骨吸収阻害剤
【課題】破骨細胞分化に関与する因子を新たに同定し、その因子を利用することにより骨粗鬆症や慢性関節リウマチなど破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤等を提供すること。
【解決手段】プレイオトロフィンが破骨細胞分化を抑制および／または阻害するという知見に基づき、プレイオトロフィンを含む骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含む破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含む破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤、プレイオトロフィンを用いた破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法などが提供される。
【解決手段】プレイオトロフィンが破骨細胞分化を抑制および／または阻害するという知見に基づき、プレイオトロフィンを含む骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含む破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含む破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤、プレイオトロフィンを用いた破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法などが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）が破骨細胞分化を抑制および／または阻害するという知見に基づく、プレイオトロフィンを含有する骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含有する破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含有する破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤、あるいは、プレイオトロフィンを用いた破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防方法および／または治療方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、新規な破骨細胞分化抑制因子および／または阻害因子の同定におけるプレイオトロフィンの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨は、密度の高い、特殊化した形の結合組織であるが、永久不変の組織ではない。骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収により、その形を変えることなく、新しい骨に置換される。骨のマトリクス表面に存在する骨芽細胞は、オステオイドと呼ばれるマトリクスを分泌し、オステオイドの石灰化とともに骨細胞に変化し、骨を形成する。破骨細胞は、大きな多核細胞で、マクロファージと同様に骨髄の造血幹細胞に由来する。破骨細胞は、骨芽細胞と同様に骨のマトリクス上に存在し、マトリクスを溶かす作用がある。
【０００４】
骨形成と骨吸収のバランスがくずれると、様々な疾患が引き起こされる。例えば、不十分な骨形成は、骨折や骨が欠損した場合の回復の遅延につながる。また、骨粗鬆症や慢性関節リウマチは、破骨細胞が増勢して骨吸収が過剰になることが原因のひとつになっている。
【０００５】
骨形成および／または骨吸収には種々の因子が関与することが知られている。骨破壊に関連する因子としては、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる作用を有するＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＲＡＮＫＬの受容体であるＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ（ＲＡＮＫ）が挙げられる（非特許文献１および非特許文献２）。ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫによる破骨細胞分化には、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ（ＮＦ−κＢ）活性化シグナル経路またはＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ｃ−Ｆｏｓ／ＮＦＡＴｃ）活性化シグナル経路が関与することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
近年、神経細胞の伸長に作用するタンパク質として知られているプレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）（非特許文献４）が、骨形成に関与することが報告された（非特許文献５）。ＰＴＮは、ラットの脳で最初に同定された１６８アミノ酸残基からなるヘパリン結合型の増殖因子である（非特許文献６）。ＰＴＮは、１６８アミノ酸残基からなる前駆体として生成され、３２アミノ酸残基が除かれて、１３６アミノ酸残基の活性化型タンパク質として細胞外に放出される。骨芽細胞刺激因子１（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１）としても知られるＰＴＮは、骨芽細胞の遊走性、分化、コロニー形成、アルカリフォスファターゼ産生を促進することが報告されている（非特許文献５）。最近では、ＰＴＮが単独で内因性の組織による骨または軟骨組織の修復を促進することが報告されている（特許文献１）。ＰＴＮは、神経細胞の伸長および骨形成の他にも血管新生等に関与することが知られている（非特許文献７）が、ＰＴＮが骨破壊に関与することは知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１２２７９９
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５９７−３６０２（１９９８）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５４０−３５４５（１９９９）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ ４２８：７５８−７６３（２００４）
【非特許文献４】Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９３（１９９２）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６７２１−４．（１９９０）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３２：１１４６−１１５３（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
破骨細胞分化の機構の解明は、骨粗鬆症や慢性関節リウマチ等の破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法の開発につながるが、その機構はまだ十分に明らかにされているとはいえない。破骨細胞分化の詳細な機構を解明すること、特に、破骨細胞分化に関与する因子を新たに同定し、その因子を利用して破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法を開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、骨芽細胞に発現し骨形成に関与することが知られているＰＴＮが骨吸収に及ぼす影響を調べたところ、驚くべきことに、ＲＡＮＫＬによる破骨前駆細胞から破骨細胞への分化をＰＴＮが抑制および／または阻害することを見出した。本発明者は、この知見に基づき、ＰＴＮを骨吸収の抑制剤および／または阻害剤として利用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
［２］プレイオトロフィンを含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
［３］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［４］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［５］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［６］プレイオトロフィンを含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［７］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［８］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［９］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［１０］プレイオトロフィンを含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［１１］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１２］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１３］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
［１４］プレイオトロフィンを含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
［１５］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１６］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１７］破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症である、［１３］〜［１６］のいずれか１つに記載の予防剤および／または治療剤。
［１８］次の（１）〜（３）の工程を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法：
（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に破骨細胞誘導物質を添加する工程；
（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；および
（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程。
［１９］破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を、細胞のＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性によって判断する、［１８］に記載の方法。
［２０］破骨前駆細胞が株化細胞である、［１８］または［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２１］破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）である、［２０］に記載の方法。
［２２］破骨前駆細胞が初代培養細胞である、［１８］または［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）である、［２２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、骨粗鬆症や慢性関節リウマチ等の破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法が提供される。具体的には、本発明によって、ＰＴＮおよび／またはＰＴＮ誘導体を含む破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤、あるいは、ＰＴＮおよび／またはＰＴＮ誘導体を用いた破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書で用いる用語について説明する。
【００１３】
本明細書において、単離したＤＮＡ、合成のＤＮＡ、単離したポリヌクレオチド、または合成のポリヌクレオチドを総称して「ＤＮＡ」と称し、単離したタンパク質、合成のタンパク質、単離したポリペプチド、または合成のポリペプチドを総称して「タンパク質」と称する。
【００１４】
本明細書において「プレイオトロフィン」、「ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ」、または「ＰＴＮ」とは、天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質、プレイオトロフィンをコードするＤＮＡにより生成される組換えプレイオトロフィンタンパク質、またはプレイオトロフィンタンパク質のフラグメントをいう。天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質としては、例えば、マウス、ヒト、ラット等の動物から精製されるプレイオトロフィンが挙げられる。天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質には、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）と呼ばれる変異を起したプレイオトロフィンＤＮＡによってコードされるタンパク質を含む。組換えプレイオトロフィンタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１５】
ＰＴＮのＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡであり得る。ＰＴＮのＤＮＡは、１５５８塩基からなり、翻訳されて１６８アミノ酸（配列表の配列番号２）のタンパク質をコードする。
【００１６】
ＰＴＮのＤＮＡは、当業者に公知の遺伝子工学的手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）によって容易に得ることができる。ＰＴＮのＤＮＡは、例えば、実施例に記載されるように、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の配列情報をもとにプライマーを設計し、ＰＴＮを発現している組織または細胞由来のｃＤＮＡライブラリー等を鋳型としたＰＣＲによって得ることができる。プライマーの設計、鋳型、およびＰＣＲ条件は、当業者によって適宜選択され得る。好ましくは、プライマーは、１５〜３０個、より好ましくは２０個〜２５個のヌクレオチドからなる。ＰＣＲによって得られたＰＴＮのＤＮＡは、当業者に公知の方法を用いてクローニングされ得る。クローニングされたＰＴＮのＤＮＡは、適切な発現ベクターに組み込まれ、ＰＴＮタンパク質の取得に用いられ得る。
【００１７】
ＰＴＮのタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり得る。ＰＴＮは、細胞外への分泌に必要なシグナル配列を含むＮ末端領域と、ヘパリン結合部位を含むＣ末端領域から構成される。Ｎ末端領域は、配列表の配列番号２の第１番目〜第９６番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第３６４番目〜第６５１番目の塩基配列に相当）で構成され、Ｃ末端領域は、配列表の配列番号２の第９７番目〜第１６８番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第６５２番目〜第８６７番目の塩基配列に相当）で構成される。細胞外への分泌に必要なシグナル配列は、配列表の配列番号２の第１番目〜第３２番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第３６４番目〜第４５９番目の塩基配列に相当）で構成され、ヘパリン結合部位は、配列表の配列番号２の第１０２番目〜第１４２番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第６６７番目〜第７８９番目の塩基配列に相当）の範囲に含まれる３か所のドメインから構成される。ＰＴＮは、１６８アミノ酸残基からなる前駆体として生成され、プロセシングによりＮ末端ドメイン中の３２アミノ酸残基からなるシグナル配列が除かれ、成熟タンパク質となる。ＰＴＮは血管新生や細胞増殖等に関与するミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ）（ＭＫ）と約５０％のアミノ酸配列の相同性を有する（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３））。
【００１８】
ＰＴＮのタンパク質は、当業者に公知の遺伝子工学的手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）によって容易に得ることができる。ＰＴＮのタンパク質は、例えば、実施例に記載されるように、ＰＴＮのＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このＰＴＮ発現ベクターを宿主（例えば、細胞）に導入し、その宿主自体またはその培養上清等から回収することによって得ることができる。
【００１９】
ＰＴＮのＤＮＡを組み込む発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的に応じて適宜選択され得る。ＰＴＮタンパク質を細胞で発現させて培養上清から回収する場合、回収率を上げるために、ＰＴＮの細胞外への分泌を促進するような配列（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ鎖をコードするＤＮＡ）をＰＴＮのＤＮＡの前または後ろに組み込んだＰＴＮ発現ベクターを用いることができる。
【００２０】
宿主としては、原核生物であっても真核生物であってもよい。原核生物としては、例えば、大腸菌が挙げられる。真核生物としては、例えば、酵母、昆虫、ヒト、マウス、ラット、またはサル由来の細胞が挙げられ、ヒト、マウス、ラット、またはサル由来の細胞が好ましい。
【００２１】
ＰＴＮのＤＮＡを組み込んだＰＴＮ発現ベクターは、当業者に公知の手段によって宿主に導入され得る。導入した遺伝子の細胞での発現は、核外遺伝子を利用する自律複製系を利用するものであってもよいし、遺伝子発現の安定性を考慮して染色体内へＰＴＮのＤＮＡをインテグレートするものであってもよい。簡便には、自律複製系が好ましい。
【００２２】
ＰＴＮタンパク質の宿主からの回収方法は、当業者に公知の方法に従い、細胞自体または細胞の培養上清から回収し得る。ＰＴＮタンパク質は、例えば、実施例に記載されるように、培養上清への分泌を促進する配列を連結したＰＴＮ発現ベクターを用いる場合、ＰＴＮ発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＰＴＮ画分として回収することができる。回収したＰＴＮ画分は、当業者に公知の方法、例えば、ＰＴＮに特異的な抗体を用いて精製することができる。
【００２３】
ＰＴＮは、受容体を介して様々な生体機能に関与することが報告されている。ＰＴＮは、約５０％のアミノ酸配列の相同性を有するＭＫと共通の受容体を介することが報告されている。このような受容体としては、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種である受容体型プロテインチロシンホスファターゼζ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｐｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ζ）（ＰＴＰζ）が挙げられる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２４７４−１２４７９（１９９９））。ＭＫは神経細胞の細胞移動のシグナルを活性化し、ＰＴＮにも同様の作用を有することが示唆された。また、ＰＴＮは、ＰＴＰζのタンパク質部分に結合し、β−カテニンを経由して細胞運動を調節することが報告されている（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９：３７７−３８７（２０００））。
【００２４】
ＰＴＮに対する別の受容体としては、Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋｉｎａｓｅ（ＡＬＫ）が挙げられる。ＡＬＫもまた、ＰＴＮおよびＭＫに共通する受容体であることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６７７２−１６７７９（２００１））。ＡＬＫは、ＰＴＮに対する受容体としてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＰＴＮはＡＬＫとその下流因子であるＩＲＳ−１、Ｓｈｃ、ホスホリパーゼＣ−γ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ−γ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化する。また、ＰＴＮが増殖促進を引き起こす株はＡＬＫも連動して発現していることから、ＰＴＮが細胞増殖シグナルに関与することが示唆された。
【００２５】
ＰＴＮに対する別の受容体としては、Ｎ−シンデカン（Ｎ−ｓｙｎｄｅｃａｎ）が挙げられる。Ｎ−シンデカンもまた、ＰＴＮおよびＭＫに共通する受容体であり、ＰＴＮおよびＭＫは、固相アッセイにおいて、ヘパラン硫酸に依存してシンデカン−１に結合する（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９：３７７−３８７（２０００））。また、ＰＴＮは、神経細胞や骨芽様細胞において表面受容体Ｎ−シンデカンの糖鎖に結合し、細胞膜の直下に存在するＣＡＳＫ−コルタクチン（ＣＡＳＫ−ｃｏｒｔａｃｔｉｎ）複合体を介してｓｒｃ−ファミリーキナーゼ（ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅ）を活性化し、細胞運動性を調節する細胞骨格を制御するシグナルを発生させることが報告されている。
【００２６】
本明細書において「プレイオトロフィン誘導体」または「ＰＴＮ誘導体」とは、ＰＴＮの塩基配列に類似する塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはＰＴＮのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質であれば特に限定されない。ＰＴＮ誘導体としては、例えば、以下のタンパク質が挙げられる：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（４）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（５）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質。
これらのＰＴＮ誘導体は、天然に存在するＰＴＮ誘導体であってもよいし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列および／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をもとに、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法等の公知の遺伝子工学的方法等（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いて作製したものであってもよい。
【００２７】
ＰＴＮ誘導体は、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に公知の遺伝子工学的手法を用いて変異を導入し、得られたＤＮＡを適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを適切な細胞に導入して発現させ、発現したタンパク質を細胞または培地から回収することによって得ることができる。塩基配列の変異とは、塩基の付加（挿入を含む）、欠失、または置換をいう。あるいは、ＰＴＮ誘導体は、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に公知の蛋白質工学的手法を用いて変異を導入することによって作製することができる。アミノ酸配列の変異とは、アミノ酸の付加（挿入を含む）、欠失、または置換をいう。変異は、ＴＲＡＰ活性を阻害するという機能を損なわない部位に導入することが好ましく、具体的には、細胞外への分泌に必要なシグナル配列やヘパリンが結合する部位の立体構造または親和性等を大きく変えない変異であることが好ましい。
【００２８】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載の条件が挙げられる。「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、および５０％ ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
本明細書において、「ＲＡＮＫＬ」とは、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる作用を有するＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄのことをいう。ＲＡＮＫＬは、大腸菌組換え型のＲＡＮＫＬとして市販（例えば、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）されている。ＲＡＮＫＬは、単独、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｍ−ＣＳＦ）との共存下で、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５９７−３６０２（１９９８））。
【００３０】
本明細書において、「ＴＲＡＰ」とは、酸性条件下でホスファターゼとして作用し、酒石酸存在下でもその活性を失わない、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）のことをいう。ＴＲＡＰは、破骨細胞において強く発現し、破骨細胞のマーカーとして使用されている。
【００３１】
本明細書において、「ＴＲＡＰ活性」とは、ＴＲＡＰアッセイの際にＴＲＡＰタンパク質の発現が検出されることをいう。ＴＲＡＰアッセイは、例えば、試験する細胞をマイクロプレートのウェルやスライドガラス上にホルムアルデヒド等で固定し、発光基質を溶解した酒石酸含有緩衝液を加え、３７℃で数時間インキュベートすることによって検出することができる。ＴＲＡＰアッセイについては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１３９８４−１３９９２（２００４）に記載されている。
【００３２】
本発明者らは、ＲＡＮＫＬをマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞ＲＡＷ２６４．７細胞に作用させた場合に検出されるＴＲＡＰタンパク質の発現が、ＰＴＮによって阻害されることを見出した。これは、ＲＡＮＫＬによって誘導される２６４．７細胞の破骨細胞への分化が、ＰＴＮによって阻害されたことを示す。さらに、本発明者らは、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦをラット骨髄由来破骨前駆細胞に作用させた場合に検出されるＴＲＡＰタンパク質の発現ならびに破骨細胞化が、ＰＴＮによって阻害されることを見出した。これは、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによって誘導されるラット骨髄由来破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、ＰＴＮによって阻害されたことを示す。
【００３３】
これらの知見に基づき、本発明者は、ＰＴＮを破骨前駆細胞から破骨細胞への分化の抑制剤および／または阻害剤として使用することができ、さらには破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を抑制することによって骨吸収が抑えられるため、ＰＴＮを骨吸収の抑制剤および／または阻害剤として使用することができると考えた。
【００３４】
骨は、絶えまない骨形成作用と骨吸収作用によって維持されており、骨形成作用と骨吸収作用のバランスが崩れると種々の骨の疾患が引き起こされる。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化が過剰になると種々の疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症）を引き起こすことが知られている。ＰＴＮによって破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を抑えることができるので、ＰＴＮは破骨前駆細胞から破骨細胞への過剰な分化に起因する疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症）の予防剤および／または治療剤として使用することができる。
【００３５】
本発明に係る破骨細胞分化抑制剤および／または阻害剤、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、骨粗鬆症の予防剤および／または治療剤、慢性関節リウマチの予防剤および／または治療剤、変形性関節症の予防剤および／または治療剤、または高カルシウム血症の予防剤および／または治療剤は、ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を有効成分とした医薬組成物として調製することができる。ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を含む医薬組成物は、通常のタンパク質製剤と同様に調製することができる。
【００３６】
医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、例えば、静脈内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、または腹腔内投与が挙げられる。
【００３７】
医薬組成物の剤型は特に限定されず、用途に応じて適宜選択され得、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、もしくは坐剤等の固形製剤、または注射剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤、もしくは乳剤等の液体製剤として投与され得る。液体製剤を使用する場合、溶液を凍結乾燥して固形製剤とし、用時調製の製剤として使用することもできる。
【００３８】
医薬組成物の調製方法としては投与法に応じ適当な製剤を選択し、通常用いられている各種製剤の調製方法にて調製できる。医薬組成物中には、剤型に応じて、適宜、賦形剤、分散剤、崩壊剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、増量剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調節剤等を使用してもよい。
【００３９】
医薬組成物の投与量は特に限定されず、患者の身長、体重、年齢、性別、もしくは病歴、疾患の重篤度、投与経路、投与形態等に応じて担当医の判断によって適宜選択され、一般的には、有効成分としてＰＴＮを０．００１μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、または０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与することができる。投与期間は特に限定されず、数日〜数ヶ月または数日〜数週間にわたって投与することができる。投与間隔も特に限定されず、例えば、１日に１〜３回、または２〜３日に数回投与されてもよい。
【００４０】
本発明はまた、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法に関する。本発明の破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法は、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する条件下で試験化合物を添加し、破骨細胞への分化が抑制および／または阻害された場合に該試験化合物を破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤として同定する工程を包含する。具体的には、本発明の同定方法は、（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を誘導する物質（破骨細胞分化誘導物質）を添加する工程；（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程を包含する。
【００４１】
上記試験化合物は、低分子化合物であってもよいし、プレイオトロフィンの誘導体からなるタンパク質であってもよい。上記試験化合物としては、例えば、化学ライブラリーや天然物由来の化合物、または、ＰＴＮの塩基配列、アミノ酸配列、もしくは立体構造に基づいてドラックデザインして得られた化合物またはタンパク質等が挙げられる。
【００４２】
「破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する条件」とは、破骨前駆細胞に直接的または間接的に作用して破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を誘導する物質（破骨細胞分化誘導物質）を破骨前駆細胞に添加することを意味する。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化誘導方法としては、例えば、ＲＡＮＫＬを破骨前駆細胞に添加すること、またはＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦを破骨前駆細胞に添加することが挙げられる。本発明の実施例で用いたマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬ依存的に容易に破骨細胞様細胞に誘導され、破骨細胞試験系を構築する際に骨芽細胞、ストローマ細胞、Ｍ−ＣＳＦのような外的要素が必要でないため、同種試験系のモデル細胞として頻用されている（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３））。また、本発明の実施例で用いたラット骨髄由来破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの存在下で破骨細胞に分化することが知られている（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９３（１９９２））。
【００４３】
破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を確認する手段は特に限定されず、破骨細胞に分化したことを示す適切なマーカーまたは活性を測定してもよいし、形態学的に判断してもよい。破骨細胞の分化マーカーとしては、例えば、ＴＲＡＰが挙げられる。例えば、破骨前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質および試験化合物を添加して分化を誘導し、その後、ＴＲＡＰの発現の程度を検出する。この細胞におけるＴＲＡＰの発現が、破骨細胞分化誘導物質とＰＴＮを添加した細胞における場合と同様に抑制および／または阻害された場合、該試験化合物を、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤として同定することができる。ＴＲＡＰの発現が破骨細胞分化誘導物質とＰＴＮを添加した細胞と同様に抑制および／または阻害されたかどうかは、ＴＲＡＰの発現量やＴＲＡＰの発現が減少するタイミングを測定することにより判断することができる。
【００４４】
本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞は、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウシ、ウマ由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞としては特に限定されず、株化細胞であっても初代培養細胞であってもよい。本発明の同定方法に用いられる株化細胞としては、例えば、本発明の実施例で用いたマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞が挙げられる。本発明の同定方法に用いられる初代培養細胞としては、例えば、本発明の実施例で用いたラット骨髄由来破骨前駆細胞が挙げられる。大規模な試験化合物のスクリーニングに本発明の同定方法を使用する場合、用いる細胞は、入手が容易であるので株化細胞が好ましい。また、本発明の同定方法において、最初に株化細胞を用いて数種類の試験化合物を選抜し、選抜された試験化合物の破骨細胞分化抑制作用および／または破骨細胞分化阻害作用を初代培養細胞で確認してもよい。本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞の培地、培養時間、培養方法は、選択された細胞に応じて適宜変更され得る。本発明の同定方法において、破骨前駆細胞への破骨細胞分化誘導物質および／または試験化合物の添加は、細胞の播種と同時であっても細胞の播種後であってもよいが、破骨前駆細胞を播種して１２〜２４時間後に添加することが好ましい。試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加前に添加してもよいし、破骨細胞分化誘導物質と同時に添加してもよいし、破骨細胞分化誘導物質の添加後に添加してもよい。破骨細胞分化の初期段階を阻害する物質を同定する場合、試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加前または破骨細胞分化誘導物質と同時に添加することが好ましい。破骨細胞分化の後期段階を阻害する物質を同定する場合、試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加後に添加することが好ましい。
【００４５】
本発明の同定方法によって同定された破骨細胞分化抑制作用および／または破骨細胞分化阻害作用を有する化合物またはタンパク質は、ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を有効成分とする前述の破骨細胞分化抑制剤および／または阻害剤、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、骨粗鬆症の予防剤および／または治療剤、慢性関節リウマチの予防剤および／または治療剤、変形性関節症の予防剤および／または治療剤、または高カルシウム血症の予防剤および／または治療剤と同様に、それら化合物またはタンパク質を有効成分とした医薬組成物として調製することができる。
【００４６】
本発明の同定方法によって同定された化合物を有効成分とする医薬組成物の投与方法、調製方法、投与量等は、前述の医薬組成物のものと同様である。
【００４７】
以下に示す実施例によって本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらに限定されるものではなく、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されない。
【実施例】
【００４８】
（実施例１：プレイオトロフィン発現ベクターの作成）
ヒトプレイオトロフィン（ヒトＰＴＮ）をｃＤＮＡライブラリーＱＵＩＣＫ Ｃｌｏｎｅ（ベクトンディッキンソン バイオサイエンス社製）からクローニングした。クローニングには、プライマーとしてＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列表の配列番号３）とＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列表の配列番号４）を用いた。プライマーはシグナル配列を除去するように設計し、かつ適切な制限酵素部位を配置した。ＰＴＮ−ＦｏｒｗａｒｄはＢａｍＨ Ｉ部位ＧＧＡＴＣＣの下流にコザック配列 ＧＣＣと開始コドンＡＴＧが並ぶように設計した。ＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅは、終止コドンＴＡＡの直後にＸｈｏ Ｉ部位ＣＴＣＧＡＧが並ぶように設計した。
ＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号３）
ＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧ−３’（配列表の配列番号４）
上記のｃＤＮＡライブラリー、ＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列表の配列番号３）、およびＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列表の配列番号４）を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＰＴＮのｃＤＮＡに対応する、約５００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をクローニング用ベクターｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に組込み、クローニングに用いた。得られた組換えクローンを制限酵素ＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉで消化することによって、ＰＴＮ ｃＤＮＡを、ｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯから分離した。
【００４９】
次に、動物細胞発現用ベクターｐＣＩ（プロメガ社製）にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖の塩基配列（配列表の配列番号５）を挿入した動物細胞発現用ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）を作製した。配列表の配列番号５で表される塩基配列によって３１６アミノ酸残基のタンパク質（配列表の配列番号６）がコードされる。このｐＣＩ（Ｆｃ）ベクターに目的のタンパク質を挿入すると、該タンパク質はＦｃ鎖との融合タンパク質として発現され、細胞外に分泌する能力を獲得する。
【００５０】
制限酵素認識配列をＮｈｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＶ−Ｍｌｕ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉの順に含む下記のＤＮＡオリゴマーを合成した。
センス：ＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ（配列表の配列番号７）
アンチセンス：ＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧ（配列表の配列番号８）
これらの合成オリゴマーをアニーリングによって２重鎖化し、ｐＣＩのマルチクローニングサイト中のＮｈｅ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ領域と置換した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖のＤＮＡ（配列表の配列番号５）は、Ｋｐｎ Ｉ認識配列を含むＦｃ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣ（配列表の配列番号９）およびＮｏｔ Ｉ認識配列を含むＦｃ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列表の配列番号１０）を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ベクトンディッキンソン社製）を鋳型としたＰＣＲにより得た。得られたＦｃ断片を、上述のマルチクローニング部位を改変したｐＣＩの、Ｋｐｎ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ間に組み込み、ｐＣＩ（Ｆｃ）を得た。
【００５１】
ｐＣＩ（Ｆｃ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、これを上述のｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯから分離、精製したＰＴＮ ｃＤＮＡと連結させ、Ｆｃ融合ＰＴＮを発現するｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮベクターを得た。
【００５２】
２μｇのｐＣＩ（Ｆｃ）またはｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮとトランスフェクション試薬ＦｕＧｅｎ６（Ｒｏｃｈｅ）６μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭで１００μｌに調整し、この混合液を、６ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０５個／２．５ｍｌ／ウェル）に加えた。２４時間後、培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いてＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質を回収した。回収したＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、その後、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析を実施した（図１Ｂ）。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ回収サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色した（図１Ａ）。培養上清の免疫沈降により、ヒトＰＴＮとヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖と融合した、約５０ｋＤａのバンドが確認されたので、翻訳産物は遊離型として細胞外に放出されていることがわかった（図１Ｂ）。
【００５３】
（実施例２：ＰＴＮの調整）
２μｇのｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮを、実施例１の方法に従って、５×１０５個／２．５ｍｌ／ウェルで播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。２４時間後、培地を、ウシ胎児血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）と交換した。さらに２４時間後、培地上清を回収し、これを遊離型ＰＴＮ画分とした。
【００５４】
（実施例３：ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＴＮの破骨細胞分化抑制作用）
ＲＡＷ２６４．７細胞（マウスマクロファージ由来破骨前駆細胞）を１０％ ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭに懸濁し、５×１０３個／５００μｌ／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＲＡＮＫＬ依存的に容易に破骨細胞様細胞に誘導され、破骨細胞試験系を構築する際に骨芽細胞、ストローマ細胞、Ｍ−ＣＳＦのような外的要素を必要としない。従って、取扱いが簡便であり、破骨前駆細胞分化の研究において一般的に利用されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５４０−３５４５（１９９９））。
【００５５】
播種の翌日、遊離型ＰＴＮ画分を培地の１／４量になるように添加した。４時間後、ＲＡＮＫＬ（大腸菌組換え型、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
【００５６】
３日間の培養後、この細胞をＴＲＡＰアッセイに供試した。ＴＲＡＰアッセイは、ＴＲＡＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（セルガレージ）を用い、破骨細胞化マーカータンパク質であるＴＲＡＰで細胞を染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。水で洗浄後、発色基質を溶解した酒石酸含有緩衝液を加え、３７℃で１時間インキュベートして発色させた。次いで、細胞を光学顕微鏡にて観察した。
【００５７】
ＲＡＷ２６４．７をＲＡＮＫＬで処理すると、処理後３日で顕著にＴＲＡＰ陽性細胞が認められ（図２−２）、破骨細胞への分化が促進された。ＰＴＮはこのＲＡＮＫＬによるＴＲＡＰの活性化を抑制し、破骨細胞への分化を阻害した（図２−３）。また、ＲＡＮＫＬによるＲＡＷ２６４．７細胞の破骨細胞分化がＰＴＮによって抑制されるときに、細胞の形態が類球形から紡錘形に変化し、コロニーを形成する細胞集団の間隔が空いて緩やかに広がる現象が観察された（図２−３）。
【００５８】
（実施例４：ラット骨髄由来破骨前駆細胞におけるＰＴＮの破骨細胞分化抑制作用）
ラット骨髄由来破骨前駆細胞（ホクドー社製）をＯｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＯＢＭ）に懸濁し、５×１０３個／５００μｌ／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。ラット骨髄由来破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの存在下で、破骨細胞に分化する。
【００５９】
播種の翌日、遊離型ＰＴＮ画分を培地の１／４量になるように添加した。４時間後、ＲＡＮＫＬを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦ（大腸菌組換え型、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。５日間培養した後、ＴＲＡＰアッセイに供試した。ＴＲＡＰアッセイは、実施例３と同様に実施し、染色した細胞を、光学顕微鏡にて観察した。
【００６０】
Ｍ−ＣＳＦのみを添加した細胞（図３−１）およびＲＡＮＫＬのみを添加した細胞（図３−２）は、いずれも、ＴＲＡＰ活性を示さなかった。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦを添加した細胞は、顕著にＴＲＡＰ活性を示した（図３−３）。このＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの両方を添加した細胞は、ＴＲＡＰ陽性細胞のみならず、破骨細胞を生じた（図３−３および図４）。これは、ラット骨髄由来破骨前駆細胞の破骨細胞への分化には、ＲＡＮＫＬのみまたはＭ−ＣＳＦのみの作用では不十分であり、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの両方を必要とすることを示す。
【００６１】
ＰＴＮは、このようなＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによる破骨細胞化を阻止した（図３−６）。また、Ｍ−ＣＳＦおよびＰＴＮを添加した細胞（図３−４）、ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮを添加した細胞（図３−５）、ならびにＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＰＴＮのいずれも添加しなかった細胞（図は示さず。）は、破骨細胞に分化しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、プラスミドｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮまたはｐＣＩ（Ｆｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、銀染色（Ａ）またはウェスタンブロッティング（Ｂ）にて発現を確認した図である。ＰｒｏｔｅｉｎＧ共沈画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、銀染色した（Ａ）（レーンの左側の数字は、タンパク質の大きさ（ｋＤａ）を示す）。ＰｒｏｔｅｉｎＧ共沈画分をウェスタンブロッティングに供試し、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した（Ｂ）（レーンの左側の数字は、タンパク質の大きさ（ｋＤａ）を示す）。ＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質は約５０ｋＤａである。ｐＣＩ／ＰＴＮ−Ｆｃプラスミドを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質を発現した。プラスミドｐＣＩ（Ｆｃ）は、Ｆｃ配列を含むがＡＴＧコドン配列を含まないので、Ｆｃタンパク質を発現しない。
【図２】図２は、ＰＴＮが、ＲＡＮＫＬによるＲＡＷ２６４．７の破骨細胞分化を阻害することを示す図である。本観察において、暗緑色に見えるのがＴＲＡＰ陽性細胞である。図２−１は、ＲＡＮＫＬもＰＴＮも添加していない細胞である。図２−２は、ＲＡＮＫＬのみを添加した細胞である。図２−３は、ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮを添加した細胞である。
【図３】図３は、ＰＴＮが、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるラット破骨前駆細胞の破骨細胞化を阻害することを示す図である。本観察は、図２の場合とは異なるフィルターを用いて観察したので、ＴＲＡＰ陽性細胞は赤色に見える。図３−１〜図３−６は、それぞれ、ラット破骨前駆細胞に下記の組み合わせで化合物を添加したときのＴＲＡＰ活性の結果を示す。図３−１：Ｍ−ＣＳＦ。図３−２：ＲＡＮＫＬ。図３−３：ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ。図３−４：Ｍ−ＣＳＦおよびＰＴＮ。図３−５：ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮ。図３−６：ＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＰＴＮ。
【図４】図４は、図３−３と同じ処理をしたの細胞のうち、成熟破骨細胞に特徴的な形態を示した細胞を示す図である。ラット破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理により多数の細胞が融合して形成された巨大多核細胞（成熟破骨細胞）を生じた。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：ヒトプレイオトロフィン遺伝子。
配列番号２：ヒトプレイオトロフィン遺伝子（配列番号１）によってコードされるタンパク質。
配列番号３：ヒトプレイオトロフィンのＦｏｒｗａｒｄプライマー
配列番号４：ヒトプレイオトロフィンのＲｅｖｅｒｓｅプライマー
配列番号５：ヒトイムノグロブリンＧ１ Ｆｃフラグメント。
配列番号６：ヒトイムノグロブリンＧ１ Ｆｃフラグメント（配列番号５）によってコードされるタンパク質。
配列番号７：発現ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）の作製に用いたＤＮＡオリゴマーのセンス鎖
配列番号８：発現ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）の作製に用いたＤＮＡオリゴマーのアンチセンス鎖
配列番号９：ヒトイムノグロブリンＧ１ ＦｃフラグメントのＦｏｒｗａｒｄプライマー
配列番号１０：ヒトイムノグロブリンＧ１ ＦｃフラグメントのＲｅｖｅｒｓｅプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）が破骨細胞分化を抑制および／または阻害するという知見に基づく、プレイオトロフィンを含有する骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含有する破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤、プレイオトロフィンを含有する破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤、あるいは、プレイオトロフィンを用いた破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防方法および／または治療方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、新規な破骨細胞分化抑制因子および／または阻害因子の同定におけるプレイオトロフィンの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨は、密度の高い、特殊化した形の結合組織であるが、永久不変の組織ではない。骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収により、その形を変えることなく、新しい骨に置換される。骨のマトリクス表面に存在する骨芽細胞は、オステオイドと呼ばれるマトリクスを分泌し、オステオイドの石灰化とともに骨細胞に変化し、骨を形成する。破骨細胞は、大きな多核細胞で、マクロファージと同様に骨髄の造血幹細胞に由来する。破骨細胞は、骨芽細胞と同様に骨のマトリクス上に存在し、マトリクスを溶かす作用がある。
【０００４】
骨形成と骨吸収のバランスがくずれると、様々な疾患が引き起こされる。例えば、不十分な骨形成は、骨折や骨が欠損した場合の回復の遅延につながる。また、骨粗鬆症や慢性関節リウマチは、破骨細胞が増勢して骨吸収が過剰になることが原因のひとつになっている。
【０００５】
骨形成および／または骨吸収には種々の因子が関与することが知られている。骨破壊に関連する因子としては、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる作用を有するＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＲＡＮＫＬの受容体であるＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ（ＲＡＮＫ）が挙げられる（非特許文献１および非特許文献２）。ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫによる破骨細胞分化には、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ（ＮＦ−κＢ）活性化シグナル経路またはＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ｃ−Ｆｏｓ／ＮＦＡＴｃ）活性化シグナル経路が関与することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
近年、神経細胞の伸長に作用するタンパク質として知られているプレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）（非特許文献４）が、骨形成に関与することが報告された（非特許文献５）。ＰＴＮは、ラットの脳で最初に同定された１６８アミノ酸残基からなるヘパリン結合型の増殖因子である（非特許文献６）。ＰＴＮは、１６８アミノ酸残基からなる前駆体として生成され、３２アミノ酸残基が除かれて、１３６アミノ酸残基の活性化型タンパク質として細胞外に放出される。骨芽細胞刺激因子１（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１）としても知られるＰＴＮは、骨芽細胞の遊走性、分化、コロニー形成、アルカリフォスファターゼ産生を促進することが報告されている（非特許文献５）。最近では、ＰＴＮが単独で内因性の組織による骨または軟骨組織の修復を促進することが報告されている（特許文献１）。ＰＴＮは、神経細胞の伸長および骨形成の他にも血管新生等に関与することが知られている（非特許文献７）が、ＰＴＮが骨破壊に関与することは知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１２２７９９
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５９７−３６０２（１９９８）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５４０−３５４５（１９９９）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ ４２８：７５８−７６３（２００４）
【非特許文献４】Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９３（１９９２）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６７２１−４．（１９９０）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３２：１１４６−１１５３（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
破骨細胞分化の機構の解明は、骨粗鬆症や慢性関節リウマチ等の破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法の開発につながるが、その機構はまだ十分に明らかにされているとはいえない。破骨細胞分化の詳細な機構を解明すること、特に、破骨細胞分化に関与する因子を新たに同定し、その因子を利用して破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法を開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、骨芽細胞に発現し骨形成に関与することが知られているＰＴＮが骨吸収に及ぼす影響を調べたところ、驚くべきことに、ＲＡＮＫＬによる破骨前駆細胞から破骨細胞への分化をＰＴＮが抑制および／または阻害することを見出した。本発明者は、この知見に基づき、ＰＴＮを骨吸収の抑制剤および／または阻害剤として利用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
［２］プレイオトロフィンを含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
［３］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［４］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［５］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［６］プレイオトロフィンを含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［７］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［８］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［９］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［１０］プレイオトロフィンを含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
［１１］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１２］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１３］プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
［１４］プレイオトロフィンを含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
［１５］次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１６］次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
［１７］破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症である、［１３］〜［１６］のいずれか１つに記載の予防剤および／または治療剤。
［１８］次の（１）〜（３）の工程を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法：
（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に破骨細胞誘導物質を添加する工程；
（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；および
（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程。
［１９］破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を、細胞のＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性によって判断する、［１８］に記載の方法。
［２０］破骨前駆細胞が株化細胞である、［１８］または［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２１］破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）である、［２０］に記載の方法。
［２２］破骨前駆細胞が初代培養細胞である、［１８］または［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）である、［２２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、骨粗鬆症や慢性関節リウマチ等の破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤および／または治療方法が提供される。具体的には、本発明によって、ＰＴＮおよび／またはＰＴＮ誘導体を含む破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療剤、あるいは、ＰＴＮおよび／またはＰＴＮ誘導体を用いた破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の新たな治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書で用いる用語について説明する。
【００１３】
本明細書において、単離したＤＮＡ、合成のＤＮＡ、単離したポリヌクレオチド、または合成のポリヌクレオチドを総称して「ＤＮＡ」と称し、単離したタンパク質、合成のタンパク質、単離したポリペプチド、または合成のポリペプチドを総称して「タンパク質」と称する。
【００１４】
本明細書において「プレイオトロフィン」、「ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ」、または「ＰＴＮ」とは、天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質、プレイオトロフィンをコードするＤＮＡにより生成される組換えプレイオトロフィンタンパク質、またはプレイオトロフィンタンパク質のフラグメントをいう。天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質としては、例えば、マウス、ヒト、ラット等の動物から精製されるプレイオトロフィンが挙げられる。天然に存在するプレイオトロフィンタンパク質には、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）と呼ばれる変異を起したプレイオトロフィンＤＮＡによってコードされるタンパク質を含む。組換えプレイオトロフィンタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１５】
ＰＴＮのＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡであり得る。ＰＴＮのＤＮＡは、１５５８塩基からなり、翻訳されて１６８アミノ酸（配列表の配列番号２）のタンパク質をコードする。
【００１６】
ＰＴＮのＤＮＡは、当業者に公知の遺伝子工学的手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）によって容易に得ることができる。ＰＴＮのＤＮＡは、例えば、実施例に記載されるように、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の配列情報をもとにプライマーを設計し、ＰＴＮを発現している組織または細胞由来のｃＤＮＡライブラリー等を鋳型としたＰＣＲによって得ることができる。プライマーの設計、鋳型、およびＰＣＲ条件は、当業者によって適宜選択され得る。好ましくは、プライマーは、１５〜３０個、より好ましくは２０個〜２５個のヌクレオチドからなる。ＰＣＲによって得られたＰＴＮのＤＮＡは、当業者に公知の方法を用いてクローニングされ得る。クローニングされたＰＴＮのＤＮＡは、適切な発現ベクターに組み込まれ、ＰＴＮタンパク質の取得に用いられ得る。
【００１７】
ＰＴＮのタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり得る。ＰＴＮは、細胞外への分泌に必要なシグナル配列を含むＮ末端領域と、ヘパリン結合部位を含むＣ末端領域から構成される。Ｎ末端領域は、配列表の配列番号２の第１番目〜第９６番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第３６４番目〜第６５１番目の塩基配列に相当）で構成され、Ｃ末端領域は、配列表の配列番号２の第９７番目〜第１６８番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第６５２番目〜第８６７番目の塩基配列に相当）で構成される。細胞外への分泌に必要なシグナル配列は、配列表の配列番号２の第１番目〜第３２番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第３６４番目〜第４５９番目の塩基配列に相当）で構成され、ヘパリン結合部位は、配列表の配列番号２の第１０２番目〜第１４２番目のアミノ酸配列（配列表の配列番号１の第６６７番目〜第７８９番目の塩基配列に相当）の範囲に含まれる３か所のドメインから構成される。ＰＴＮは、１６８アミノ酸残基からなる前駆体として生成され、プロセシングによりＮ末端ドメイン中の３２アミノ酸残基からなるシグナル配列が除かれ、成熟タンパク質となる。ＰＴＮは血管新生や細胞増殖等に関与するミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ）（ＭＫ）と約５０％のアミノ酸配列の相同性を有する（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３））。
【００１８】
ＰＴＮのタンパク質は、当業者に公知の遺伝子工学的手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）によって容易に得ることができる。ＰＴＮのタンパク質は、例えば、実施例に記載されるように、ＰＴＮのＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このＰＴＮ発現ベクターを宿主（例えば、細胞）に導入し、その宿主自体またはその培養上清等から回収することによって得ることができる。
【００１９】
ＰＴＮのＤＮＡを組み込む発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的に応じて適宜選択され得る。ＰＴＮタンパク質を細胞で発現させて培養上清から回収する場合、回収率を上げるために、ＰＴＮの細胞外への分泌を促進するような配列（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ鎖をコードするＤＮＡ）をＰＴＮのＤＮＡの前または後ろに組み込んだＰＴＮ発現ベクターを用いることができる。
【００２０】
宿主としては、原核生物であっても真核生物であってもよい。原核生物としては、例えば、大腸菌が挙げられる。真核生物としては、例えば、酵母、昆虫、ヒト、マウス、ラット、またはサル由来の細胞が挙げられ、ヒト、マウス、ラット、またはサル由来の細胞が好ましい。
【００２１】
ＰＴＮのＤＮＡを組み込んだＰＴＮ発現ベクターは、当業者に公知の手段によって宿主に導入され得る。導入した遺伝子の細胞での発現は、核外遺伝子を利用する自律複製系を利用するものであってもよいし、遺伝子発現の安定性を考慮して染色体内へＰＴＮのＤＮＡをインテグレートするものであってもよい。簡便には、自律複製系が好ましい。
【００２２】
ＰＴＮタンパク質の宿主からの回収方法は、当業者に公知の方法に従い、細胞自体または細胞の培養上清から回収し得る。ＰＴＮタンパク質は、例えば、実施例に記載されるように、培養上清への分泌を促進する配列を連結したＰＴＮ発現ベクターを用いる場合、ＰＴＮ発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＰＴＮ画分として回収することができる。回収したＰＴＮ画分は、当業者に公知の方法、例えば、ＰＴＮに特異的な抗体を用いて精製することができる。
【００２３】
ＰＴＮは、受容体を介して様々な生体機能に関与することが報告されている。ＰＴＮは、約５０％のアミノ酸配列の相同性を有するＭＫと共通の受容体を介することが報告されている。このような受容体としては、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種である受容体型プロテインチロシンホスファターゼζ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｐｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ζ）（ＰＴＰζ）が挙げられる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２４７４−１２４７９（１９９９））。ＭＫは神経細胞の細胞移動のシグナルを活性化し、ＰＴＮにも同様の作用を有することが示唆された。また、ＰＴＮは、ＰＴＰζのタンパク質部分に結合し、β−カテニンを経由して細胞運動を調節することが報告されている（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９：３７７−３８７（２０００））。
【００２４】
ＰＴＮに対する別の受容体としては、Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋｉｎａｓｅ（ＡＬＫ）が挙げられる。ＡＬＫもまた、ＰＴＮおよびＭＫに共通する受容体であることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６７７２−１６７７９（２００１））。ＡＬＫは、ＰＴＮに対する受容体としてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＰＴＮはＡＬＫとその下流因子であるＩＲＳ−１、Ｓｈｃ、ホスホリパーゼＣ−γ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ−γ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化する。また、ＰＴＮが増殖促進を引き起こす株はＡＬＫも連動して発現していることから、ＰＴＮが細胞増殖シグナルに関与することが示唆された。
【００２５】
ＰＴＮに対する別の受容体としては、Ｎ−シンデカン（Ｎ−ｓｙｎｄｅｃａｎ）が挙げられる。Ｎ−シンデカンもまた、ＰＴＮおよびＭＫに共通する受容体であり、ＰＴＮおよびＭＫは、固相アッセイにおいて、ヘパラン硫酸に依存してシンデカン−１に結合する（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９：３７７−３８７（２０００））。また、ＰＴＮは、神経細胞や骨芽様細胞において表面受容体Ｎ−シンデカンの糖鎖に結合し、細胞膜の直下に存在するＣＡＳＫ−コルタクチン（ＣＡＳＫ−ｃｏｒｔａｃｔｉｎ）複合体を介してｓｒｃ−ファミリーキナーゼ（ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅ）を活性化し、細胞運動性を調節する細胞骨格を制御するシグナルを発生させることが報告されている。
【００２６】
本明細書において「プレイオトロフィン誘導体」または「ＰＴＮ誘導体」とは、ＰＴＮの塩基配列に類似する塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはＰＴＮのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質であれば特に限定されない。ＰＴＮ誘導体としては、例えば、以下のタンパク質が挙げられる：
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（４）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質；
（５）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＲＡＰ活性を阻害するタンパク質。
これらのＰＴＮ誘導体は、天然に存在するＰＴＮ誘導体であってもよいし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列および／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をもとに、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法等の公知の遺伝子工学的方法等（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いて作製したものであってもよい。
【００２７】
ＰＴＮ誘導体は、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に公知の遺伝子工学的手法を用いて変異を導入し、得られたＤＮＡを適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを適切な細胞に導入して発現させ、発現したタンパク質を細胞または培地から回収することによって得ることができる。塩基配列の変異とは、塩基の付加（挿入を含む）、欠失、または置換をいう。あるいは、ＰＴＮ誘導体は、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に公知の蛋白質工学的手法を用いて変異を導入することによって作製することができる。アミノ酸配列の変異とは、アミノ酸の付加（挿入を含む）、欠失、または置換をいう。変異は、ＴＲＡＰ活性を阻害するという機能を損なわない部位に導入することが好ましく、具体的には、細胞外への分泌に必要なシグナル配列やヘパリンが結合する部位の立体構造または親和性等を大きく変えない変異であることが好ましい。
【００２８】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載の条件が挙げられる。「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、および５０％ ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
本明細書において、「ＲＡＮＫＬ」とは、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる作用を有するＲｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄのことをいう。ＲＡＮＫＬは、大腸菌組換え型のＲＡＮＫＬとして市販（例えば、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）されている。ＲＡＮＫＬは、単独、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｍ−ＣＳＦ）との共存下で、破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５９７−３６０２（１９９８））。
【００３０】
本明細書において、「ＴＲＡＰ」とは、酸性条件下でホスファターゼとして作用し、酒石酸存在下でもその活性を失わない、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）のことをいう。ＴＲＡＰは、破骨細胞において強く発現し、破骨細胞のマーカーとして使用されている。
【００３１】
本明細書において、「ＴＲＡＰ活性」とは、ＴＲＡＰアッセイの際にＴＲＡＰタンパク質の発現が検出されることをいう。ＴＲＡＰアッセイは、例えば、試験する細胞をマイクロプレートのウェルやスライドガラス上にホルムアルデヒド等で固定し、発光基質を溶解した酒石酸含有緩衝液を加え、３７℃で数時間インキュベートすることによって検出することができる。ＴＲＡＰアッセイについては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１３９８４−１３９９２（２００４）に記載されている。
【００３２】
本発明者らは、ＲＡＮＫＬをマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞ＲＡＷ２６４．７細胞に作用させた場合に検出されるＴＲＡＰタンパク質の発現が、ＰＴＮによって阻害されることを見出した。これは、ＲＡＮＫＬによって誘導される２６４．７細胞の破骨細胞への分化が、ＰＴＮによって阻害されたことを示す。さらに、本発明者らは、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦをラット骨髄由来破骨前駆細胞に作用させた場合に検出されるＴＲＡＰタンパク質の発現ならびに破骨細胞化が、ＰＴＮによって阻害されることを見出した。これは、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによって誘導されるラット骨髄由来破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、ＰＴＮによって阻害されたことを示す。
【００３３】
これらの知見に基づき、本発明者は、ＰＴＮを破骨前駆細胞から破骨細胞への分化の抑制剤および／または阻害剤として使用することができ、さらには破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を抑制することによって骨吸収が抑えられるため、ＰＴＮを骨吸収の抑制剤および／または阻害剤として使用することができると考えた。
【００３４】
骨は、絶えまない骨形成作用と骨吸収作用によって維持されており、骨形成作用と骨吸収作用のバランスが崩れると種々の骨の疾患が引き起こされる。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化が過剰になると種々の疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症）を引き起こすことが知られている。ＰＴＮによって破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を抑えることができるので、ＰＴＮは破骨前駆細胞から破骨細胞への過剰な分化に起因する疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症）の予防剤および／または治療剤として使用することができる。
【００３５】
本発明に係る破骨細胞分化抑制剤および／または阻害剤、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、骨粗鬆症の予防剤および／または治療剤、慢性関節リウマチの予防剤および／または治療剤、変形性関節症の予防剤および／または治療剤、または高カルシウム血症の予防剤および／または治療剤は、ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を有効成分とした医薬組成物として調製することができる。ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を含む医薬組成物は、通常のタンパク質製剤と同様に調製することができる。
【００３６】
医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、例えば、静脈内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、または腹腔内投与が挙げられる。
【００３７】
医薬組成物の剤型は特に限定されず、用途に応じて適宜選択され得、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、もしくは坐剤等の固形製剤、または注射剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤、もしくは乳剤等の液体製剤として投与され得る。液体製剤を使用する場合、溶液を凍結乾燥して固形製剤とし、用時調製の製剤として使用することもできる。
【００３８】
医薬組成物の調製方法としては投与法に応じ適当な製剤を選択し、通常用いられている各種製剤の調製方法にて調製できる。医薬組成物中には、剤型に応じて、適宜、賦形剤、分散剤、崩壊剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、増量剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調節剤等を使用してもよい。
【００３９】
医薬組成物の投与量は特に限定されず、患者の身長、体重、年齢、性別、もしくは病歴、疾患の重篤度、投与経路、投与形態等に応じて担当医の判断によって適宜選択され、一般的には、有効成分としてＰＴＮを０．００１μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、または０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与することができる。投与期間は特に限定されず、数日〜数ヶ月または数日〜数週間にわたって投与することができる。投与間隔も特に限定されず、例えば、１日に１〜３回、または２〜３日に数回投与されてもよい。
【００４０】
本発明はまた、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法に関する。本発明の破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法は、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する条件下で試験化合物を添加し、破骨細胞への分化が抑制および／または阻害された場合に該試験化合物を破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤として同定する工程を包含する。具体的には、本発明の同定方法は、（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を誘導する物質（破骨細胞分化誘導物質）を添加する工程；（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程を包含する。
【００４１】
上記試験化合物は、低分子化合物であってもよいし、プレイオトロフィンの誘導体からなるタンパク質であってもよい。上記試験化合物としては、例えば、化学ライブラリーや天然物由来の化合物、または、ＰＴＮの塩基配列、アミノ酸配列、もしくは立体構造に基づいてドラックデザインして得られた化合物またはタンパク質等が挙げられる。
【００４２】
「破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する条件」とは、破骨前駆細胞に直接的または間接的に作用して破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を誘導する物質（破骨細胞分化誘導物質）を破骨前駆細胞に添加することを意味する。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化誘導方法としては、例えば、ＲＡＮＫＬを破骨前駆細胞に添加すること、またはＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦを破骨前駆細胞に添加することが挙げられる。本発明の実施例で用いたマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬ依存的に容易に破骨細胞様細胞に誘導され、破骨細胞試験系を構築する際に骨芽細胞、ストローマ細胞、Ｍ−ＣＳＦのような外的要素が必要でないため、同種試験系のモデル細胞として頻用されている（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：４７−５７（２００３））。また、本発明の実施例で用いたラット骨髄由来破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの存在下で破骨細胞に分化することが知られている（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９３（１９９２））。
【００４３】
破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を確認する手段は特に限定されず、破骨細胞に分化したことを示す適切なマーカーまたは活性を測定してもよいし、形態学的に判断してもよい。破骨細胞の分化マーカーとしては、例えば、ＴＲＡＰが挙げられる。例えば、破骨前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質および試験化合物を添加して分化を誘導し、その後、ＴＲＡＰの発現の程度を検出する。この細胞におけるＴＲＡＰの発現が、破骨細胞分化誘導物質とＰＴＮを添加した細胞における場合と同様に抑制および／または阻害された場合、該試験化合物を、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤として同定することができる。ＴＲＡＰの発現が破骨細胞分化誘導物質とＰＴＮを添加した細胞と同様に抑制および／または阻害されたかどうかは、ＴＲＡＰの発現量やＴＲＡＰの発現が減少するタイミングを測定することにより判断することができる。
【００４４】
本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞は、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウシ、ウマ由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞としては特に限定されず、株化細胞であっても初代培養細胞であってもよい。本発明の同定方法に用いられる株化細胞としては、例えば、本発明の実施例で用いたマウスマクロファージ由来破骨前駆細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞が挙げられる。本発明の同定方法に用いられる初代培養細胞としては、例えば、本発明の実施例で用いたラット骨髄由来破骨前駆細胞が挙げられる。大規模な試験化合物のスクリーニングに本発明の同定方法を使用する場合、用いる細胞は、入手が容易であるので株化細胞が好ましい。また、本発明の同定方法において、最初に株化細胞を用いて数種類の試験化合物を選抜し、選抜された試験化合物の破骨細胞分化抑制作用および／または破骨細胞分化阻害作用を初代培養細胞で確認してもよい。本発明の同定方法に用いられる破骨前駆細胞の培地、培養時間、培養方法は、選択された細胞に応じて適宜変更され得る。本発明の同定方法において、破骨前駆細胞への破骨細胞分化誘導物質および／または試験化合物の添加は、細胞の播種と同時であっても細胞の播種後であってもよいが、破骨前駆細胞を播種して１２〜２４時間後に添加することが好ましい。試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加前に添加してもよいし、破骨細胞分化誘導物質と同時に添加してもよいし、破骨細胞分化誘導物質の添加後に添加してもよい。破骨細胞分化の初期段階を阻害する物質を同定する場合、試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加前または破骨細胞分化誘導物質と同時に添加することが好ましい。破骨細胞分化の後期段階を阻害する物質を同定する場合、試験化合物は、破骨細胞分化誘導物質の添加後に添加することが好ましい。
【００４５】
本発明の同定方法によって同定された破骨細胞分化抑制作用および／または破骨細胞分化阻害作用を有する化合物またはタンパク質は、ＰＴＮまたはＰＴＮ誘導体を有効成分とする前述の破骨細胞分化抑制剤および／または阻害剤、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤、骨粗鬆症の予防剤および／または治療剤、慢性関節リウマチの予防剤および／または治療剤、変形性関節症の予防剤および／または治療剤、または高カルシウム血症の予防剤および／または治療剤と同様に、それら化合物またはタンパク質を有効成分とした医薬組成物として調製することができる。
【００４６】
本発明の同定方法によって同定された化合物を有効成分とする医薬組成物の投与方法、調製方法、投与量等は、前述の医薬組成物のものと同様である。
【００４７】
以下に示す実施例によって本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらに限定されるものではなく、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されない。
【実施例】
【００４８】
（実施例１：プレイオトロフィン発現ベクターの作成）
ヒトプレイオトロフィン（ヒトＰＴＮ）をｃＤＮＡライブラリーＱＵＩＣＫ Ｃｌｏｎｅ（ベクトンディッキンソン バイオサイエンス社製）からクローニングした。クローニングには、プライマーとしてＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列表の配列番号３）とＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列表の配列番号４）を用いた。プライマーはシグナル配列を除去するように設計し、かつ適切な制限酵素部位を配置した。ＰＴＮ−ＦｏｒｗａｒｄはＢａｍＨ Ｉ部位ＧＧＡＴＣＣの下流にコザック配列 ＧＣＣと開始コドンＡＴＧが並ぶように設計した。ＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅは、終止コドンＴＡＡの直後にＸｈｏ Ｉ部位ＣＴＣＧＡＧが並ぶように設計した。
ＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号３）
ＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧ−３’（配列表の配列番号４）
上記のｃＤＮＡライブラリー、ＰＴＮ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列表の配列番号３）、およびＰＴＮ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列表の配列番号４）を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＰＴＮのｃＤＮＡに対応する、約５００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をクローニング用ベクターｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に組込み、クローニングに用いた。得られた組換えクローンを制限酵素ＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉで消化することによって、ＰＴＮ ｃＤＮＡを、ｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯから分離した。
【００４９】
次に、動物細胞発現用ベクターｐＣＩ（プロメガ社製）にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖の塩基配列（配列表の配列番号５）を挿入した動物細胞発現用ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）を作製した。配列表の配列番号５で表される塩基配列によって３１６アミノ酸残基のタンパク質（配列表の配列番号６）がコードされる。このｐＣＩ（Ｆｃ）ベクターに目的のタンパク質を挿入すると、該タンパク質はＦｃ鎖との融合タンパク質として発現され、細胞外に分泌する能力を獲得する。
【００５０】
制限酵素認識配列をＮｈｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＶ−Ｍｌｕ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉの順に含む下記のＤＮＡオリゴマーを合成した。
センス：ＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ（配列表の配列番号７）
アンチセンス：ＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧ（配列表の配列番号８）
これらの合成オリゴマーをアニーリングによって２重鎖化し、ｐＣＩのマルチクローニングサイト中のＮｈｅ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ領域と置換した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖のＤＮＡ（配列表の配列番号５）は、Ｋｐｎ Ｉ認識配列を含むＦｃ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣ（配列表の配列番号９）およびＮｏｔ Ｉ認識配列を含むＦｃ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列表の配列番号１０）を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ベクトンディッキンソン社製）を鋳型としたＰＣＲにより得た。得られたＦｃ断片を、上述のマルチクローニング部位を改変したｐＣＩの、Ｋｐｎ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ間に組み込み、ｐＣＩ（Ｆｃ）を得た。
【００５１】
ｐＣＩ（Ｆｃ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、これを上述のｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯから分離、精製したＰＴＮ ｃＤＮＡと連結させ、Ｆｃ融合ＰＴＮを発現するｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮベクターを得た。
【００５２】
２μｇのｐＣＩ（Ｆｃ）またはｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮとトランスフェクション試薬ＦｕＧｅｎ６（Ｒｏｃｈｅ）６μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭで１００μｌに調整し、この混合液を、６ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０５個／２．５ｍｌ／ウェル）に加えた。２４時間後、培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いてＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質を回収した。回収したＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、その後、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析を実施した（図１Ｂ）。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ回収サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色した（図１Ａ）。培養上清の免疫沈降により、ヒトＰＴＮとヒトＩｇＧ１ Ｆｃ鎖と融合した、約５０ｋＤａのバンドが確認されたので、翻訳産物は遊離型として細胞外に放出されていることがわかった（図１Ｂ）。
【００５３】
（実施例２：ＰＴＮの調整）
２μｇのｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮを、実施例１の方法に従って、５×１０５個／２．５ｍｌ／ウェルで播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。２４時間後、培地を、ウシ胎児血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）と交換した。さらに２４時間後、培地上清を回収し、これを遊離型ＰＴＮ画分とした。
【００５４】
（実施例３：ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＴＮの破骨細胞分化抑制作用）
ＲＡＷ２６４．７細胞（マウスマクロファージ由来破骨前駆細胞）を１０％ ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭに懸濁し、５×１０３個／５００μｌ／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＲＡＮＫＬ依存的に容易に破骨細胞様細胞に誘導され、破骨細胞試験系を構築する際に骨芽細胞、ストローマ細胞、Ｍ−ＣＳＦのような外的要素を必要としない。従って、取扱いが簡便であり、破骨前駆細胞分化の研究において一般的に利用されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５４０−３５４５（１９９９））。
【００５５】
播種の翌日、遊離型ＰＴＮ画分を培地の１／４量になるように添加した。４時間後、ＲＡＮＫＬ（大腸菌組換え型、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。
【００５６】
３日間の培養後、この細胞をＴＲＡＰアッセイに供試した。ＴＲＡＰアッセイは、ＴＲＡＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（セルガレージ）を用い、破骨細胞化マーカータンパク質であるＴＲＡＰで細胞を染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。水で洗浄後、発色基質を溶解した酒石酸含有緩衝液を加え、３７℃で１時間インキュベートして発色させた。次いで、細胞を光学顕微鏡にて観察した。
【００５７】
ＲＡＷ２６４．７をＲＡＮＫＬで処理すると、処理後３日で顕著にＴＲＡＰ陽性細胞が認められ（図２−２）、破骨細胞への分化が促進された。ＰＴＮはこのＲＡＮＫＬによるＴＲＡＰの活性化を抑制し、破骨細胞への分化を阻害した（図２−３）。また、ＲＡＮＫＬによるＲＡＷ２６４．７細胞の破骨細胞分化がＰＴＮによって抑制されるときに、細胞の形態が類球形から紡錘形に変化し、コロニーを形成する細胞集団の間隔が空いて緩やかに広がる現象が観察された（図２−３）。
【００５８】
（実施例４：ラット骨髄由来破骨前駆細胞におけるＰＴＮの破骨細胞分化抑制作用）
ラット骨髄由来破骨前駆細胞（ホクドー社製）をＯｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＯＢＭ）に懸濁し、５×１０３個／５００μｌ／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。ラット骨髄由来破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの存在下で、破骨細胞に分化する。
【００５９】
播種の翌日、遊離型ＰＴＮ画分を培地の１／４量になるように添加した。４時間後、ＲＡＮＫＬを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦ（大腸菌組換え型、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。５日間培養した後、ＴＲＡＰアッセイに供試した。ＴＲＡＰアッセイは、実施例３と同様に実施し、染色した細胞を、光学顕微鏡にて観察した。
【００６０】
Ｍ−ＣＳＦのみを添加した細胞（図３−１）およびＲＡＮＫＬのみを添加した細胞（図３−２）は、いずれも、ＴＲＡＰ活性を示さなかった。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦを添加した細胞は、顕著にＴＲＡＰ活性を示した（図３−３）。このＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの両方を添加した細胞は、ＴＲＡＰ陽性細胞のみならず、破骨細胞を生じた（図３−３および図４）。これは、ラット骨髄由来破骨前駆細胞の破骨細胞への分化には、ＲＡＮＫＬのみまたはＭ−ＣＳＦのみの作用では不十分であり、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの両方を必要とすることを示す。
【００６１】
ＰＴＮは、このようなＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによる破骨細胞化を阻止した（図３−６）。また、Ｍ−ＣＳＦおよびＰＴＮを添加した細胞（図３−４）、ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮを添加した細胞（図３−５）、ならびにＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＰＴＮのいずれも添加しなかった細胞（図は示さず。）は、破骨細胞に分化しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、プラスミドｐＣＩ（Ｆｃ）／ｓＰＴＮまたはｐＣＩ（Ｆｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、銀染色（Ａ）またはウェスタンブロッティング（Ｂ）にて発現を確認した図である。ＰｒｏｔｅｉｎＧ共沈画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、銀染色した（Ａ）（レーンの左側の数字は、タンパク質の大きさ（ｋＤａ）を示す）。ＰｒｏｔｅｉｎＧ共沈画分をウェスタンブロッティングに供試し、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した（Ｂ）（レーンの左側の数字は、タンパク質の大きさ（ｋＤａ）を示す）。ＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質は約５０ｋＤａである。ｐＣＩ／ＰＴＮ−Ｆｃプラスミドを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＰＴＮ−Ｆｃ融合タンパク質を発現した。プラスミドｐＣＩ（Ｆｃ）は、Ｆｃ配列を含むがＡＴＧコドン配列を含まないので、Ｆｃタンパク質を発現しない。
【図２】図２は、ＰＴＮが、ＲＡＮＫＬによるＲＡＷ２６４．７の破骨細胞分化を阻害することを示す図である。本観察において、暗緑色に見えるのがＴＲＡＰ陽性細胞である。図２−１は、ＲＡＮＫＬもＰＴＮも添加していない細胞である。図２−２は、ＲＡＮＫＬのみを添加した細胞である。図２−３は、ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮを添加した細胞である。
【図３】図３は、ＰＴＮが、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるラット破骨前駆細胞の破骨細胞化を阻害することを示す図である。本観察は、図２の場合とは異なるフィルターを用いて観察したので、ＴＲＡＰ陽性細胞は赤色に見える。図３−１〜図３−６は、それぞれ、ラット破骨前駆細胞に下記の組み合わせで化合物を添加したときのＴＲＡＰ活性の結果を示す。図３−１：Ｍ−ＣＳＦ。図３−２：ＲＡＮＫＬ。図３−３：ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ。図３−４：Ｍ−ＣＳＦおよびＰＴＮ。図３−５：ＲＡＮＫＬおよびＰＴＮ。図３−６：ＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＰＴＮ。
【図４】図４は、図３−３と同じ処理をしたの細胞のうち、成熟破骨細胞に特徴的な形態を示した細胞を示す図である。ラット破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理により多数の細胞が融合して形成された巨大多核細胞（成熟破骨細胞）を生じた。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：ヒトプレイオトロフィン遺伝子。
配列番号２：ヒトプレイオトロフィン遺伝子（配列番号１）によってコードされるタンパク質。
配列番号３：ヒトプレイオトロフィンのＦｏｒｗａｒｄプライマー
配列番号４：ヒトプレイオトロフィンのＲｅｖｅｒｓｅプライマー
配列番号５：ヒトイムノグロブリンＧ１ Ｆｃフラグメント。
配列番号６：ヒトイムノグロブリンＧ１ Ｆｃフラグメント（配列番号５）によってコードされるタンパク質。
配列番号７：発現ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）の作製に用いたＤＮＡオリゴマーのセンス鎖
配列番号８：発現ベクターｐＣＩ（Ｆｃ）の作製に用いたＤＮＡオリゴマーのアンチセンス鎖
配列番号９：ヒトイムノグロブリンＧ１ ＦｃフラグメントのＦｏｒｗａｒｄプライマー
配列番号１０：ヒトイムノグロブリンＧ１ ＦｃフラグメントのＲｅｖｅｒｓｅプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項２】
プレイオトロフィンを含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項３】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項４】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項５】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項６】
プレイオトロフィンを含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項７】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項８】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項９】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項１０】
プレイオトロフィンを含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項１１】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１２】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１３】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１４】
プレイオトロフィンを含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１５】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１６】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１７】
破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項１８】
次の（１）〜（３）の工程を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法：
（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に破骨細胞誘導物質を添加する工程；
（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；および
（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程。
【請求項１９】
破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を、細胞のＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性によって判断する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
破骨前駆細胞が株化細胞である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
破骨前駆細胞が初代培養細胞である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項２】
プレイオトロフィンを含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項３】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項４】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、骨吸収の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項５】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項６】
プレイオトロフィンを含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項７】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項８】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項９】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項１０】
プレイオトロフィンを含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤。
【請求項１１】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１２】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）による破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１３】
プレイオトロフィンおよび／またはプレイオトロフィン誘導体を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１４】
プレイオトロフィンを含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１５】
次の（１）〜（４）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加されたＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（４）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％相同な塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１６】
次の（１）〜（３）からなる群より選択されるタンパク質を含む、破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤：
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質；および
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性を抑制および／または阻害するタンパク質。
【請求項１７】
破骨細胞の過剰な分化に起因する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、または高カルシウム血症である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項１８】
次の（１）〜（３）の工程を含む、破骨細胞分化の抑制剤および／または阻害剤の同定方法：
（１）プレイオトロフィンまたは試験化合物の存在下で、破骨前駆細胞に破骨細胞誘導物質を添加する工程；
（２）破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を測定する工程；および
（３）試験化合物を添加した破骨前駆細胞の破骨細胞への分化が、プレイオトロフィンを添加した破骨前駆細胞と同様に抑えられた場合、該試験化合物を破骨細胞への分化を抑制および／または阻害する試験化合物として選択する工程。
【請求項１９】
破骨前駆細胞の破骨細胞への分化の程度を、細胞のＴａｒｔｒａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）活性によって判断する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
破骨前駆細胞が株化細胞である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
破骨前駆細胞が初代培養細胞である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
破骨細胞誘導物質が、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦκＢ Ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）およびＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）である、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２３１００１（Ｐ２００７−２３１００１Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７５０９（Ｐ２００７−１７５０９）
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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