状態のもののいずれをも包含する。未乾燥物、すなわち生の状態のものを用いることが好ましい。
【００３２】
本発明の方法に用いられる植物材料に適切な植物は、一般にペクチンを多く含有する植物、あるいは後述する精錬のような、ペクチンを含む基材が挙げられる。具体的な例としては、特にこれらに限定されないが、レモン、リンゴ、ミカン、バナナ、ブドウ、グレープフルーツ、アプリコット、サクランボ、スグリ、ナシ、ラズベリー、イチゴ、トマト、モモ、ならびにビードパルプ、綿および麻が挙げられる。ペクチンの製造を目的とする場合、レモンまたはリンゴが好ましく、例えば、ペクチン含量が多いとの理由からレモンの皮が特に好ましい。
【００３３】
本発明の方法においては、まず、上記植物材料と上記ペクチンリアーゼとを、例えば、緩衝液の存在下にて適宜混合する。植物材料に対する上記ペクチンリアーゼの量は、特に限定されないが、例えば、植物材料として５００ｇの乾燥レモンの皮を使用する場合、好ましくは５０ユニット〜１００，０００ユニットのペクチンリアーゼ、より好ましくは１００ユニット〜５０，０００ユニットのペクチンリアーゼ、さらにより好ましくは５００ユニット〜２５，０００ユニットのペクチンリアーゼが用いられる。使用するペクチンリアーゼの量が５０ユニットを下回ると、ペクチンを効率良く植物から取り出すことができない恐れがある。また、使用するペクチンリアーゼの量が１００，０００ユニットを上回っても、植物から取り出されるペクチンの量に変化はなく、むしろ植物材料に対するペクチンリアーゼの作用の効率を低下する恐れがある。なお、上記ペクチンリアーゼ１ユニット（Ｕ）とは、後述の実施例１に示す反応条件下で１分間に１μｍｏｌの４，５−不飽和ガラクチュロン酸を生成する酵素量として定義される。
【００３４】
本発明の方法においては、上記植物材料に対して上記ペクチンリアーゼを作用させる工程は、例えば、当業者に公知の加熱手段を用いることにより、好ましくは５０℃〜１０５℃、より好ましくは６０℃〜１０５℃、さらにより好ましくは６５℃〜１０５℃、またさらにより好ましくは７０℃〜８０℃の温度で行われる。
【００３５】
上記植物材料に対して上記ペクチンリアーゼを作用させる時間は、使用する植物材料および／またはペクチンリアーゼの量、反応温度などによって変動するため、必ずしも限定されないが、例えば、１時間〜２０時間であり、より好ましくは３時間〜１０時間である。
【００３６】
上記のように、植物材料にペクチンリアーゼを作用させた後、植物から取り出されたペクチンは、当業者に公知の手段により、分離・精製することができる。
【００３７】
このようにして、比較的分子量の高いペクチンを容易かつ効率的に製造することができる。
【００３８】
また、繊維加工分野においては、このようにして、綿、麻などの天然繊維を容易かつ効率的に精練することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００４０】
＜実施例１：ペクチンリアーゼの調製＞
大阪府立大学より分譲されたバチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＷＵ ＲＮ１３（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、平成１７年５月２６日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８が付与された株）を、２００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩保存した。次いで、この培地を２リットルのＬＢ培地に移すとともに、シュガービートを添加して、４５℃でさらに４８時間培養した。培地を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍで１０分間）、その後、上清を集め、７０ｍｍの大きさのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製Ｎｏ．２）で濾過した。その後、最終濃度が８０ｗ／ｖ％となるように硫酸アンモニウムを添加し、撹拌して４℃で一晩放置した。次いで、この混合物を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、沈殿物を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、同様のリン酸緩衝液に対して４℃にて一晩かけて透析を行った。
【００４１】
その後、この混合物を、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製））にかけ、未吸着画分を得、これを限外濾過して濃縮した。濃縮物を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、同様のリン酸緩衝液に対して４℃にて一晩透析を行った。得られた溶液を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、さらに上清をカチオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ ＣＯＬＵＭＮ（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速３ｍｌ／分、液量１２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。吸着画分を集め、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）に対して４℃にて一晩透析を行った。
【００４２】
次いで、上記で得た画分を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＭＯＮＯ Ｓカラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速１ｍｌ／分、液量２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。次いで、酵素活性を示す画分に、最終濃度が３０ｗ／ｖ％となるように硫酸アンモニウムを添加した。得られた懸濁液を疎水クロマトグラフィー（フェニル−スパロース（ｐｈｅｎｙｌ−ｓｕｐｅｒｏｓｅ）カラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速０．５ｍｌ／分、液量２０ｍｌの３０ｗ／ｖ％〜０ｗ／ｖ％の硫酸アンモニウム水溶液のグラジエントを使用して行った。この酵素活性を示す画分を集め、さらに限外濾過にかけた後、ゲル濾過を行った（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、流速１ｍｌ／分）。さらに、ゲル濾過により得られた酵素活性を示す画分を、カチオン交換クロマトグラフィー（ＭＯＮＯ Ｓカラム（アマシャムバイオサイエンス社製））にかけた。溶出は、流速１ｍｌ／分、液量２０ｍｌの０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを使用して行った。酵素活性を示す画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、これらがほぼ均一であることを確認した（１０ｍｇ、１５ユニット／ｍｇ）。なお、精製工程中の酵素活性を、後述する４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成によりモニターした。得られた酵素画分の酵素的性質を評価し、その酵素的性質を表１にまとめて示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
上記精製工程で得られた酵素をＳＷＵ−ＲＮ１３と命名した。まず、このＳＷＵ−ＲＮ１３酵素がリアーゼ活性を有しているかを評価した。２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の、０．１％ポリメチルガラクチュロン酸（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ−９５６１）に酵素液（１ｍＵ）を添加して１０ｍｌとし、８０℃で反応させた。分光光度計で２３５ｎｍにおける時間毎の吸光度の増加を測定し、４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成をモニターした。図１に示すように、吸光度が時間経過に応じて増加しており、ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素はリアーゼ活性を有していることがわかった。
【００４５】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の基質特異性を評価するために、０％〜８６％の間の種々のメチル化度（０％、１０％、１６％、３１％、８６％）のポリメチルガラクチュロン酸を基質として用いたこと以外は上記と同様の組成の反応溶液を、８０℃で１０分間反応させ、上述と同様にして酵素活性を測定した。酵素活性をユニット／ｍｌとして示した。ここで、酵素１ユニット（Ｕ）とは、１分間に１μｍｏｌの４，５−不飽和ガラクチュロン酸を生成する酵素量として定義した。図２から、ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素が、ポリメチルガラクチュロン酸のメチル化度の上昇とともに活性が高くなることがわかった。
【００４６】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の至適ｐＨを調べるために、緩衝液のｐＨを１〜１１としたこと以外は、上記リアーゼ活性の測定に使用したものと同様の組成の反応溶液を８０℃で１５ 分間反応させた。なお、緩衝液としては、ｐＨ１〜３まではＮａ−酢酸−ＨＣｌ緩衝液を用い、ｐＨ４〜５まではＮａ−酢酸緩衝液を用い、ｐＨ６〜８まではＮａ−リン酸緩衝液を用い、そしてｐＨ９〜１１まではＮａ−炭酸緩衝液を使用した。上記と同様に、分光光度計で２３５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性を測定した。また、ＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ安定性を調べるために、上記酵素液を、上記各ｐＨで、４０℃で１６時間保持した後、上記と同様にして酵素活性を調べた。ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の活性および安定性についてのｐＨプロフィールおよび値を、図３および図４に示す。酵素活性の至適反応ｐＨは、８．０であった。そして酵素は、５．０〜８．０のｐＨ範囲で安定であった。
【００４７】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の至適温度を調べるために、上記リアーゼ活性の測定に使用したものと同様の酵素反応溶液を、ｐＨを７．０または８．０とし、４０〜１００℃の間の種々の一定温度で、１０分間反応させ、上記と同様に酵素活性を測定した。また、酵素の熱的安定性を調べるために、上記酵素反応溶液を、ｐＨ７．０で、上記の各温度で１時間保持した後、上記と同様にして酵素活性を調べた。ｐＨ７．０および８．０における酵素活性、およびｐＨ７．０での熱的安定性について温度のプロフィールをそれぞれ、図５、図６および図７に示す。至適反応温度は、ｐＨ８．０で７０℃であり、そしてｐＨ７．０で８０℃であった。また、この酵素の活性は、３０〜６０℃の温度の場合、ｐＨ７．０で１時間保持した後もなお顕著には損なわれなかった。
【００４８】
ＳＷＵ−ＲＮ１３酵素の各金属イオンによる酵素活性に対する影響を検討した。２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の、０．１％ポリメチルガラクチュロン酸（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ−９５６１）に、表２に示す種々の金属イオン溶液（最終濃度１ｍＭ）と酵素液（１ｍＵ）を添加して０．２ｍｌとし、８０℃で１０分間反応させ、上記と同様に酵素活性を測定した。金属イオンを添加しない場合およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（最終濃度１ｍＭ）を添加した場合を、それぞれコントロールとして同様に測定した。この結果を図８および表２に示す。ＳＷＵ−ＲＮ１３の酵素活性は、Ｃａ２＋およびＣｄ２＋で上昇したが、Ｈｇ２＋およびＦｅ３＋で非常に阻害された。
【００４９】
【表２】
【００５０】
＜実施例２：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
１４質量％の固形分を含む新鮮なレモンの皮（１０００ｇ）を冷凍し、自然解凍した。これに、１リットルのリン酸緩衝液（２０ｍｌ、ｐＨ７）および実施例１で得られたペクチンリアーゼ５００ユニットを添加し、５０℃にて５時間反応させた。
【００５１】
その後、不溶物をフィルター（アドバンテック社製Ｎｏ．６）で濾過し、水溶性画分を得た。この水溶性画分に３リットルのエタノールを添加し、沈殿物を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により得た。沈殿物を５０℃にて減圧乾燥して、１．０ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５２】
＜実施例３：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
レモンの皮とペクチンリアーゼとの反応に付与した温度を６０℃としたこと以外は、実施例２と同様にして１８ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５３】
＜実施例４：ペクチンリアーゼを用いたペクチンの製造＞
レモンの皮とペクチンリアーゼとの反応に付与した温度を７０℃としたこと以外は、実施例２と同様にして１５ｇのペクチンを得た。使用したレモンの皮（固形分）と得られたペクチン量との関係を表３に示す。
【００５４】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の耐熱性ペクチンリアーゼは、例えば、増粘多糖剤またはゲル化剤として広く用いられるペクチンの製造に有用である。本発明により製造されたペクチンは、食品加工分野、精錬などの繊維加工分野、紙・パルプ加工分野、およびバイオマス分解のような広範な技術分野に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３による４，５−不飽和ガラクチュロン酸の生成の経時変化を示すグラフである。
【図２】ｐＨ７．０かつ７０℃におけるメチル化されたＰＧＡについての、ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の基質特異性を示すグラフである。
【図３】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の至適反応ｐＨを示すグラフである。
【図４】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３について、４０℃で１６時間経過した後のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図５】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ７．０での至適反応温度を示すグラフである。
【図６】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ８．０での至適反応温度を示すグラフである。
【図７】ペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３のｐＨ７．０での熱的安定性を示すグラフである。
【図８】各金属イオンに対するペクチンリアーゼＳＷＵ−ＲＮ１３の酵素活性の影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］。
【請求項２】
前記至適反応温度が６０℃から１０５℃である、請求項１に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項３】
下記の性質を有する、請求項１または２に記載のペクチンリアーゼ：
（１）至適反応温度が７０℃から８０℃であり；そして
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【請求項４】
ｐＨ７での至適反応温度が８０℃である、請求項３に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項５】
ｐＨ８での至適反応温度が７０℃である、請求項３に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項６】
植物材料に、請求項１から５のいずれかに記載のペクチンリアーゼを作用させる工程を包含する、ペクチンの製造方法。
【請求項７】
前記ペクチンリアーゼを作用させる工程が、５０℃から１０５℃の温度で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
バチラス属に属し、かつ至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物。
【請求項９】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物。
【請求項１０】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株。
【請求項１】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、かつ至適反応温度が６０℃以上である、ペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］。
【請求項２】
前記至適反応温度が６０℃から１０５℃である、請求項１に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項３】
下記の性質を有する、請求項１または２に記載のペクチンリアーゼ：
（１）至適反応温度が７０℃から８０℃であり；そして
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分子量が３３，０００Ｄａである。
【請求項４】
ｐＨ７での至適反応温度が８０℃である、請求項３に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項５】
ｐＨ８での至適反応温度が７０℃である、請求項３に記載のペクチンリアーゼ。
【請求項６】
植物材料に、請求項１から５のいずれかに記載のペクチンリアーゼを作用させる工程を包含する、ペクチンの製造方法。
【請求項７】
前記ペクチンリアーゼを作用させる工程が、５０℃から１０５℃の温度で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
バチラス属に属し、かつ至適反応温度が６０℃から１０５℃であるペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物。
【請求項９】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属し、かつペクチンリアーゼ［ＥＣ４．２．２．１０］を産生し得る能力を有する、微生物。
【請求項１０】
バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４８株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１４９３７４（Ｐ２００６−１４９３７４Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８２６１０（Ｐ２００５−２８２６１０）
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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