Ｅ型肝炎ウイルスのポリペプチド断片、それを含むワクチン組成物及び診断キット、並びにその使用
【課題】ワクチン組成物、およびＨＥＶポリペプチドを含むＨＥＶ感染診断用キット、ならびにＩｇＧ、ＩｇＭ、および全抗体を含む診断キット、およびＨＥＶ感染を予防、診断、および／または治療するためのその使用方法の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ−２のアミノ酸配列を含むｎ量体（ｎは２〜１８０の整数）のポリペプチド、またはその断片。また、前記断片をインフルエンザウイルスの赤血球凝集素の保存断片と融合させたキメラポリペプチド、および前記断片とＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３のエピトープポリペプチドもしくはその免疫原性活性断片との共有結合、および上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクター、発現ベクターを含む発現宿主。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ−２のアミノ酸配列を含むｎ量体（ｎは２〜１８０の整数）のポリペプチド、またはその断片。また、前記断片をインフルエンザウイルスの赤血球凝集素の保存断片と融合させたキメラポリペプチド、および前記断片とＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３のエピトープポリペプチドもしくはその免疫原性活性断片との共有結合、および上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクター、発現ベクターを含む発現宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｎ重合体ポリペプチド（Ｎは１〜１８０の整数である）の形の、配列番号１で示す、Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片；本発明のポリペプチドとインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質；Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来のエピトープを含むポリペプチド又はその免疫原性断片に結合した本発明のポリペプチド；上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター、及び本発明のポリペプチドを発現させることのできる、前記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。
【０００２】
本発明はさらに、上述のポリペプチドを含む、Ｅ型肝炎ウイルスに対処するワクチン組成物、又はＥ型肝炎ウイルス用のＩｇＧ、ＩｇＭ、もしくは全抗体診断キットを含めて、上述のポリペプチドを含むＥ型肝炎ウイルス感染用診断キット、並びにＥ型肝炎ウイルス感染の予防、診断、及び／もしくは治療のための、ワクチン組成物及び診断キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、経腸的に伝染した非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体として１９８３年に最初に確認された（Ｂａｌａｙａｎ等、１９８３年、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ第２０巻：２３ページ、）。Ｅ型肝炎は、主に、アジア、アフリカ、中央アメリカの開発途上国に特有である。先進国でのＥ型肝炎の症例は、ほとんど外国からの移民又は旅行者に見られた。散発性の症例も大規模な流行も報告されている。１９５０年代から１９９０年代の期間に、飲料水の汚染のために、Ｅ型肝炎の数件の大発生が連続して起こった（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ、１９５７年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．第４５巻：１〜３０ページ；Ｗｏｎｇ等、１９８０年、Ｌａｎｃｅｔ．第２巻：８８２〜８８５ページ；Ｍｙｉｎｔ等、１９８５年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第３４：１１８３〜１１８９ページ；Ｂｅｌａｂｂｅｓ等、１９８５年、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第１６巻：２５７〜２６３ページ；Ｈａｕ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第６０巻：２７７〜２８０ページ）。大部分のＥ型肝炎感染は、自己制限的であり、慢性に発展することはほとんどないが、妊婦については予後が重く、死亡率が１７％を上回る。（Ｔｓｅｇａ等、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ．第１４巻：９６１〜９６５ページ；Ｄｉｌａｗａｒｉ等、１９９４年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１３巻：４４〜４８ページ；Ｈｕｓｓａｉｎｉ等、１９９７年、Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．第４巻：５１〜５４ページ）。
【０００４】
１９９１年に、研究者等は、エンベロープをもたない１本鎖のプラスＲＮＡウイルスであるＨＥＶの最初の完全なゲノム配列を得た（Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ）。配列分析によって、ゲノムが７．２ｋｂであり、３つのオープンリーディングフレームを有することが示された。５’末端に位置するＯＲＦ１は、ウイルスの非構造タンパク質をコードし、３’末端に位置するＯＲＦ２は、ウイルスの主要な構造タンパク質をコードする。ＯＲＦ３ ５’末端には、ＯＲＦ１ ３’末端と重複した１ｂｐが存在する。ＯＲＦ３ ３’末端には、ＯＲＦ２末端と重複した３３９ｂｐが存在する。ＯＲＦ３が未知の機能を備えた別の構造タンパク質をコードすることが認められている（Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ；Ａｙｅ等、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２０巻：３５１２ページ；Ａｙｅ等、１９９３年、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ．第７巻：９５〜１０９ページ；Ｈｕａｎｇ等、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１９１巻：５５０〜５５８ページ；Ｒｅｙｅｓ等、１９９３年、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ Ｓｕｐｐｌ．第７巻：１５〜２５ページ）。
【０００５】
ＨＥＶ感染の検出は、長い間、主に免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）又は免疫蛍光技術に頼っていたが、このような技術は非常に複雑で高価であり、多くの研究所では実施しにくいものである。ＨＥＶゲノムがクローン化され、配列決定された後、ＥＲＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＰＣＲなどのようなより感度のよい技術が開発されて、ＨＥＶ感染の検出に使用されている。
【０００６】
血清ＨＥＶ抗体キットの開発が絶対的に必要であることは十分に認知されているが、感染したヒト又は動物が分泌するＨＥＶウイルスの濃度が非常に低いために、血清を抗原の供給源として使用することは不可能である。現在もなお、ＨＥＶ細胞培養の効率は非常に低く、これがＨＥＶを検出するために十分な抗原を利用できる可能性を制限した。したがって、ＨＥＶ抗体の検出は、依然として合成のポリペプチド又は組換え抗原に頼っている。残念なことに、多くの血清学的研究によって、合成ポリペプチド類又は異なるＨＥＶゲノム領域に由来する組換え抗原での整合性が大幅にずれていることが示された。たとえば、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ等（１９９２年、Ｌａｎｃｅｔ、第３９９巻：３２８〜３３１ページ）は、ＯＲＦ２ ３−２（Ｍ）抗原（ａ．ａ．６１３〜６６０、Ｍｅｘｉｃｏ株）を使用して、院内のＥ型肝炎ウイルス感染の症例を検出した。ＩｇＧの検出率は９１％であり、６〜１２カ月後には２７〜５０％に下がった。彼が３−２（Ｂ）（Ｂｕｒｍａ株由来の同じＯＲＦ２断片）を検出に使用したとき、検出率はほんの６４％であり、６〜１２カ月後には陽性の結果が見られなかった。それどころか、３−２（Ｍ）は、パキスタン人の対象の回復期血清と反応しないが、３−２（Ｂ）は、４．５年後に同じ症例の血清と反応した。このようなタンパク質では、抗体が陰性に逆転する場合もあれば、依然として力価が高いままである場合もあった。大腸菌中に発現したいくつかの線状エピトープを有するモザイクタンパク質を使用した場合の結果は類似していた。良好なＨＥＶ抗体キットがないことは、ＨＥＶに感染している間の抗体の動態を深くまで研究する制約になった。一般に、ＨＥＶに感染している間、特定のＩｇＧ抗体が初期の段階で検出可能になり、２〜４週間後に最高点に達し、急速に降下する。大部分は９カ月後に陰性に逆転するが、何年も後に陽性のままである患者もいる。最近では、急性相と回復期相の両方に由来する血清とも強く反応する、数種の組換え抗原がバキュロウイルス及び大腸菌中に発現されている。原則として、血清疫学調査にはこのような抗原がより適している。血清ＨＥＶ ＩｇＧの力価が、急性段階の後急速に降下するものの、なお検出可能なレベルに保たれるからである。抗体が、疾患の流行中に感染を防御することに関係しているということは特筆に価する。
【０００７】
他の手段では、現在のところ利用できる検出法が間接的な方法だけであるために、確立されたＨＥＶ ＩｇＭキットは、世界中で未だ開発されていない。間接的方法については、一方では検出結果が様々な要因によって影響されるので再現しにくく、他方では偽陽性の可能性が高く、陰性の値がより高く、又は感度が低いために結果の信頼性が低い。最近の報告によると、臨床サンプルを検出する際、ＩｇＭの結果が陽性であった場合、一般にＩｇＧも陽性であり、したがって、早期に診断されたその値は、限界があるものの、急性感染の診断特異性の向上において役立つといえる。
【０００８】
報告されているところでは、いくつかの合成ペプチド及び何らかの組換え抗原に対する抗体は、多くの感染対象において急速に消失するので、急性Ｅ型肝炎ウイルス感染の臨床的診断は、一般に臨床的な一致が高いＩｇＧ抗体に基づいているが、この方法の最も重大な欠陥は、過去の感染を最近の感染と区別できないことであり、これは、Ｅ型肝炎ウイルスが多く発生している区域においても、疫学的研究の際にＥ型肝炎ウイルス感染の有病率を評価する上でも、誤った診断をもたらすことになる。したがって、回復期血清に対する感度が高いことを特徴とする、信頼性があり、かつ感度のよい抗μ鎖ＩｇＭ診断キット及びＩｇＧ診断キットを開発することが早急に求められている。
【０００９】
近年では、高感度のＩｇＧ診断キットの開発に若干の進歩があった。Ｍａｓｔ等（１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ第２７巻：８５７〜８６１ページ）は、世界中の１０種の主要なＩｇＧ抗体ＥＩＡの包括的評価を提示している。既知の陽性血清の検出では多くのキットが実によく一致していたが、アメリカ人血液供与者の検出では、異なるキットで大きな相違があった。これは、非発生地域でのＨＥＶ有病率研究における結果の信頼性が低いことを示唆している。このようなキットの大部分の抗原は、ＨＥＶの線状エピトープを素材としていたが、２種のキットは、立体配座のエピトープを抗原として使用していた。１種目はＯＲＦ２．１（ａａ３９４〜６６０）であり、他方はバキュロウイルス中で発現させたＶＬＰ（ａａ１１２〜６０７）である。どちらの抗原も回復期抗体を検出できるが、これら２種の抗原の一致を比較した直接のデータは、今もまだ得られていない。これら２種の抗原が異なる抗体を識別することは可能である。さらに、ＶＬＰキットを使用して、流行のないアメリカで２０％近い有病率が報告され、これによってその特異性に疑いが生じたこともあった。しかし、ブタ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、ラット、野生のサル、及び飼われているサルでの陽性のＨＥＶ感染の報告、並びにメリーランド州の野生ラットとルイジアナ州の野生ラットの抗体有病率が、相違する７７％と４４％であることから、動物のＨＥＶは、その病原性による臨床疾患を引き起こし得ないものの、アメリカ人集団の抗体有病率が過小評価されている可能性はある。（Ｋａｂｒａｎｅ−Ｌａｚｉｚｉ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第６１巻：３３１〜３３５ページ）。さらに、ＯＲＦ２．１キットは、ＣＭＶ感染及び自己免疫疾患においてより高い陽性率を検出することができる。さらに、報告されているＯＲＦ２．１ポリペプチドは、ＧＳＴとのキメラタンパク質又はポリアルギニンとのキメラタンパク質であるが、実際には偽陽性の結果をもたらすことになる。
【００１０】
ＨＥＶでは細胞培養も組織培養も成功しておらず、大量のウイルスを得るための実際的な方法が未だ得られないので、遺伝子工学を通じて、旧来の死菌ワクチン又は弱毒ワクチンからサブユニットワクチン又はＤＮＡワクチンへと転換を図ることが唯一の研究手段である。
【００１１】
ＨＥＶ ＯＲＦ２は、５１４７に位置する塩基から始まって、１９８０個のヌクレオチドを有するものであり、主要な構造タンパク質であると推定されているアミノ酸６６０個のポリペプチドをコードするものであり、ウイルスのキャプシドを構成している。ＯＲＦ２タンパク質のＮ末端には、古典的なシグナル配列の後に、正の電荷を大量に帯びた領域であり、かつウイルス構築中にゲノムＲＮＡのキャプシド形成に関与すると考えられているアルギニン高含有領域が存在する。翻訳プロセスの間、ＯＲＦ２は、シグナルペプチド認識タンパク質（ＳＲＰ）の機構によって小胞体（ＥＲ）に侵入し、さらにグリコシル化され、ＥＲ内に蓄積し、次いでおそらくは揃ってキャプシドのキャプソメアを形成する。３箇所のＮ−グリコシル化部位、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−３１０、及びＡｓｎ−５６２が、ＯＲＦ２に位置している。これらは、異なるウイルス株間でも高度に保存されており、Ａｓｎ−３１０は、主要なグリコシル化部位である。ＯＲＦ２を形質移入した哺乳動物細胞ＣＯＳ、ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２は、それによって、細胞質にも膜にも見出される８８ｋＤの糖タンパク質を発現させることができる。これらのグリコシル化部位での突然変異は、ＰＯＲＦ２の細胞膜上への配置には影響を及ぼさない。しかし、シグナルペプチド配列がそこから除去された後では、細胞質中でしかＰＯＲＦ２を見出すことができない。これは、タンパク質の細胞膜上への配置にはグリコシル化でないＰＯＲＦ２の変化が必要なことを示唆している。ＨＢＶのＭＳタンパク質のように、ＰＯＲＦ２も、ゴルジ体の代わりにＥＲを介して細胞膜に直接分泌される可能性がある。形質移入した細胞の表面では、ｇｐＯＲＦ２はランダムに分布しておらず、あるゾーンに集中しているが、これはタンパク質サブユニットの合同プロセスが活性であることを示唆しており、ことによると凝集して、さらに指令された何らかの前進した形になる。ウイルスの最終的な構築／成熟には、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成が必要であるので、ＥＲの外の細胞質又は細胞膜の壁面内でこれを起こさなければならない。膜内のｇｐＯＲＦ２の蓄積は、ウイルス構築を示唆するといえる。同時に、膜上のキャプシドタンパク質の配置は、成熟したウイルスが出芽を経て細胞外へ分泌する可能性を示唆する。さらに記載すべき注目される点は、翻訳及び修飾機能を備えたｉｎ−ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＯＲＦ２の転写及び翻訳によって、８８ｋＤのｇｐＯＲＦ２を単量体と二量体の両方の形で産生できることである。ｇｐＯＲＦ２が相同的な二量体を形成する傾向があり、前記の相同的なｇｐＯＲＦ２二量体によってキャプシドのキャプソメアが構成されることが例示されている（Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻：２０７〜２１６ページ）。Ｌｉ等は、Ｆｒｏｓｔ Ｅｔｃｈｉｎｇ ｅｌｅｃｔｉｏｎ顕微鏡によって、バキュロウイルスによって発現した組換えＨＥＶ ＶＬＰが、直径２２〜２３ｎｍの６０個のｐ５０サブユニットでできた正二重面体の対称ビリオン（Ｔ＝１）を有することを発見した。この大きさの粒子の内腔は、約１ｋｂのＲＮＡを含むことができ、ＨＥＶゲノムは、長さ７．５ｋｂであるので、自然のＨＥＶは、Ｔ＞３の結晶格子構造であると推測されるが、キャプソメアの形態上の構造は類似している。Ｔ＝３サブユニットの総数は、９０個のキャプソメアである（Ｌｉ等、１９９９年、ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ）。
【００１２】
上記のことによると、ＨＥＶは、エンベロープをもたないウイルスである。ウイルスのキャプシドは、ＯＲＦ２によってコードされたタンパク質でできている。このタンパク質には、主要な免疫エピトープおよび一部の中和性エピトープが組み込まれており、サブユニットワクチンを研究する際、最も好都合な断片となる。
【００１３】
米国特許第５，８８５，７６８号のＲｅｙｅｓ等の最初の報告では、４匹のカニクイザルに、ＨＥＶ Ｂｕｒｍａ株ＯＲＦ２ Ｃ末端２／３（ａａ２２５〜６６０）を含む大腸菌中に発現させた組換えタンパク質ｔｒｐＥ−Ｃ２にミョウバンアジュバントを配合したものを、０、３０日で５０μｇ／１回分を投与することによって筋肉内注射した。別の２匹のサルを対照として使用し、アジュバントのみを与えた。４週間後、収集血液の抗体の増加に関する陽性の結果で、ウェスタンブロット法によって見出されたものはなかった。８０μｇのアジュバント未配合不溶性組換えタンパク質を投与することによる、そのうちの２匹のサルでの３回目の免疫化。４週間後、どちらのサルも陽性であった（ＷＢ）。次いで、６匹のサルを、各々が３匹のサルを含む第一群と第二群に分けたが、そのうちの２匹が３回又は２回の接種によって免疫化されており、１匹が対照である。第一群にはＢｕｒｍａＨＥＶを接種し、第二群にはＭｅｘｉｃｏＨＥＶを接種した。結果は、（１）免疫化した群ではＡＬＴが常に正常であったが、対照では免疫化前よりも６〜１０倍高く上昇した。（２）免疫蛍光法によって肝臓生検試料で検出を行った。３回の投与で免疫化し、Ｂｕｒｍａ株を接種したものを除くすべてのサルで抗原が発見された。（３）３回の投与で免疫化し、Ｂｕｒｍａ株を接種したものを除くすべてのサルで、糞便中へのウイルスの排泄が連続的に見出された。この研究の検体は少ないが、ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質が、ウイルス肝炎の生化学指数を出さないようにし、サルが野生のＨＥＶを接種された場合には、感染から完全に防御したことを示唆している。
【００１４】
Ｔｓａｒｅｖ等（１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９１巻：１０１９８〜１０２０２ページ；Ｔｓａｒｅｖ等、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１６８巻：３６９〜３７８ページ；Ｔｓａｒｅｖ等、１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ第１５巻：１８３４〜１８３８ページ）は、昆虫（ＳＦ細胞）中のバキュロウイルスを使用して、ＨＥＶ ＯＲＦ２を発現させ、細胞溶液中に２０ｎｍ〜３０ｎｍの様々な大きさのタンパク質粒子を得た。感染細胞の分裂後期には、より小さい粒子の百分率が実質的に増大する。ＷＢ法を使用して、バキュロウイルスによって発現させたＯＲＦ２を検出すると、２５ｋＤ、２９ｋＤ、３５ｋＤ、４０〜４５ｋＤ、５５〜７０ｋＤ、７２ｋＤに大きさの異なる多数の特定のバンドが検出された。イオン交換法及び分子スクリーニング法を使用して、ＨＥＶに特異的なタンパク質を精製した。細胞に組換えウイルスを感染させた後１日目に、７２ｋＤの全ＯＲＦ２ペプチドが最初に出現し、次いで徐々に消失した。２日目には、６３ｋＤ及び５５ｋＤのペプチドが出現した。５３ｋＤのペプチドは、初日に大量に細胞溶液中に出現し、３日目に最高点に達した。これは、最初の７２ｋＤのタンパク質がランダムに切断されて、５５ｋＤ（細胞溶解溶液中）及び／又は５３ｋＤ（細胞溶液）のＨＥＶタンパク質となることを示唆している。これら２種のタンパク質の配列決定によって、５５ｋＤがＯＲＦ２のａａ１１２〜６０７に位置することが示されたが、５３ｋＤがａａ１１２〜５７８に位置し、６３ｋＤがａａ１１２〜６６０に位置することも示された。ＥＬＩＳＡの結果は、５５ｋＤの活性が５３ｋＤよりも明らかに強いことを示した。昆虫内のバキュロウイルス中にａａ１１２〜６６０断片が発現した場合、６３ｋＤに加え、５５ｋＤの組換えＨＥＶタンパク質も見出される。
【００１５】
細胞を感染させてから７日目にＳＦ９細胞を収集した。タンパク質を一次精製し、ミョウバンアジュバントと併せた。次いで、１回に５０μｇのタンパク質の筋肉内注射によってカニクイザルを免疫化した。４匹には１回分を与え、他の４匹には２回分を与えた（０ｄ、２８ｄ）。最終投与の後、同じＨＥＶ系統（ＳＡＲ−５５、パキスタン人患者由来）の１０００〜１００００ＣＩＤ５０の投与量ですべてのサルに静脈内接種をした。１５週間以内の、肝臓生検材料、血清、及び大便を毎週収集した。１回投与のサルでのウイルス接種前の抗体の力価は、１：１００〜１：１００００であったが、２回投与群では、すべて１：１００００であった（精製された５５ｋＤでコートされていた）。１回投与群では、ウイルス接種後９週間で１匹のサルが麻酔事故のために死亡した（結果では計算されている）。２回投与群では、ウイルス接種後すぐに２匹のサルが原因不明で死亡した（結果では計算せず）。免疫化後の６匹のサルに、ＡＬＴの上昇もしくは肝臓生検の病理学的変化は見受けられず、ウイルス血症もなかった。１回投与群の４匹のサルでは、３匹がウイルスを排泄したが、２回投与群の２匹のサルでは、ウイルスの排泄が見られなかった。
【００１６】
イオン交換法及び分子篩法によってバキュロウイルス系に発現させた５５ｋＤのタンパク質をさらに精製して、精製が９９％超に到達するようにした。ミョウバンアジュバントと併せた後、１回分が５０μｇ、１０μｇ、２μｇ、０．４μｇ、０μｇ（対照）のタンパク質を４匹のアカゲザルにそれぞれ注射し、０及び２８日投与した。最終投与後の４週間目に、同じウイルス（ＳＡＲ−５５）をサルに接種した。免疫化群の１６匹のサルは、すべて正常であり、２μｇ投与の１匹のサル及び０．４μｇ投与の他のサルだけに、非常に軽度の病理学的変化が現われた。免疫化されたサルは、感染したが、肝炎を予防することができた。５０μｇ投与の１匹のサル及び１０μｇ投与の他のサルを除き、免疫化したすべてのサルにウイルスの排泄、及びウイルス血症も見られた。ほとんどのサルのウイルス量が制限されたが、期間は短縮されなかった。別の４匹のサルは、２×５０μｇで免疫化し、最終投与後４週間目に１００，０００ＭＩＤ５０の他のＨＥＶを接種した。結果は同様であった。４匹のサルがすべて、ＡＬＴの上昇及び病理学的変化を示したわけではなかったが、１匹のサルだけはウイルス排泄及びウイルス血症を示さなかった。ウイルス量は、明らかに減少したが、期間は短縮されなかった。著者の意見によると、これらのサルでの全面的な防御の効果は、前回よりも悪かった。接種に使用したウイルス量が一因である可能性がある。この実験でのウイルス量は、３００，０００に達したが、前回は１０００〜１００００ＭＩＤ５０であった。さらに、０．４μｇ〜５０μｇ群の抗体の力価は、接種前には差を示さなかった。
【００１７】
Ｇｅｎｅｌａｂｓ ｃｏｍｐａｎｙのスタッフは、同じ昆虫内バキュロウイルスを使用してＯＲＦ２ａａ１１２〜６６０を発現させ、大量の可溶性組換え６２ｋＤタンパク質を得た。精製した後、カニクイザルに免疫化を施すと、投与量１０００ＣＩＤ５０のウイルス（Ｍｅｘｉｃｏ株）接種から防御された（２０μｇで免疫化した３匹のサルは、罹患しなかった。２匹のサルではウイルスの排泄が見られず、１匹のサルでウイルス排泄量が減少した）。（Ｚｈａｎｇ等、１９９７年、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４巻：４２３〜８ページ。）
【００１８】
ＭｃＡｔｅｅ等（１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ第８巻：２６２〜２７０ページ）は、組換えバキュロウイルス中に発現させたＢｕｒｍａＯＲＦ２の６２ｋＤ二量体を調製した。ＨＰＬＣ−ＭＳによって、この二量体を別々に分離して、５６．５ｋＤと５８．１ｋＤの２本のペプチドにした。ペプチド集合体のフィンガープリント解析では、この２本のペプチドのＮ末端が同じａａ１１２であり、Ｃ末端がａａ６３７及びａａ６５２で異なっていることが示された。さらに、５６．５ｋＤのタンパク質は、非常に良好な免疫原であった。
【００１９】
オーストラリアのＡｎｄｅｒｓｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．第８１巻：１３１〜１４２ページ；Ｌｉ等、１９９４年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．第３２巻：２０６０〜２０６６ページ；Ｌｉ等、１９９７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第５２巻：２８９〜３００ページ；Ｌｉ等、２０００年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第６０巻：３７９〜３８６ページ）は、大腸菌中に発現させたＯＲＦ２のａａ３９４〜６６０（ＯＲＦ２．１）を使用した。この産物は、ＧＳＴとのキメラタンパク質又はポリアルギニンタンパク質であり、高次構造の回復期エピトープを形成し得る。このエピトープは、回復期血清を非常に高率で検出できるが、断片のＮ末端側に伸長又は切断があった場合に消失する。ラットを組換えＯＲＦ２．１タンパク質で免疫化した後３０週目の血清を使用して、バキュロウイルス中に発現させたＶＬＰを被覆抗原として有する回復期の患者からの血清にブロッキングをかけた。阻止率は、８１％〜８６％に達することになる。ＯＲＦ２．１タンパク質で単クローン抗体を調製すると、ＯＲＦ２．１の立体配座エピトープを識別できる２種の単クローン抗体２Ｅ２及び４Ｂ２と、識別可能な５種の単クローン抗体らしいものを得た。抗原としてＶＬＰを有する回復期血清に２Ｅ２又は４Ｂ２のどちらを使用してブロッキングをかけても、阻止率は、６０％に達し得る。これは、これら２種の単クローン抗体が、エピトープを識別でき、回復期血清中で抗体によって識別されるエピトープの主要な構成要素であることを示唆している。別のデータによって、ＯＲＩＦ２．１が、ＶＬＰにかなり類似した主要なエピトープ構造を有することが示された。このエピトープへの抗体は、ＨＥＶ感染血清中に長期間存在し得る。このエピトープは、重要な防御エピトープであるが、ＯＲＦ２．１についての動物の防御実験は、今までに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，８８５，７６８号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｂａｌａｙａｎ等、１９８３年、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ第２０巻：２３ページ
【非特許文献２】Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ、１９５７年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．第４５巻：１〜３０ページ
【非特許文献３】Ｗｏｎｇ等、１９８０年、Ｌａｎｃｅｔ．第２巻：８８２〜８８５ページ
【非特許文献４】Ｍｙｉｎｔ等、１９８５年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第３４：１１８３〜１１８９ページ
【非特許文献５】Ｂｅｌａｂｂｅｓ等、１９８５年、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第１６巻：２５７〜２６３ページ
【非特許文献６】Ｈａｕ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第６０巻：２７７〜２８０ページ
【非特許文献７】Ｔｓｅｇａ等、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ．第１４巻：９６１〜９６５ページ
【非特許文献８】Ｄｉｌａｗａｒｉ等、１９９４年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１３巻：４４〜４８ページ
【非特許文献９】Ｈｕｓｓａｉｎｉ等、１９９７年、Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．第４巻：５１〜５４ページ
【非特許文献１０】Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ
【非特許文献１１】Ａｙｅ等、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２０巻：３５１２ページ
【非特許文献１２】Ａｙｅ等、１９９３年、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ．第７巻：９５〜１０９ページ
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇ等、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１９１巻：５５０〜５５８ページ
【非特許文献１４】Ｒｅｙｅｓ等、１９９３年、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ Ｓｕｐｐｌ．第７巻：１５〜２５ページ
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ等、１９９２年、Ｌａｎｃｅｔ、第３９９巻：３２８〜３３１ページ
【非特許文献１６】Ｍａｓｔ等、１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ第２７巻：８５７〜８６１ページ
【非特許文献１７】Ｋａｂｒａｎｅ−Ｌａｚｉｚｉ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第６１巻：３３１〜３３５ページ
【非特許文献１８】Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻：２０７〜２１６ページ
【非特許文献１９】Ｌｉ等、１９９９年、ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ
【非特許文献２０】Ｔｓａｒｅｖ等（１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９１巻：１０１９８〜１０２０２ページ
【非特許文献２１】Ｔｓａｒｅｖ等、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１６８巻：３６９〜３７８ページ
【非特許文献２２】Ｔｓａｒｅｖ等、１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ第１５巻：１８３４〜１８３８ページ
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ等、１９９７年、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４巻：４２３〜８ページ
【非特許文献２４】ＭｃＡｔｅｅ等、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ第８巻：２６２〜２７０ページ
【非特許文献２５】Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．第８１巻：１３１〜１４２ページ
【非特許文献２６】Ｌｉ等、１９９４年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．第３２巻：２０６０〜２０６６ページ
【非特許文献２７】Ｌｉ等、１９９７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第５２巻：２８９〜３００ページ
【非特許文献２８】Ｌｉ等、２０００年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第６０巻：３７９〜３８６ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の概要）
本発明の一態様では、ｎ重合体ポリペプチド（ｎは１〜１８０の整数である）の形の、Ｅ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２（配列番号１で示す）のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片であって、前記の配列番号１で示すＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２又はその断片のアミノ酸を含むポリペプチドが、
１）アミノ末端がアミノ酸残基１１３と４６９の間から出発し、カルボキシル末端がアミノ酸残基５９６と６６０の間で終結しているポリペプチド、
２）アミノ末端がアミノ酸残基３７０と４６９の間から出発し、カルボニル末端がアミノ酸残基６０１と６２８の間で終結しているポリペプチド、
３）アミノ末端がアミノ酸残基３９０と４５９の間から出発し、カルボキシル末端がアミノ酸残基６０１と６１０の間で終結しているポリペプチド、
４）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２４７、
５）配列番号１のアミノ酸残基４２９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３２、
６）配列番号１のアミノ酸残基４３９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２２、
７）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０１、
８）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３５Ｎ、
９）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６１８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２５Ｎ、
１０）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０９Ｎ、
１１）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０８Ｎ、
１２）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチドＮＥ２Ｉ、
１３）配列番号１のアミノ酸残基３９０〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２１７Ｄ、
１４）配列番号１のアミノ酸残基３７４〜６１８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０５、
１５）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド１８９、
１６）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド１８８、
１７）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
１８）Ｎ末端にＭｅｔが付加され、Ｃ末端の３’末端上のアミノ酸残基６０３のＰｒｏにおいて、５’〜３’方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されてＣ末端が修飾されている、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
ａ）Ｘがアミノ酸残基３９４である場合の、配列番号２で示す前記ポリペプチド、すなわちＮＥ２、
ｂ）Ｘがアミノ酸残基４１４である場合の、配列番号３で示す前記ポリペプチド、すなわち１９３Ｃ、
ｃ）Ｘがアミノ酸残基４２９である場合の、配列番号４で示す前記ポリペプチド、すなわち１７８Ｃ、
ｄ）Ｘがアミノ酸残基４３９である場合の、配列番号７で示す前記ポリペプチド、すなわち１６８Ｃ、
ｅ）Ｘがアミノ酸残基４４９である場合の、配列番号８で示す前記ポリペプチド、すなわち１５８Ｃ、
ｆ）Ｘがアミノ酸残基４５９である場合の、配列番号９で示す前記ポリペプチド、すなわち１４８Ｃ、
ｇ）Ｘがアミノ酸残基４６９である場合の、配列番号１０で示す前記ポリペプチド、すなわち１３８Ｃが含まれるもの
からなる群から選択されているポリペプチドを提供する
本発明の別の態様では、上の１）から１８）で表される前述のポリペプチドのいずれか１つとの相同性が少なくとも８０％であり、抗原性や免疫原性など、生物学的特性がほぼ同一であるポリペプチドをさらに提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明はさらに、上述の本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも提供する。もう１つの態様では、本発明はさらに、本発明のポリペプチドを発現させることのできる、上記の組換え発現ベクターのいずれか１種で形質転換した宿主細胞も提供する。
【００２４】
本発明の別の態様では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドもしくはその任意の組合せ、及び場合により薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物をさらに提供する。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素抗原の保存断片を含むキメラタンパク質をさらに提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物であって、本発明のポリペプチドの１種とインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質、並びに任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／又はアジュバントを含む組成物も提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物にワクチン接種を施してＥ型肝炎ウイルス感染を予防するための、上述のワクチン組成物の使用を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するための方法であって、対象に、予防及び／もしくは治療有効量の少なくとも１種の上述のポリペプチド、又は上述のポリペプチドの少なくとも１種及びインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片からなるキメラタンパク質を投与することを含む方法も提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明はさらに、診断に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含む、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断するための診断キットも提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断するための診断キットであって、診断に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含み、さらにＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来免疫原性エピトープを含有するポリペプチド又はその免疫原性断片も含み、前記のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来免疫原性エピトープを含有するポリペプチド又はその免疫原性断片が、任意選択で前記ポリペプチドに共有結合しているキットも提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断する方法であって、抗原と抗体の相互作用に適する条件下、上述の診断キットと検出対称の検体とを接触させることを含む方法も提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体において、Ｅ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法、Ｅ型肝炎ウイルスに対するＩｇＧ抗体を検出する方法、及びＥ型肝炎ウイルスに対するＩｇＭ抗体を検出する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ポリペプチド２０１を発現するプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１の作製を示す略図である。
【図２】発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１で形質転換した誘導大腸菌の培養物可溶化液（培地を遠心分離にかけるステップ、沈殿した細胞を収集するステップ、次いでペレットを０．１％のＳＤＳを含む供給液で再懸濁させるステップ、これを沸騰湯中で１０分間さらに処理するステップ、次いで１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離するステップ、上清を取り出して測定するステップを経た）に関して、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色）によって分析した結果を示す図である。レーン１および２は、それぞれ２種の異なる細菌培養物可溶化液を含む。Ｕｖｉゲル画像処理システム（ＵＶＩｔｅｃ，ｌｔｄ．、型式ＤＢＴ−０８）によって解析すると、発現された産物は総タンパク質のほぼ３５％までになる。
【図３】４回分のポリペプチド２０１からの精製ポリペプチド２０１の封入体の２Ｍおよび４Ｍ尿素溶液に関する、クーマシーブルーＲ２５０で染色を行った１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の解析結果を示す図であり、前記試料は、発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１が組み入れられている組換え大腸菌から得る。この結果は、二量体ポリペプチドの割合が１０％〜６０％に変動しており、再生を経て二量体ポリペプチドを形成したポリペプチド２０１が若干あることを示している。再生割合は、１×ＰＢＳ（２０×ＰＢＳ（１Ｌ）：Ｎａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ、７３．３４４ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、４ｇ；ＮａＣｌ、１６３．６３２ｇ；ＫＣｌ、４．０２４ｇ、ｐＨ７．４５）中で再生した試料よりも低い。図４で示すように、二量体の百分率は９９％である。
【図４】ポリペプチド２０１とＨＥＶ感染患者からの血清のウェスタンブロット分析結果を示す図である。レーン１〜３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ対照であり、レーン１はタンパク質分子量マーカーであり、レーン２は、１×ＰＢＳ中の再生ポリペプチド２０１試料であり、レーン３は、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生ポリペプチド２０１であり、レーン４および５は、それぞれレーン２および３の試料に対応するウェスタンブロット結果である。
【図５】前述のポリペプチド２０１の、動的光散乱計による水和状態の動的半径から得た結果を示す図であり、ポリペプチド２０１は、ゲル濾過ＨＰＬＣによって予め精製し、１０分間２００００ｇで遠心分離し、０．１ｕｍの濾過膜で濾過してある。
【図６】ポリペプチド２０８Ｎ、２０９Ｎ、および２２５Ｎと、マウスのＭａｂ１Ｆ６、２Ｃ９、および３Ｆ５との反応のウェスタンブロット結果を示す図である。レーン１、２、３はそれぞれ、ポリペプチド２０８Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン４、５、６はそれぞれ、ポリペプチド２０９Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン７、８、９はそれぞれ、ポリペプチド２２５Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン１０は、対照としての単量体ポリペプチド２０１である。
【図７】様々な投与量の（フロイントアジュバントを含有する）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図８】様々な投与量の（アジュバントを含まない）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図９】様々な投与量の（アジュバントとして水酸化アルミニウムを含有する）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、および１０Ｄは、それぞれＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、およびＮｏ．１３にグループ分けしたアカゲザルの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。これらの対象動物にはすべて、静脈内注射によってＨＥＶを接種している。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。この結果は、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、およびＮｏ．３の群のサル血清中に、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧがＧＥＮＥＬＡＢＳ−ＩｇＧおよびＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧより５〜１０日早く存在していること、ならびにＮｏ．１３のサルの血清において抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧは検出可能であるが、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧおよびＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧは、ＮＯ．１３のサル血清中に検出されないことを例示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
別段の指示がない限り、本明細書で使用する用語又は術語は、当技術分野で通常使用されているものと同じである。細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学的手順における通常の製造が、当技術分野で定型化した技術として実施される。本発明では、別段の指示がない限り、本明細書で使用するこれらの用語は、以下のような意味である。
【００３５】
「Ｅ型肝炎ウイルス」又は「ＨＥＶ」は、ｉ）水系感染による肝炎を引き起こし、ｉｉ）血清学的特性に関して、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）と区別し、ｉｉｉ）ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に挿入された１．３３ｋｂのｃＤＮＡに相同的なゲノム領域を含むウイルス、ウイルスの型、又はウイルスのクラスを指し、前記プラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に目録番号６７７１７で保管されている大腸菌株の中に含まれている。
【００３６】
本発明のポリペプチド
一態様では、本発明は、驚くべきことに、抗体との十分な反応性及び／又は免疫原性を有する一連のＨＥＶポリペプチド断片であり、配列番号１で示すＨＥＶ ＯＲＦ２のアミノ酸配列中に含まる断片を提供する。個々の断片の名称は、実施例６の表１に出ている。
【００３７】
本発明における、アミノ酸配列内の配置によるアミノ酸残基の番号付けは、国際純正及び応用化学連合及び国際生化学連合、Ｊｏｉｎｔ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、「アミノ酸及びペプチドの命名及び記号表示（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．第５６巻、５９５〜６２４ページ（１９８４年）の発番方式に従う。具体的には、配列番号１のコード出発部位Ｍｅｔを１位と示し、５’から３’の方向に大きくなる。
【００３８】
本発明の一態様では、ｎ−重合体ポリペプチド（ｎは１〜１８０の整数である）の形の、配列番号１で示す、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドを提供する。ｎが２であるとき、前記ポリペプチドは二量体ポリペプチドであり、ｎが３であるとき、前記ポリペプチドは三量体ポリペプチドであり、ｎが４であるとき、前記ポリペプチドは四量体ポリペプチドであり、以下同様である。
【００３９】
本発明では、配列番号１で示すアミノ酸配列を含む前記ポリペプチド断片のアミノ末端（５’末端）は、アミノ酸残基１１３と４６９の間、好ましくはアミノ酸残基３７０と４６９の間、より好ましくはアミノ酸残基３９０と４５９の間から出発し、前記ポリペプチドのカルボキシル末端（３’末端）は、アミノ酸残基５９６と６６０の間、好ましくはアミノ酸残基６０１と６２８の間、より好ましくはアミノ酸残基６０１と６１０の間で終結する。具体的には、本発明の好ましいポリペプチドは、ポリペプチド２４７、ポリペプチド２３２、ポリペプチド２２２、ポリペプチド２０１、ポリペプチド２３５Ｎ、ポリペプチド２２５Ｎ、ポリペプチド２０９Ｎ、ポリペプチド２０８Ｎ、ポリペプチドＮＥ２Ｉ、ポリペプチド２１７Ｄ、ポリペプチド２０５、ポリペプチド１８９、ポリペプチド１８８、及び配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００４０】
本発明はさらに、Ｎ末端にＭｅｔが付加され、Ｃ末端の３’末端上のアミノ酸残基６０３のＰｒｏにおいて、５’〜３’方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されてＣ末端が修飾されている、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関するものであり、これには、ａ）ＮＥ２、ｂ）１９３Ｃ、ｃ）１７８Ｃ、ｄ）１６８Ｃ、ｅ）１５８Ｃ、ｆ）１４８Ｃ、ｇ）１３８Ｃが含まれる。
【００４１】
別の態様では、本発明はさらに、前述のポリペプチドのいずれか１種との相同性が少なくとも８０％であり、抗原性や免疫原性など、生物学的特性がほぼ同一であるポリペプチド、すなわち、本発明のポリペプチドの派生物に関する。具体的には、このポリペプチドは、前記ポリペプチドのアミノ酸が、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と共に、当該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に隣接する、自然配列でないアミノ酸を含むが、それでも抗原性や免疫原性など、生物学的特性が当該ポリペプチドとほとんど類似したままであるという条件の本発明のポリペプチド派生物であると考えられる。したがって、同じ物に相当するＤＮＡ断片を本発明の派生ＤＮＡと称する。たとえば、発現及び／又は精製の目的のために、そのＮ末端に開始アミノ酸（メチオニン）又は他のリーディングペプチド及び／もしくはシグナルペプチドを加える、あるいはそのＣ末端にいくつかのヒスチジンを加えることによってその精製が促進される。
【００４２】
本発明はさらに、抗原性及び／もしくは免疫原性など、生物学的特性が前述のポリペプチドのいずれか１種と同一であるポリペプチド、又は前述のポリペプチドのいずれか１種との配列同一性が少なくとも８０％であるポリペプチドも考えている。用語「同一性百分率」は、最適に並べ合わせて得た２種の比較しようとする配列間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率を表すものとし、この百分率は単に統計的なものであり、２配列間の相違は、ランダムに、かつその全長にわたって分布している。２種のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の配列比較は、その各配列を最適に並べ合わせた後にこれらの配列を比較することによって従来どおりに実施し、局所領域の配列類似性を特定及び比較するためには、区分又は「比較のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」によって前記の比較を行う。比較のための最適な配列の並べ合わせは、手作業でなく、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）のＡｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．第２巻：４８２ページの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３ページの局所相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８５巻：２４４４ページの類似性検索法、並びにこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（米国ウィスコンシン州マディソン５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって生じさせる。
【００４３】
２種の核酸配列又はアミノ酸配列の同一性百分率は、最適に並べ合わせたその２種の配列を比較することによって決定するが、その２種の配列の最適な並べ合わせでも、比較対象の核酸配列又はアミノ酸配列が基準配列に対して付加又は欠失を含んでいるかもしれない。同一性百分率は、２種の配列間でヌクレオチド又はアミノ酸残基が一致する同一位置の数を決定し、これを比較する位置数で割り、得られた結果を１００倍することによって計算して、この２種の配列間の同一性百分率を得る。
【００４４】
たとえば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌから入手できるプログラムＢＬＡＳＴ「ＢＬＡＳＴ２配列」が使用できるが、これでは、パラメータはデフォルト（特に、空のギャップペナルティーは５、伸長のギャップペナルティーは２であり、行列はプログラム「ｂｌｏｓｕｍ６２」などによって得る）であり、並べ合わせる２種の配列間の同一性百分率は、このプログラムによって直接に計算される。
【００４５】
本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、化学的合成方法や組換えＤＮＡ技術など、当技術分野で知られている方法によって調製できる。好ましくは、本発明のポリペプチドの調製方法は、組換えＤＮＡを発現させることによって行うことができる。組換えタンパク質を調製する方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書で詳細に述べる必要はないが、実施例中の方法を参照することもできる。組換えタンパク質の産生に使用できる細胞に関して言及すべきものとしては、細菌細胞（Ｐ．Ｏ．Ｏｌｉｎｓ及びＳ．Ｃ．Ｌｅｅ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５２０〜５２５ページ）、酵母細胞（Ｒ．Ｇ．ｂｕｃｋｈｏｌｚ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５３８〜５４２ページ）、動物細胞、特に哺乳動物細胞培養物（Ｃ．Ｐ．Ｅｄｗａｒｄｓ及びＡ．Ａｒｕｆｆｏ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５５８〜５６３ページ）、及び昆虫細胞がある。昆虫細胞での方法については、たとえば、バキュロウイルス（Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５６４〜５７２ページ）を参照されたい。これに関して、本発明はさらに、上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも提供する。本発明はさらに、そこに含まれるヌクレオチド配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現させることのできる、上述の組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞も提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態では、大腸菌を使用して、次の本発明のポリペプチド、すなわち、ポリペプチド２４７、ポリペプチド２３２、ポリペプチド２２２、ポリペプチド２０１、ポリペプチド２３５Ｎ、ポリペプチド２２５Ｎ、ポリペプチド２０９Ｎ、ポリペプチド２０８Ｎ、ポリペプチドＮＥ２Ｉ、ポリペプチド２１７Ｄ、ポリペプチド２０５、ポリペプチド１８９、ポリペプチド１８８、及びポリペプチドａ）ＮＥ２、ｂ）１９３Ｃを個々に発現させる。
【００４７】
前記ポリペプチドの単量体と二量体の比、重合体ポリペプチドの生成量、及びその個々のラジウムを測定する（詳細は実施例６を参照のこと）。結果として、発現した産物は、リフォールディングされる傾向があることが示されている。リフォールディング後に溶液中に安定な重合体が自己生成する能力によって、ＨＥＶを予防及び／又は治療するためのワクチンとして使用するのに特に適する本発明のポリペプチドができる。本発明の実施形態の１つでは、ある試験で、二量体、三量体、及び四量体を含む重合体が検出されている。現在の方法では限度があるが、推定上の三量体は、実際には二量体と四量体の適切な比の混合物でできている可能性がある。方法論が向上することによって、本発明のポリペプチドがより大きなポリペプチドを生成し得ることも想定できる。刊行された参照文献（Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第７０巻：２０７〜２１６ページ；Ｌｉ等、１９９９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ）から推論すると、自然のＨＥＶは９０個の小粒子からなり、各小粒子がＯＲＦ２ポリペプチドの二量体である可能性が高い。したがって、本発明のポリペプチドは、最高で１８０重合体のポリペプチドである重合体、又はそれよりも長い重合体を形成し得ると予想するのが妥当であり、ウイルスの構造を知る上での進展となる。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態では、封入体の形のポリペプチド２０１が大腸菌によって高い収率で発現されるが、発明者は、驚くべきことに、前記封入体がｐＨ７．４５のＰＢＳ緩衝液中で自発的に自己再生でき、これによって、塩酸グアニジンを加え、次いで多段階の透析にかけるステップを含めて、実質的に回収率を低下させる、時間がかかりかつ冗長な従来の変性／再生プロセスが回避されることを発見した。その上、大腸菌によって同時に発現される他の望ましくないタンパク質封入体は、自発的に自己再生できないので、単に遠心分離し、上清を回収することによって、本発明の問題のタンパク質が実質的に精製できる。
【００４９】
本発明のポリペプチドとインフルエンザウイルス由来赤結集凝集素抗原の保存断片からなるキメラタンパク質
本発明の別の態様では、上述のポリペプチドのいずれか１種とインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質も提供する。赤血球凝集素抗原（以下ではＨＡと示す）は、２種のインフルエンザウイルス表面抗原の１つであり、対象血清中のインフルエンザウイルスに対する抗体を特異的に検出する際に使用される最もよく導入される抗原である。動物にＨＡをワクチン接種して産生させた抗体によって、レシート（ｒｅｃｅｉｐｔ）がインフルエンザウイルスに再感染するのを有効に予防できることは知られている。したがって、ＨＡに対する抗体が集団の大部分に与えられていると考えるのが妥当である。これまでの報告（ＭｃＥｗｅｎ Ｊ．等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２年；第１０巻（６）：４０５〜１１ページ）によると、エピトープ９１〜１０８ａａは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ３株すべてのＨＡ遺伝子中にある保存アミノ配列である。本発明の好ましい一実施形態ではまず、遺伝子工学によって、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなど、免疫原性の高い本発明のＨＥＶ ＯＲＦ２遺伝子のポリペプチド断片に、ＨＡ遺伝子（９１〜１０８ａａ）を柔軟に連結して、原核生物発現系、特に大腸菌中でのキメラ発現を確立させる。次いで、予めインフルエンザウイルスを感染させることによって産生させたＨＡ抗体で追加免疫を行って、力価の高い防御的な抗ＨＥＶ抗体を得る。この方法では、本発明のポリペプチドのＯＲＦ２断片だけを含むワクチンに優るＨＥＶワクチンが得られる。
【００５０】
本発明での教示を考えて、当分野の技術者は、ＨＡ遺伝子中の他の保存断片から、本発明のワクチン組成物に有用なエピトープを選沢することもできる。ＨＡの特定のエピトープと本発明のポリペプチドを連結する特定の柔軟なリンカーについては、適切なペプチド断片又はその類似体からなっていてよいが、ただし、本発明のポリペプチドと選択されたＨＡ断片の連結を助長し、哺乳動物のＨＥＶ感染の予防／治療に関して本発明のポリペプチドの使用にほとんど影響を及ぼさないものとする。本発明のポリペプチドとＨＡを連結するリンカーの選択が、主として選択された本発明のポリペプチドの特性に応じて決まることは理解されるはずである。たとえば、ＨＡに連結することにした選択された本発明のポリペプチドに応じて、異なるリンカーを選択すればよい。本発明では、使用するＨＡの保存断片がアミノ酸残基９１〜１０８からの断片であることが好ましい。
【００５１】
免疫原としての本発明のポリペプチドと選択したＨＡ断片を連結するリンカーは、化学合成技術など、従来の合成技術によって望ましく合成することができる。さらに、当分野の技術者には、自動ペプチド合成装置によるｔ−ＢＯＣ法など、標準の化学的方法に従ってペプチドを合成することもできる（たとえば、Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第７９巻：４４２７ページ、１９５７年を参照のこと）。しかし、ペプチドは、タンパク質を化学的に加水分解しても、他の知られている方法によっても産生できる。
【００５２】
あるいは、本発明のポリペプチドとＨＡのキメラタンパク質は、ＨＡ断片及び本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子の核酸配列で形質転換した宿主細胞によって産生させることができ、前記ＤＮＡ分子は組換えＤＮＡ技術など、従来の遺伝子工学的方法によって宿主微生物又は宿主細胞中でクローン化することによって得られる。形質転換した細胞での組換え技術によって生成させる場合、得られる組換えキメラタンパク質は、型通りの方法によって培地もしくは宿主細胞、又はその両方から精製及び回収できる。組換え法によって産生された前記キメラタンパク質は、組換えＤＮＡ技術による組換え産生の際、得られるペプチドを細胞体又は培地からほとんど分離できる程度に単離される。さらに、得られるペプチドのためのコード配列は、合成によって、あるいは知られている方法に従ってウイルスＲＮＡを使用し、又はそのｃＤＮＡを含む入手可能なプラスミドを使用することによって調製できる。
【００５３】
この方法における使用では、上述のキメラタンパク質は、その産生を増大させ、又はその精製を促進する目的で、一般に知られている作製物向けにも他の作製物向けにも設計できる。適切な系及びベクターは知られており、公的に入手でき、又は大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、哺乳動物、酵母、昆虫細胞、及び植物細胞など、様々な微生物及び細胞中のクローン化及び発現キメラペプチドが市販されている。
【００５４】
組換え又は合成によって産生されたキメラタンパク質は、型通りの精製方法によって精製できる。当分野の技術者には、問題の用途に合致するポリペプチドの所望の純度が容易に決定できる。
【００５５】
ワクチン組成物
別の態様では、本発明はさらに、少なくとも１種の本発明のポリペプチドもしくはその何らかの併用物と、任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントとを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物も提供する。
【００５６】
さらに別の態様では、本発明はさらに、本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルスの赤血球凝集素抗原由来保存断片を含有するキメラタンパク質と、任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントとを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物も提供する。
【００５７】
本発明のさらに別の態様では、哺乳動物にワクチン接種を施してＥ型肝炎ウイルス感染を予防する、上記のワクチン組成物の使用も提供する。
【００５８】
本発明では、接種又は治療の対象となる哺乳動物には、それだけに限らないが、ヒト、及びヒヒ、類人猿、サルなど、他の霊長類、ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウスなど、実用動物、並びにネコ、イヌなど、ペット類が含まれる。前記ワクチン組成物は、治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含有し、前記の有効量は、ある期間投与した後、ＨＥＶに感染した対象を有効に治療し、又は対象のＨＥＶ感染を予防するのに十分な量である。
【００５９】
本発明のワクチン組成物は、単独で使用することも、医薬用又は予防法向け処方の成分として使用することもでき、任意選択で、放出制御剤を含む、薬剤として許容される賦形剤を含有する。前記賦形剤はさらに、ＨＥＶ感染を治療及び／又は予防するための投与に適する薬剤として許容される媒介物又は希釈剤を含んでもよい。薬剤として許容される適切な媒介物とは、生物学的に不活性かつ／又は非毒性のものを指す。所望の用途に従って、当技術分野で知られている様々な媒介物が選択できる。通常、前記媒介物は、それだけに限らないが、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、オルトリン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ミョウバン、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、及び水からなる群から選択できる。さらに、媒介物又は希釈剤は、単独又はパラフィンとの併用で、モノステアリン酸グリセリル／ジステアリン酸グリセリルなど、放出制御性物質をさらに含んでよい。さらに、可溶性ガラスを含む従来の徐放性重合体製剤も使用できる。
【００６０】
さらにまた、所望時には、少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含む本発明のワクチン組成物は、他の治療／予防薬をさらに含んでもよい。たとえば、前記組成物は、ＨＥＶ感染の治療又は予防で有用な様々な薬品の「カクテル混合物」を含んでよい。このようなカクテル混合物は、インターフェロン、ヌクレオチド類似体、及び／又はＮ−アセチル−システインなど、他の薬品をさらに含んでよい。
【００６１】
少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、任意選択で、アジュバントやサイトカインなど、対象における抗体及びＴ細胞の応答をさらに誘導するのに有用な免疫系調節薬をさらに含んでもよい。前記調節薬には、従来のミョウバンを主体としたアジュバント、ムラミルジペプチド、保存剤、化学安定剤、又は他の抗原タンパク質が含まれる。一般に、安定剤、アジュバント、又は保存剤などは、所望の適用例での効果が最高の処方を最も効果的に決定する。適切な保存剤には、クロリルブチノール（ｃｈｌｏｒｙｌｂｕｔｙｎｏｌ）、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、グリセリン、及びフェノールが含まれる。
【００６２】
本発明のワクチン組成物を使用して哺乳動物のＨＥＶ感染を予防及び／又は治療する方法
別の態様では、本発明は、対象に予防及び／又は治療に有効な量の本発明のポリペプチド、又は少なくとも１種の本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルス赤血球凝集素の保存断片からなるキメラタンパク質を投与することを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療する方法を提供する。特に、前記方法は、対象に本発明のワクチン組成物を投与するステップを含む。本発明が選択する保存断片は、９１〜１０８個のアミノ酸残基からのアミノ酸断片であることが好ましい。
【００６３】
これらの組成物の適量は、所望の応答レベルに基づいて決定してよい。一般に、本発明のポリペプチドを含む組成物は、約５ｕｇと約２００ｕｇの間の粒子を含有してよい。このような組成物は、１回又は一続きの接種、たとえば、２〜６カ月間隔で３回の接種として投与してよい。また適切な投与量は、単剤治療として投与する場合、患者の健康状態、体重、又は年齢、並びに免疫原成分の従来の投与量などの要因を考慮に入れて、治療を行う医師の判断によって決定してよい。患者の状態が改善し、又は所定の病原体への暴露の増加が見込まれれば、本発明のポリペプチドを含む維持量の組成物を必要に応じて投与すればよい。その後、投与量、投与頻度、又はその両方を、所望の効果が保たれるレベルに減らせばよい。その時に、治療を止めるべきである。しかし、所定の好ましくない状態が再発すれば、各個体に長期間の断続的な治療が求められることもある。
【００６４】
本発明のポリペプチドを含む組成物は、たとえば非経口投与、特に筋肉内又は皮下、並びに経口投与など、何らかの適切な経路によって投与してよい。経肺、経鼻、点耳、経肛門、経皮、点眼、静脈内、動脈内、腹腔内、経粘膜、舌下、皮下、脳内など、他の経路を使用してもよい。
【００６５】
本発明のワクチン組成物の調製をして、液状の溶液又は懸濁液としての注射用組成物又はワクチンを製剤すればよい。注射の前に液体になる溶液又は懸濁液に適する固体剤形を調製してもよい。ある実施形態では、製剤が、放出を制御し、かつ／又は送達を長引かせるために、乳化されていても、リポソーム又は可溶性ガラスに封入されていてもよい。あるいは、製剤は、エアロゾル又はスプレーの形でもよい。製剤は、経皮パッチに含まれていてもよい。活性成分は、薬剤として許容され、活性成分と適合するいくらかの医薬添加物と混合してよい。医薬添加物には、たとえば、フロイント不完全アジュバント、細菌性のリポ多糖体、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、レシチン、緩衝物質、セルロースを素材とした物質、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００６６】
生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は全抗体を検出する診断キット及び方法
本発明のポリペプチドは、生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は全抗体の存在を検出するために使用でき、既存の検出キット又は検出法より感度及び特異性が高いことが特徴である。したがって、本発明は、抗体／抗原相互作用に適する条件下、検出すべき検体と検出に有効な量の本発明のポリペプチドを接触させるステップを含む、生物検体におけるＨＥＶ感染の存在を判定する方法を提供する。
【００６７】
本発明で検出対象となる生物検体を供与するものには、それだけに限らないが、ヒト、及びヒヒ、類人猿、サルなど、他の霊長類、ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウスなど、実用動物、並びにネコ、イヌなど、ペット類が含まれる。
【００６８】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを判定する診断キットであって、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含み、望むなら、前記ポリペプチドは、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出対象の生物検体のＩｇＧに指向性のある、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＧ、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＧ抗体用検出キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７０】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７１】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定する診断キットであって、検出対象の生物検体に由来するＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＭを含み、望むなら、前記捕捉抗体は、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の本発明のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＭ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＭ抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７３】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７４】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定する診断キットであって、検出対象の生物検体に由来するＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＭを含み、望むなら、前記捕捉抗体は、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の本発明のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態では、検出対象の前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＭ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＭ抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７６】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７７】
本発明のさらにまた別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を判定する診断キットであって、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含み、望むなら、前記ポリペプチドは、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；請求項１に記載のポリペプチドから選択された、支持体表面に予め塗布するための前記ポリペプチド、及び請求項１に記載のポリペプチドから選択された検出可能な標識ポリペプチドが同じポリペプチドでも異なるものでもよいキットを提供する。
【００７８】
より具体的には、本発明の全抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７９】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００８０】
当技術分野では、前述の診断キットにおいて、様々な市販品を得ることも、様々な動物を利用する方法によって型通りに産生することもできる抗ヒトＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＭを使用することが知られている。あるいは、検出対象の生物検体を供与する特定の動物に対する抗ＩｇＧ又は抗ＩｇＭを使用するが、これは、関係のある動物を利用することによって生成できる。抗体を調製する目的では、選択される動物には、それだけに限らないが、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ブタなどが含まれる。標識化のための前記の検出可能な標識を単独又は他の組成物もしくは化合物との併用で使用すると、検出可能なシグナルが得られて、検体中の問題の物質の存在を視覚化できる。前記の検出可能な標識は、検出の技術分野で知られており、かつ容易に入手できる材料でよく、それには、これだけに限らないが、酵素マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカーなどが含まれる。したがって、本発明は、検出標識を特定の選択に限定するものではなく、当技術分野で知られている検出法がすべて含まれるものと考える。利便性を考えて、前記検出剤は、キットの形で提供できる。
【００８１】
前記キットは、任意選択で、本発明のポリペプチドを予め塗布したマイクロタイタープレート、適切に処方された様々な希釈剤及び／もしくは緩衝剤、標識物質、又は酵素基質、補因子、発色団など、特異的に結合した抗原／抗体複合体を検出するためのシグナルを発生する他の薬品をさらに含む。その中の他の構成要素は、当分野の技術者に容易に選択できる。
【００８２】
さらに、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の本発明のポリペプチドを固定化するステップ；次いで、適切な緩衝液で洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；次いで、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗ＩｇＧ抗体と共に、抗原／抗体が十分に相互作用する一定の時間インキュベートするステップであって、前記抗ＩｇＧが、検出対象の生物検体を供与した動物に対するものであるステップ；並びに、その後、前記検出標識に合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の抗体ＩｇＧの量を算出するステップを含む方法も提供する。
【００８３】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、使用する前記抗体は抗ヒトＩｇＧである。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、前もって決められた支持体の表面に抗原としてのポリペプチドＮＥ２Ｉを予め塗布する。本発明の別の実施形態では、特定の支持体表面を予め塗布する抗原として、ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープと結合したポリペプチド２４７を使用する。
【００８５】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に、市販又は型通りに生成された抗体抗ＩｇＭを固定化するステップであって、前記抗ＩｇＭが、検出対象の生物検体を供与した動物に対するものであるステップ；適切に洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体、好ましくは血清を接触させるステップ；適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；次いで少なくとも１種の検出可能に標識された本発明のポリペプチドと共に、抗原と抗体が相互作用するのに十分な時間インキュベートするステップ；並びに、その後、前記の検出可能な標識に合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の抗体ＩｇＭの量を算出するステップを含む方法を提供する。
【００８６】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、使用する前記抗体は抗ヒトＩｇＭである。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたポリペプチド２２５Ｎによって、検体中の前記ＩｇＭ抗体を検出する。本発明のさらにまた別の実施形態では、ＨＥＶ ＩＲＦ３のエピトープと結合させたポリペプチド２４７を、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させて、検体中に含まれるＩｇＭを検出する。
【００８８】
さらに、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の本発明のポリペプチドを固定化するステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の生物検体を接触させるステップ；任意選択で、適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；検出可能な標識された当該ポリペプチドの１つと共に、抗原と抗体が相互作用するのに十分な時間インキュベートするステップ；並びに、検出可能な標識を有するＥ型肝炎ウイルス抗原及び合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の全抗体の量を算出するステップを含む方法も提供する。
【００８９】
本発明の一実施形態では、支持体表面上にＮＥ２Ｉを予め塗布し、西洋ワサビペルオキシダーゼと予め結合させたポリペプチド２２５によって、検体中の全抗体を検出する。本発明の別の実施形態では、支持体表面上に、ＨＥＶ ＯＲＦ３からのエピトープと結合させたＮＥ２Ｉを予め塗布し、ＨＥＶ ＯＲＦ３からのエピトープと前もって結合させてある、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたポリペプチド２２５によって、検体中の全抗体を検出する。
【００９０】
以下の図面及び実施例の記載に関して、本発明の詳細をさらに説明するが、これは、いかようにも本発明の保護範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【００９１】
（実施例）
別段の指示がない限り、本発明の分子生物学の実験方法およびイムノアッセイはすべて、「分子クローニング：実験室必携（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、および「分子生物学におけるショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年の基本的な記載事項に従う。制限エンドヌクレアーゼの使用は、提供者が提示するプロトコルに従う。
【実施例１】
【００９２】
実施例１ 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の調製、およびそれを含む発現ベクターの作製
鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２画分の調製
問題の遺伝子を調製するにあたり、中国新疆省のＨＥＶ感染患者からクローン化した、鋳型としての全長ＨＥＶ遺伝子（Ａｙｅ，Ｔ．Ｔ．、Ｕｃｈｉｄａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻（１３）３５１２ページ（１９９２年）；遺伝子銀行受入れ番号Ｄ１１０９２）、ならびに上方のプライマーとしてのＯＲＦ２ ＦＰ：５’−ａｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃｃａ−３’および下方のプライマーとしてのＯＲＦ２ ＲＰ：５’−ａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’の２種のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲサーマルサイクラー（ＢＩＯＭＥＴＲＡｔ３）において、９４℃で５分間；次いで９４℃で５０秒間、５７℃で５０秒間、および７２℃で２．５分間を２５サイクル；最後に７２℃で１０分間という条件下で実施する。本発明のポリペプチドを調製する鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２からのＤＮＡ断片約２ｋｂが得られる。先述のＰＣＲ産物を市販のベクターｐＭＤ１８−Ｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）にさらに連結し、次いでＯＲＦ２遺伝子が挿入された陽性クローンが識別されるようにＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。Ｍ１３（＋）／（−）をプライマーとして使用して、得られたものの配列を決定し、それによって本発明のポリペプチドを調製する鋳型として使用する２本のＨＥＶ ＯＲＦ２ＤＮＡ断片、すなわち一方が保存配列（鋳型１、配列番号５）、他方が変異配列（鋳型２、配列番号６）を識別する。
【００９３】
配列を並べ合わせ、ＯＲＦを解析することによって、本発明のポリペプチドを調製する鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２の変異配列（配列番号６）は、保存配列（配列番号５）に対して塩基Ａが欠落しており、これがＯＲＦ２内のアミノ酸残基６０４〜６０５がＨｉｓ−Ｓｅｒ−ＶａｌからＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇに変異するシフト変異をもたらし、さらにこのために、この変異によって生成した終止コードタグによって前記ポリペプチドへの翻訳が停止することが判明している。
【００９４】
以下では本発明のポリペプチド２０１を使用する実施例によって、ポリペプチド２０１をコードする核酸およびそれを含む発現ベクターの調製を例示する。
【００９５】
本発明のポリペプチド２０１をコードするポリヌクレオチドおよびそれを含む発現ベクターの調製
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）において、上記で得た配列の配列番号５を鋳型として使用し、ならびにＢａｍＨＩ部位、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴ ＡＴＧ）、および大腸菌系の翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを導入した前方向プライマー２０１ＦＰ：５’−ｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｔｔｃａｇｇａｔｔａｔｇａｃ−３’（表１を参照のこと）と、終止コドンおよびＥｃｏＲＩ部位を導入した逆方向プライマーとしての２０１ＲＰ：５’−ｃｔｃｇａｇａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’（表１を参照のこと）とを使用するものを利用して遺伝子を合成する。ＰＣＲは、サーモサイクラーにおいて、９４℃で５分間熱変性させ、次いで９４℃で５０秒間、５７℃で４０秒間、および７２℃で４０秒間のサイクルを３０回、さらに最後に７２℃で１０分間増幅させて実施する。得られた〜６００ｂｐのＰＣＲ産物が本発明のポリペプチド２０１をコードするヌクレオチド配列であることを確認する。
【００９６】
本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７の作製は、参照文献のＬＵＯ Ｗｅｎ−Ｘｉｎ等、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００年、第１６巻：５３〜５７ページにある方法に従うものである。前記方法は、前述のＰＣＲ産物を市販のｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローン化するステップ；ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ヌクレオチドによってコードされたポリペプチド２０１が挿入された陽性サブクローンを識別し、これを得るステップ；前記陽性サブクローンをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲｌでさらに消化して、ポリペプチド２０１の遺伝子を含むヌクレオチド配列を得るステップ；次いでＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＴＯ−Ｔ７にクローン化するステップを含む。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化することによって、ポリペプチド２０１のコード化配列が組み入れられている陽性クローンｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１を識別する。図１に、ＯＲＦ２０１ポリペプチドの発現ベクターを作製するための方策を例示する。
【００９７】
同様に、カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇでない他方の本発明のポリペプチドも、配列番号６の配列を鋳型として使用し、個々の問題のポリペプチド向けに特別に設計された表中の各プライマーを使用することによって、上記の方法に従って得ることができる。
【００９８】
カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド、およびそれを含む発現ベクター
カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである本発明のポリペプチドは、上述のＯＲＦ２−２０１の発現ベクターでの方法に従って得た発現ベクターで大腸菌ＥＲＲ２５６６を形質転換することによって発現される。具体的には、上述のＨＥＶ ＯＲＦ２変異配列の配列番号６を鋳型とし、本発明の個々のポリペプチド向けに特別に設計された個々の前方向／逆方向プライマー（表１を参照のこと）を使用して、ポリペプチド２０１の発現ベクターを作製するのと同様の条件下でのＰＣＲによって対応する発現ベクターを得る。この方法では、免疫原性および免疫反応性の良好な一連の本発明のポリペプチドが得られ、得られるポリペプチドは、そのＮ末端にＭｅｔが付加され、カルボキシル末端のアミノ酸６０３のＰｒｏである３’末端において、５’から３’の方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されている。
【００９９】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【実施例２】
【０１００】
実施例２ ポリペプチド２０１の発現
形質転換用の（塩化カルシウム法で発生させた）大腸菌ＥＲＲ２５６６コンピテント細胞４０ｕＬにプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１（０．１５ｍｇ／ｍＬ）１ｕＬを加えた。次いで、混合物をカナマイシンＬＢプレートにスクロールし、個々のクローンが得られるまでプレートを３７℃で１０〜１２時間インキュベートした。個々のクローンを選び取り、さらに管中ＬＢ培地４ｍＬに接種し、培養物のＯＤ550nm値が約１．５になるまで、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振とうした。次いで、１ｍＬの培地を後の使用に備えて４℃で保管し、残りの３ｍｌの培地（最終濃度は０．３ｍＭ）に０．５ＭのＩＰＴＧ２ｕＬを加えた。ＩＰＴＧ含有培地を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で４時間インキュベートを続けて、問題のポリペプチドの発現を誘導した。誘導を行った培地１．５ｍＬを３０秒間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。沈殿した細胞を１００ｕＬのタンパク質添加液（５０ｍＭのトリスＣｌｐＨ６．８、１００ｍＭのＤＴＴ、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセロール）に再懸濁させ、さらに１０分間煮沸し、次いで１０分間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。１０ｕｌの上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ポリペプチド２０１の発現を解析した。高い収率で発現したクローンをさらなる発酵に使用した。
【０１０１】
ＬＢ培地５００ｍＬを含む１Ｌ容エルレンマイヤーフラスコにシーク培地２００ｕＬを加えた。培養物のＯＤ550nm値が２．０に達するまで、１９０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で約１１時間インキュベートした後、０．５ＭのＩＰＴＧ３００ｕＬを加えて、最終含有量を０．３ｍＭとした。前述の条件下、この混合物をさらに４時間インキュベートした。誘導を行った１．５ｍＬの培養物を３０秒間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。細胞を１００ｕＬのタンパク質添加液に再懸濁させ、１０分間煮沸し、次いで１０分間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。１０ｕｌの上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ポリペプチド２０１の発現を解析した。ＵＶＩゲル画像処理器（Ｕ−ＶＩｔｅｃｈ、ＤＢＴ−０８モデル）によって示された（クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色を行う）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの解析結果は、ポリペプチド２０１の発現が、発現した総細胞タンパク質の約３５％であることを示した。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３ 大腸菌中に発現させたポリペプチド２０１封入体の精製
実施例２で得た組換えポリペプチド２０１を含有する大腸菌の培地を１５分間４０００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、培養物の沈殿各５００ｍＬを１５ｍＬの溶解緩衝液（ｄＨ2Ｏ中５０ｍＭのトリスＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。超音波処理器において細胞を超音波処理した（Ｕｉｌｂｒａ−ＣｅｌｌＶＣＸ５００、ＳＯＮＩＣＳ ＆ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ｃｏｍｐａｎｙ、パワー７０％、４０秒間オン、６０秒間オフ、合計２０分間の超音波処理）。超音波処理した混合物を４℃で１０分間１２０００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、ペレットを２％のトリトンＸ１００を含む緩衝液Ｉ溶液（２００ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．５；５ｍＭのＥＤＴＡ；１００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁させ、最終体積は、元の溶解液と同じである。混合物を３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とうし、次いで４℃で１０分間１００００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。ペレットを等しい体積の緩衝液Ｉに再懸濁させ、混合物を超音波処理した（４０秒間オン、６０秒間オフ、パワー７０％、合計で３分間の超音波処理）。その後、混合物を４℃で１０分間遠心分離した（１００００ｒｐｍ）。ペレットを２％のトリトンＸ１００を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を前と同じにした。混合物を３７℃で３０分間振とう（２００ｒｐｍ）した後、４℃で１０分間遠心分離した（１００００ｒｐｍ）。ペレットを３７℃で３０分間振とう（２００ｒｐｍ）して、等しい体積の緩衝液Ｉに再懸濁させた。次いで、混合物を４℃で１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを２Ｍの尿素を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を元の混合物と同じにした。３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とうした後、混合物を４℃で１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。この上清に２０１−２Ｍと印をつけた。ペレットは、４Ｍの尿素を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を前と同じにした。３７℃で１時間振とう（２００ｒｐｍ）した後、混合物を一晩４℃で保管し、次いでこれを４℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。この上清に２０１−４Ｍと印をつけた。上記の試料の純度はすべて、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。図３に結果を示す。
【実施例４】
【０１０３】
実施例４ 組換えポリペプチド２０１の再生
実施例３に従って調製した試料２０１−４Ｍ１００ｍｌを２袋の透析バッグ（３６ＤＭ、保持ＭＷ：８０００〜１００００、米国Ｕｎｉｔｅｄ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に装入し、１×ＰＢＳ（Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ ７３．３４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、ＮａＣｌ １６３、６３２ｇ、ＫＣｌ ４．０２４ｇを含有する２０×ＰＢＳ（１Ｌ）、ｐＨ７．４５）９００ｍｌを含む１Ｌ容ビーカー中で攪拌しながら、２５℃で終夜（１０時間）透析を行うと、透析バッグ中に白色の沈殿が認められた。透析液を補給し、透析を続け、次いで透析液を３時間毎に４回補給した。原則として、透析が済んだときの試料中の尿素含有量は、４×１０−６Ｍである。透析した試料を２５℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を０．２２μｍの濾過膜で濾過してさらに精製し；４Ｍの尿素／緩衝液Ｉに懸濁させたペレットを新しい透析で使用して、その間に沈殿を出現させることもできるが、得られるタンパク質試料の濃度が最初に得たものより低くなる。
【実施例５】
【０１０４】
実施例５ ゲル濾過ＨＰＬＣによる組換えポリペプチド２０１の精製
実施例４の方法に従って調製した再生２０１の試料を以下のようなＨＰＬＣ、すなわち、
機器：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕ １２５ＮＭＰ／１６６ＮＭＰ ＨＰＬＣ、
カラム：ＴＳＫ ＧＥＬ ＳＷ３０００ ２１．５ｍｍ×６０ｃｍ、
溶離：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４５、
流速：４ｍｌ／分、
検出：２８０ｎｍのＵＶ、
試料：４ＭのＮＥ２（８ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、
収集：ウィンドウ式自動頂角収集（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｐｅｘ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｎｄｏｗ ｍｏｄｅ）、
収集時間：１チューブ／２０秒、
収集遅延：６秒によって精製した。
【０１０５】
クロマトグラムの結果は、分子の濾過が非常に有効であることを示したが、頂角の成分は、単量体および二量体、ならびにこれらの間に均等に分布するタンパク質を含んでいる。試料タンパク質を沸騰湯中で１０分間処理した後、最高で９５％を越える目的のタンパク質ピークの単量体純度について１２％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。それによって、ＯＲＦ２−２０１単量体が、自己凝集に加えて他の小さいタンパク質とも凝集し、クロマトグラムの際に一緒に溶離した多量体の間で相互作用が生じることも示されている。
【実施例６】
【０１０６】
実施例６ 本発明の組換えポリペプチド産物の特徴づけ
実施例１〜５の方法に従って、本発明の組換えポリペプチドを作製し、発現させた。さらに、各々の組換えペプチドを洗浄し、実施例３〜４の方法に従って透析にかけた。表２に、各組換えペプチドのＥ型肝炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配置、発現された組換え産物の再生特性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの単量体および二量体の比率、ならびに多量体の生成を示す。
【０１０７】
【表２−１】
【表２−２】
【０１０８】
表２で示したとおり、ＨＥＶ ＯＲＦ２の配列番号１のアミノ酸配列に含まれる本発明のポリペプチドは、そのカルボキシル末端が配列番号１のａａ６０１（Ｌｅｕ）とａａ６６０の間に位置する場合、よく再生する能力を有し、これによって自然のＨＥＶタンパク質に近い次元構造を示すようになる。具体的には、ペプチド２４７、２３２、２２２、２０１、２３５Ｎ、２２５Ｎ、２０９Ｎ、ＮＥ２Ｉ、２１７Ｄ、２０５、１８９、１８８、ＮＥ２（配列番号２）、および１９３Ｃ（配列番号３）は、単量体分子量および２倍の単量体分子量に相当する位置に発現バンドを有するが、二量体の量が明らかに単量体を上回っていることが判明した。ＮＥ２および１９３Ｃが、より大きい分子量の位置にはっきりとしたバンドを有することが判明し、前記ペプチドが自発的に多量体化することを示唆した。
【０１０９】
表２の再生可能な組換えペプチド１９３Ｃ、２０１、２０８Ｎ、２０９Ｎ、ＮＥ２、２２２、２２５Ｎ、２３２、および２４７をゲル濾過ＨＰＬＣによってさらに精製し、それぞれを１０分間２００００ｇで遠心分離し、０．１μｍのＡｌ2Ｏ3濾過膜で濾過した後、動的光散乱計（ＤＹＮＡＰＲ０９９−Ｄ−５０動的光散乱計、ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ製）によってこれらのペプチドの動的半径を測定し、表３ではその構築状態を推測してある。得られた各々の組換えペプチドの分子半径は、その単量体の予想半径よりも明らかに大きい。推定上の分子量に従うと、このようなペプチドの形状が、溶液中に少なくとも二量体を形成し、その大部分が高次の多量体を形成すると結論付けることができるが、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの挙動と同調している。実際、上記の方法で調製した本発明のポリペプチドは、最高で１８０個以上の単量体の多量体を形成し得る。さらに、発明のポリペプチドが予想外の特性、すなわち大腸菌系によって発現された上記の前記組換えペプチドが、変性剤を含まないＰＢＳ溶液中で自発的に多量体化するので、そのワクチンとしての免疫原性を増強するのに有利であることも実証された。
【０１１０】
【表３】
【実施例７】
【０１１１】
実施例７ ポリペプチドの物理化学的特性
封入体からの再生
実施例１〜３で記載したとおりに調製した組換えポリペプチドの封入体を４Ｍの尿素で変性させ、次いで実施例４で記載したとおりに、１００を超える量のＰＢＳでの透析にかけた。透析したものを１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は、若干またはすべての組換えポリペプチドを含んでおり、それによって前記組換えポリペプチドに再生能力があることを実証する。
【０１１２】
組換えペプチドの重合
従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用する上清の解析において、それぞれ単量体、二量体、および多量体に対応するバンドを識別した。従来のウェスタンブロット法によって前記バンドの特異性をさらに確かめ、それによって組換えポリペプチド２０１が再生後に重合体を形成することを実証した（図４を参照のこと）。
【０１１３】
光走査法によるポリペプチド２０１の分子サイズの決定
実施例６に従って、ポリペプチド２０１をＨＰＬＣによって精製した後、１０分間２０，０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで０．１ｕｍのアルミナ製ミリポア膜で濾過した。濾液を動的光走査計（ＤＹＮＡ−ＰＯＲ９９−Ｄ−５０、米国ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ Ｃｏｍ．Ｌｔｄ．）による８２４．０ｎｍでの測定にかけた。算出には制御アルゴリズムを使用し、数多くの標準試料によってその実用性を確かめた。分子の半径は、％ピーク強度に対応する動的半径から算出した。溶媒は、試料緩衝液ＰＢＳとした。図５に示す測定結果は、変性剤を含まない溶液中のポリペプチド２０１の平均半径が３．０８ｎｍであったことを示唆し、（三量体に相当する）ＭＷ６２．７ＫＤが算出された。本発明の技術者には、前記の本発明のポリペプチドが実際に１８０個以上の単量体の重合体を形成したことが知られている。
【実施例８】
【０１１４】
実施例８ マウス抗ＮＥ２単クローン抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系の確立
第一次の免疫化では、各々のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウス（生後６〜８週間）に５ｕｇの組換え抗原ＮＥ２で乳化したフロイント不完全アジュバント（総体積５０ｕＬ）で免疫化を施した。１５日後、マウスにフロイント不完全アジュバント中に乳化された同じ量のＮＥ２を筋肉内投与して２回目の免疫化を施した。３０日後、アジュバントなしの抗原５ｕｇを（尾の静脈を通して）静脈内投与してマウスに追加免疫を施した。追加免疫の後７２〜９６時間でマウスを屠殺した。次いで血液を採取し、脾臓を切除して、（ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させて）脾細胞懸濁液を調製した。脾細胞を細胞計数器でカウントした。次いで、６：１の比で脾細胞をＳＰ２／０マウス黒色腫細胞と混合し、遠心分離した。細胞をＰＥＧ（ＰＥＧ１５００）で融合し、次いで等しい量の支持細胞と混合し、９６穴プレート（２００ｕＬ／ウェル）に移した。５％のＣＯ2雰囲気において、９６穴プレートを恒温器（ＥＳＰＥＣ ＢＮＡ−３１）において３７℃でインキュベートした。３日後、培地の半分を新鮮なＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｔ．）を加えて１００ｍＬとし、約４５〜５０℃で溶解させ、濾過して滅菌した１．３６１ｍｇのヒポキサンチンおよび０．３８８ｍｇのチミジン）に入れ替えた。７日後、９６穴プレートにＮＥ２を塗布し、以下に述べるようにハイブリドーマ細胞培養物についてのＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であった細胞を限界希釈法によってクローン化した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例５で述べたＨＰＬＣによって１００ｕＬのＮＥ２を３７℃で精製し、次いで０．０５モル／ＬのＣＢ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした２０．０２ｇのＮａ2ＣＯ3および２．５２ｇのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）に溶解させて、最終濃度を０．３ｕｇ／ｍＬとした。９６穴ポリビニルマイクロタイタープレートを、３７℃で２時間、次いで４℃で一晩かけて、得られた溶液で処理した。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇのＮａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で洗浄して、吸収されていない抗原を除去した。次いで、ウェル毎に２００ｕＬのブロッキング用緩衝液（１×ＰＢＳ中２％のグルチン、０．２％のカゼイン、および２％のスクロース）を加え、２時間インキュベートした。次いで溶液を流し、ウェルを乾燥させ、真空中に４℃で保管した。
【０１１６】
アッセイのために、１００ｕＬの細胞培養物を各ウェルに加え、各プレートに１陽性対照（１：１００に希釈した多クローン性抗ＮＥ２血清１００ｕＬを加えたもの）および１陰性対照（ＨＴ培地１００ｕＬを加えたもの）を設けた。３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで乾燥させた。ＨＲＰ−ＧＡＭ Ｉｇ（ＤＡＫＯ社）を加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。プレートを再度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、乾燥させた。プレートに５０ｕＬの基質溶液Ａ（ｄｄＨ2Ｏを加えて７００ｍＬとした１３．４２ｇのＮａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、４．２ｇのクエン酸Ｈ2Ｏ、および０．３ｇのＨ2Ｏ2）および５０ｕＬの基質溶液Ｂ（ｄｄＨ2Ｏを加えて７００ｍＬとした０．２ｇのＴＭＤおよび２０ｍＬのジメチルホルムアミド）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５０ｕＬの停止溶液を使用して、反応を停止した。各ウェルのＯＤ450値をＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。一般に、ＯＤ450値が陰性対象より少なくとも２０倍高いと、陽性であるとみなすことができる。
【０１１７】
腹水の調製および単クローン抗体の精製
生後１０週間のＢａｌｂ／Ｃマウス各々に０．５ｍＬのフロイント不完全アジュバントを腹腔内接種した。２〜７日後、ハイブリドーマ細胞を収集し、遠心分離した。次いで上清を捨て、細胞群に血清を含まない培地を加えて、最終濃度を２×１０5〜２×１０6細胞／ｍＬとした。得られた細胞懸濁液０．５ｍＬを使用して、各マウスに接種した。マウスの腹部が膨張してから７〜１０日目に腹水を採取し、次いで１５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した。管中間部の透明の液体をピペットで取り出し、０．４５ｕｍのミリポア膜で濾過して滅菌した。濾液を−２０℃で保管した。
【０１１８】
処理した腹水を等しい体積のＰＢＳ（通常の食塩水を加えて１００ｍＬとした０．２モル／ＬのＮａ2ＨＰＯ4８１ｍＬおよび０．２モル／ＬのＮａＨ2ＰＯ4１９ｍＬ）で希釈した。次いで５０％飽和になるまで、穏やかに攪拌しながら（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。ペレットを（２の量の腹水を使用した）ＰＢＳに溶解させた。３３％飽和になるまで、得られた溶液に攪拌しながら再度（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。ペレットを（２の量の腹水を使用した）ＰＢＳに溶解させた。５０％飽和になるまで、穏やかに攪拌しながら（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。次いでペレットを透析バッグ中の適量のＰＢＳに溶解させ、５０〜１００の量の、１２０ミリモル／ＬのトリスＨＣｌ緩衝液（２０ミリモル／ＬのＮａＣｌ含有、ｐＨ７．８）において４℃で約１２時間攪拌しながら透析した。緩衝液は３回より頻繁に入れ替えた。透析したものを−２０℃で保管した。
【０１１９】
上記で述べた方法に従い、本発明のポリペプチドＮＥ２でＢａｌｂ／Ｃマウスに免疫化を施すことによって単クローン抗体を調製し、８種の抗ＮＥ２単クローン抗体（１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５、８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８、１５Ｂ２、および１６Ｄ７）が識別された。前記８種の抗体をエッペンドルフ管にそれぞれ塗布し、捕捉ＲＴ−ＰＣＲ（実施例９を参照のこと）によって、前記抗体が自然のＨＥＶを結合する能力を試験した。その結果、８Ｃ１１、８Ｈ３、および１３Ｄ８が、顕著なＨＥＶ結合活性を示し、その認識部位がウイルス外皮表面上の自然のエピトープであることを示唆した。前記の３種の抗体を実施例１０で使用した。
【実施例９】
【０１２０】
実施例９ 抗体捕捉ＲＴ−ＰＣＲによるｍＡｂのＨＥＶ結合能試験
１．５ｍＬ容エッペンドルフ管に３０分間紫外線を照射し、次いでＣＢ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした２０．０２ｇのＮａ2ＣＯ3および２．５２ｇのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）中に１：１０００で希釈したｍＡｂ５００ｕＬを加えた。３７℃で終夜インキュベートした後、緩衝液を流し、１．５ｍＬのブロッキング用緩衝液（２％アルブミン添加１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を加えて、３７℃で２時間ブロッキングした。次いでブロッキング用緩衝液を流し、滅菌した通常食塩水中１０％のＨＥＶ陽性排泄物５００ｕＬを加えた。３７℃で２時間反応させた後、エッペンドルフ管をＰＥＳＴで６回洗浄し、次いで各エッペンドルフ管に２５０ｕＬのｄｄＨ2Ｏを加えた。次いで実施例１４に従ってＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。その結果、８Ｃ１１、８Ｈ３、および１３Ｄ８の単クローン抗体はＨＥＶを結合できたが、１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５、１５Ｂ２、および１６Ｄ７はＨＥＶを結合できなかった。
【実施例１０】
【０１２１】
実施例１０ 本発明のポリペプチドと、陽性アカゲザル由来血清、ヒト由来血清、およびマウス由来単クローン抗体とのＥＬＩＳＡ、ならびに本発明のポリペプチドとマウス由来単クローン抗体のドットブロット
組換えポリペプチドと、陽性アカゲザル由来血清、ヒト由来血清、およびマウス由来単クローン抗体とのＥＬＩＳＡ
実施例１〜６で述べた方法に従って、表２で示した本発明のポリペプチドを作製し、精製した。得られた濃度１ｍｇ／ｍｌの精製組換えタンパク質の試料をＰＢＳ緩衝液（２０Ｍｍ、ｐＨ７．４）で１：５００に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルを塗布し、次の条件下、すなわち３７℃で２時間インキュベートし、次いで４℃で終夜約１２時間インキュベートする条件下に置いた。自動洗浄器（ＴＥＣＡＮ、Ｍ１２／４Ｒ Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｐｌｕｓ）においてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液（非イオン性Ｈ2Ｏを加えて最終濃度１Ｌとしてある８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、乾燥させた後、ブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ中２％のグルチン、０．２％のカゼイン、および２％のスクロース）を２００μｌ／ウェル加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで適宜希釈した抗血清または単クローン抗体を３７℃で３０分間かけて加えた。自動洗浄器において２０秒間隔で５回、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液で洗浄し、乾燥させた後、適宜希釈したＨＲＰ標識二次抗体（ヤギ抗ヒト、マウスＩｇＧ抗体）を３７℃で３０分間かけて加えた。自動洗浄器において２０秒間隔で５回、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液で洗浄し、乾燥させた後、色素産生性薬品ＡおよびＢ（Ａ：非イオン水で体積を７００ｍｌに調整してある１３．４２ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、４．２ｇのクエン酸・Ｈ2Ｏ、および０．３ｇのＨ2Ｏ2；Ｂ：非イオン水で体積を７００ｍｌに調整してある０．２ｇのＴＭＢ、２０ｍｌのジメチルホルムアミド）をそれぞれ１滴加えて、３７℃で１０分間かけて発色させた。停止溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）を１滴加えた。マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｒｅｍｏｔｅ／Ｔｏｕｃｈ Ｓｃｒｅｅｎ）で（６２０ｎｍの波長を基準として）ＯＤ450nmを測定した。陰性対象の３回の平均値を陽性閾値と定めてあり、結果のＯＤ値が閾値より高い場合が陽性である。
【０１２２】
本発明のポリペプチドと様々なマウス由来単クローン抗体のドットブロット
実施例１〜５の方法に従って得、ＨＰＬＣゲル濾過によって精製した、表２に載せたポリペプチド各１０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜にそれぞれをゆっくりとスポットし、風乾した。５％の脱脂乳によって室温で１．５時間ブロッキングした後、実施例８で述べたように得た様々なマウス由来単クローン抗体（５％の脱脂乳で１：１００に希釈した、単クローン性Ｂリンパ球によって分泌された細胞上清）を加えて、室温で１時間反応させた。次いで、ＴＮＴ（１０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ＭｍのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を使用して膜を５分間隔で３回洗浄した。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＪＩＮＧＭＥＩ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、５％の脱脂乳で１：１０００に希釈したもの）を加え、室温で１時間反応させた。５分間隔で３回、ＴＮＴで洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｃ40Ｈ30Ｎ10Ｏ6Ｃｌ2／Ｃ8Ｈ6ＢｒＣｌＮＯ4Ｐ．Ｃ7Ｈ9Ｎ）を加えて発色させた。ドットをゲル画像処理システムでスキャンし、黒色度の値に転用し、＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、＋−の５陽性段階および−の陰性段階に分類した。古典的なウェスタンブロットに比べ、この方法は、ＳＤＳでの変性にかけないために変性剤の存在なしで、免疫反応性をより如実に反映できる。
【０１２３】
【表４−１】
【表４−２】
【０１２４】
結果
表４に載せた精製組換えポリペプチドをそれぞれ、マイクロタイタープレートに塗布し、実施例８で述べた３種のマウス由来単クローン抗体８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８、回復相のＨＥＶ患者の血清、および急性相のＨＥＶ感染アカゲザル由来血清に対するその反応性をＥＬＩＳＡによって調べ、使用した３種の単クローン抗体に対するその反応性をドットブロットアッセイによって調べた。その結果は、ポリペプチドＮＥ２、１９３Ｃ、１７８Ｃ、ＮＥ２Ｉ、２３５Ｎ、２２５Ｎ、２０９Ｎ、２４７、２３２、２２２、および２０１が各々の血清／単クローン抗体に対してより反応性であることを示した。これは、これらのポリペプチドが自然のＨＥＶエピトープをより多く有しており、ＨＥＶの診断キットおよび／またはワクチンに使用できることを示唆している。
【０１２５】
ポリペプチド１３８Ｃ、Ｃ１６０、１５０、１４２、および１３４は、様々な抗体に対する反応性が弱かった。これによって、主要な自然のエピトープＯＲＦ２の形成には、少なくともａａ４６９〜ａａ６００の断片が関与することが示された。
【０１２６】
ポリペプチド１７０、Ｃ１６０、Ｎ１６０、１５０、１４４、１４２、および１３４の配列は、ＯＲＦ２のａａ４５９〜ａａ６２８、ａａ４６９〜ａａ６２８、ａａ４５９〜ａａ６１８、ａａ４６９〜ａａ６ｌ８、ａａ４５９〜ａａ６０２、ａａ４５９〜ａａ６００の配列がそれぞれ開始アミノ酸（Ｍｅｔ）に結合したものである。
【実施例１１】
【０１２７】
実施例１１ 本発明のポリペプチドとマウス由来単クローン抗体のウェスタンブロット
実施例１〜５で述べたようにして得た本発明のポリペプチド２０８Ｎ、２０９Ｎ、および２２５Ｎと、実施例８で得たマウス由来単クローン抗体１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５のウェスタンブロットを実施した。前記ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで従来の方法に従ってニトロセルロース膜に移し、５％の脱脂乳を加えて１．５時間ブロッキングし、様々なマウス由来単クローン抗体（５％の脱脂乳で１：１００に希釈した、単クローン性Ｂリンパ球によって分泌された細胞上清）を加えて、室温で１時間反応させ、５分間隔で３回洗浄した後、（５％の脱脂乳で１：１０００に希釈した）ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを室温で１時間かけて加え、５分間隔で３回、ＴＮＴで洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて発色させた。図６にウェスタンブロットの結果を示す。その結果は、特にレーン８の、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０での染色では観察できない重合体バンドが、ウェスタンブロットアッセイの酵素に関連した増幅効果によって観察できることを示している。さらに、本発明の組換えポリペプチド２０８Ｎが１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中には重合体にならないこと、ならびに２０９Ｎおよび２２５Ｎに対する単クローン抗体１Ｆ６の活性が、単クローン抗体２Ｃ９および３Ｆ５より強いことも確かである。
【実施例１２】
【０１２８】
実施例１２ ポリペプチド２０１を含むワクチンの調製およびそれによるマウスの免疫化アッセイ
フロイントアジュバントと併せたポリペプチド２０１含有ワクチンの調製
上述のようにして得、ＨＰＬＣによって精製した本発明のポリペプチド２０１（純度＞９５％およびタンパク質濃度１．０２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈し、等価な体積の（ＢＣＧを含有する）フロイント完全アジュバントを加えて、ポリペプチド２０１が所望の最終濃度に達するようにした（たとえば、各マウスを１００μｌ、５μｇで免疫化することが望まれれば、ポリペプチド２０１の濃度を０．０５ｍｇ／ｍｌに調製することになる）。この溶液を混合し、３０分間動かさずにした後分離する液体相が現われなくなるまで３０分間かけて乳化した。
【０１２９】
フロイントアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、４グループの各々のマウス（各群に３匹のＫｕｎｍｉｎｇ白色マウス）に１００μｌ中０．５、１、２、５μｇ／マウスを筋肉内注射した。図７に結果を示す。その結果は、２μｇを超える用量のフロイントアジュバントを加えて調製したＯＲＦ２−２０１ワクチンが非常に強い免疫原性を有しており、免疫化後２週間目に抗原が産生され始め、４週間目には力価が最高に達したことを示唆した。免疫学についての一般の書籍および文献によると、３０〜７０μｇ／マウスの用量のタンパク質抗原で免疫化したマウスにおいてのみ力価のより高い抗体が産生できると考えられている。したがって、この結果は、このワクチン、すなわちフロイントアジュバントと併せた本発明のポリペプチド２０１が、入手可能なワクチンに比べて著しく高い免疫原性効果を有することを示している。
【０１３０】
アルミニウムアジュバントと併せたポリペプチド２０１含有ワクチンの調製
Ｌａｎｚｈｏｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａからの所望の量の原物アルミニウムアジュバント（Ａｌ３＋１３．６８％、Ｎａ＋３．３６％、ｐＨ５．５５）を沈殿が生じるまで１ＮのＮａＯＨで調整した。完全に混合した後、１×ＰＢＳを加えて体積を２倍にした。次いで、１分間１０，０００で遠心分離し、上清を捨てた。沈殿を１×ＰＢＳで再懸濁させて、再度体積を２倍にし、１分間１０，０００で遠心分離し、上清を捨てた。ｐＨが７〜７．４に達するまで、このプロセスを数回繰り返した。最後に、沈殿を等しい体積の１×ＰＢＳで再懸濁させ、溶液を滅菌し、４℃で保管し、９倍の保存溶液として使用した。
【０１３１】
同様に、上述のようにして得、ＨＰＬＣによって精製したポリペプチド２０１（純度＞９５％およびタンパク質濃度１．０２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈し、１／９の量のアルミニウムアジュバントを加えて、ポリペプチド２０１が所望の最終濃度に到達するようにし、４℃で終夜混合した。免疫化用量は、１００μｌ／マウスである。アルミニウムアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、各群の３匹のＢａｌ ｂ／ｃマウス各々に２、５、１０μｇ／マウスを筋肉内注射した。図９に結果を示す。その結果は、５、１０μｇ／マウスの用量の免疫原生効果がより高いことを示唆したが、これは、粒子抗原であり、単量体抗原より免疫原性が高いと考えられている最近の入手可能なＨＢＶ表面抗原ワクチンに匹敵する。したがって、この結果は、本発明の重合体がワクチンに有用であることを示している。
【０１３２】
アジュバントなしのポリペプチド２０１の免疫アッセイ
上述のようにして得たポリペプチド２０１を４Ｍの尿素に溶かし、上清をＰＢＳ（ｐＨ７．４５）での透析にかけて再生させ、純度を約９５％とした。フロイントアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、各群の３匹のＫｕｎｍｉｎｇ白色マウス各々に５、２５、５０μｇ／マウス（対照群には５μｇ／マウス）を筋肉内注射した。図８に結果を示す。その結果は、アジュバントなしのＯＲＦ２−２０１ワクチンで免疫化したマウスにおいて抗体が顕著に産生されたことを示し、その使用した投与量は、フロイントアジュバントを加えてある従来の抗原の投与量と同等であった。本発明の重合体ポリペプチドの免疫原性が従来の抗原よりも高いことをさらに示している。
【０１３３】
上記の結果から、フロイントアジュバントまたはアルミニウムアジュバントの配合にかかわらず、組換えポリペプチド２０１とＮＥ２（５μｇ／マウス）の両方で免疫化した場合も、Ｂａｌｂ／ｃマウスによる特定の抗体の産生が誘発できると結論付けられる。フロイントアジュバントを配合した他の再生可能なポリペプチドも、マウスによる特定の抗体の産生を誘発し得る。したがって、本発明のポリペプチドは、ワクチンとしての使用に好適な特性を有する。
【実施例１３】
【０１３４】
実施例１３ 本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンによるアカゲザルの免疫化
ＡＬＴが正常であり、ＨＥＶ陰性のアカゲザル６匹を選択し、２つの群に分け、一方の群をＨＦ１、ＨＦ２、およびＨＦ３と称し、他方の群をＨＦ４、ＨＦ５、およびＨＦ６と称した。実施例１〜５および１２で記載したとおりに調製した、投与量２０μｇのアルミニウムアジュバント含有ポリペプチドＮＥ２Ｉワクチンおよびポリペプチド２０１ワクチンを三角筋内注射することによって、対象アカゲザルの２つの群にそれぞれワクチン接種を施した。このワクチン接種をそれぞれ０、１０、および３０日目に行った。最後のワクチン接種から３週間目に、この動物からの抗ＮＥ２ＩＩｇＧ抗体の力価を間接ＥＬＩＳＡによって試験すると、結果は次のとおり、すなわちＨＦ１（１：１６０００）、ＨＦ２（１：４０００）、ＨＦ３（１：８０００）、ＨＦ４（１：２０００）、ＨＦ５（１：３０００）、およびＨＦ６（１：５０００）であった。
【０１３５】
ポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２０１によって例示された上記の結果は、本発明の組換えポリペプチドが、米国特許第５８８５７６８号で免疫原として使用されたＨＥＶ ＯＲＦ２ポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２（配列番号１のアミノ酸２２５〜６６０）よりも高い免疫原性を有することを示唆している。Ｒｅｙｅｓ等の米国特許第５８８５７６８号では、大腸菌から発現させたＨＥＶ ＯＲＦ２ポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２と改良アルミニウムアジュバントの併用物５０ｕｇをそれぞれ０および３０日目に静脈内注射することによって、４匹のカニクイザルにワクチン接種を施している。アジュバントのみを注射した２匹のカニクイザルが対照として使用されている。２回目のワクチン接種後４週間目には、ワクチン接種したサルの群においてＨＥＶに対する抗体が検出されなかった。ワクチン接種したサルの２匹を選択して、５８日目に不溶性のアジュバントを含まないｔｒｐＥ−Ｃ２ポリペプチド８０ｕｇによる３回目のワクチン接種を施したが、抗ＨＥＶ抗体が検出されたのは４週間後までだけであった。
【実施例１４】
【０１３６】
実施例１４ 本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンで免疫化したアカゲザルへのＨＥＶ接種
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の調製および定量化
中国新疆省出身のＨＥＶ患者からの糞便を無菌生理食塩水中１０％懸濁液に調製した。この懸濁液を４℃で２０分間、１２０００ｇで遠心分離し、上清を０．２μｍの無菌フィルター（ＮＡＬＧＥＮＥ（登録商標）カタログ番号１９０−２５２０）での濾過によって滅菌した。ＰＣＲでの検出が可能な量のＨＥＶを感染投与量として使用した。
【０１３７】
糞便由来ＨＥＶ ＲＮＡの抽出、逆転写、およびＰＣＲ：その操作指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＬ）を使用し、１０％の糞便懸濁液からＨＥＶ ＲＮＡを抽出し、さらにＡＭＶ逆転写酵素を使用して、２０μｌの反応体積で、４２℃で４０分間、特定のプライマーＡ３（４５６６〜４５８６、５’−ｇｇｃｔｃａｃｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ−３’）をＲＴプライマーとして用いる、それの逆転写を行った。次いで、２ｕｌのＲＴ産物を鋳型として使用し、Ａ３プライマーおよびＡ５プライマー（４３４１〜４３６２、５’−ｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間の予備変性；９４℃で４０秒間の変性および６８℃で４０秒間の伸長を３５サイクル；７５℃で５分間の伸長によって、１回目のＲＴ−ＰＣＲを実施して、最終体積を２０ｕｌにした。１回目の反応産物２ｕｌを鋳型として使用し、プライマーＢ５（４３７２〜７３９２、５’−ｇｃｃｇｃａｇｃａａａｇｇｃａｔｃｃａｔｇ−３’）およびＢ３（４５５４〜４５７５、５’−ｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃｃａａａａｃｃｃｔｃｇｃ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間の予備変性；９４℃で４０秒間の変性、５６℃で４０秒間のアニーリング、および７２℃で１分２０秒間の伸長を３５サイクル；７５℃で５分間の伸長によって、２回目のＰＣＲを実施して、最終体積を２０ｕｌとした。
【０１３８】
この実験で扱うアカゲザルのグループ分け：免疫化群１は、それぞれ実施例２のＨＦ１、ＨＦ２、およびＨＦ３の動物に対応するアカゲザルＶ１０、Ｖ１１、およびＶ１２を含み；免疫化群２は、それぞれ実施例２のＨＦ４、ＨＦ５、およびＨＦ６に対応するアカゲザルＶ１３、Ｖ１４、およびＶ１５を含み；対照群は、Ｖ１６、Ｖ１７、およびＶ１８と称した３匹の非免疫化アカゲザルを含む。
【０１３９】
ＨＥＶ接種
ＰＣＲで検出できる量のＨＥＶを１感染投与量として用いた。実施例１３で記載した、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンをアカゲザルＨＦ１〜６に最後に接種してから３週間目に、１，０００感染投与量のＨＥＶを上記のサルに接種した。ＨＥＶ接種後、どのサルのＡＬＴも上昇しなかった。４週間目にＶ１６およびＶ１７の動物で抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧが検出され、５週間目にＶ１８の動物で抗ＮＥ２−ＩｇＧが検出された。Ｖ１０〜１５の動物では１〜３７日目までＨＥＶ排泄物が検出されず；Ｖ１６の動物では５日目にＨＥＶの排泄が始まり３０日目に終わり；Ｖ１７およびＶ１８の動物ではこれも５日目にＨＥＶの排泄が始まったが、３７日目になっても止まらなかった。これらの結果は、ワクチンとしての本発明のポリペプチドが米国特許第５８８５７６８号のＨＥＶ ＯＲＦ２のポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２よりも高い免疫原性を有し、強い防御をもたらすことを示唆している。
【０１４０】
これらの結果から、少ない投与量の本発明のワクチンを使用してサルにワクチン接種を施した場合、ワクチン接種を受けたサルは、ＨＥＶに応答して優れた抗体を産生できるので、ＨＥＶを接種後、異常なＡＬＴおよび糞便中のウイルス排泄が認められなかったことがわかる。したがって、ＨＥＶ ＯＲＦ２からのポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２を使用して調製したワクチン（米国特許第５８８５７６８号）およびＴｓａｒｅｖ等が調製したポリペプチドを含むワクチンについての報告されているワクチン接種結果に比べて、より優れた免疫防御がもたらされた。さらに、Ｔｓａｒｅｖ ａｎｄ Ｇｅｎｅｌａｂｓ ｃｏ．が利用したバキュロウイルス発現系は、人体に有害である可能性があるので、この系によって発現された組換えタンパク質が、ヒトに使用する市販薬または市販ワクチンとして認可されたことはこれまで報告されていない。対照的に、本発明による大腸菌発現系によって発現されたいくつかの組換えタンパク質は、ヒトに使用するｉｎ ｖｉｖｏ市販薬として認可されており、安全性がより確かである。
【実施例１５】
【０１４１】
実施例１５ ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープに結合させた本発明のポリペプチド２４７を含むキメラポリペプチドの調製
その５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを導入する前方向プライマーの３７２ＦＰ（５’−ｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇａａｔａａｃａｔｇｔｃｔｔｔｔｇｃｔ−３’）と、その５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩを導入する逆方向プライマーの３７２ＢＲＰ（５’−ｇｇａｔｃｃｔｃｇｇｃｇｃｇｇｃｃ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間；９４℃で５０秒間、５６℃で５０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル；および７０℃で１０分間の反応条件下において、中国新疆省のＨＥＶ患者から単離したＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の全長ゲノム（Ａｙｅ，Ｔ．Ｔ．、Ｕｃｈｉｄａ等のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻（１３）３５１２ページ（１９９２年）；遺伝子銀行受入れ番号ＧＩ２２１７０１）を鋳型とするＰＣＲ反応を行った。ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープをコードする、大きさ約３７０ｂｐの特定のＤＮＡ断片を得た。上記の得られたＰＣＲ産物を市販のｐＭＤ１８−Ｔプラスミド（ＴＡＫＡＲＡ社）に連結した。ＢａｍＨＩでの消化によって、ＨＥＶ ＯＲＦ３内のエピトープ遺伝子が挿入された陽性サブクローンを識別した。ＤＮＡの配列決定によって、クローン中に変異がないことが示され、それによって配列番号１１で示す、ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープ遺伝子のアミノ酸配列が得られた。
【０１４２】
ＢａｍＨＩでの消化によってＨＥＶ−ＯＲＦ３の遺伝子断片を得、ＢａｍＨＩで消化した（実施例１に記載の方法に従って調製した）ｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２４７発現プラスミドベクターに連結した。ＢａｍＨＩで消化して、ＨＥＶ ＯＲＦ３の遺伝子断片が挿入された陽性発現クローンｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ３−２４７を識別した。このクローンを大腸菌ＥＲＲ２５６６株に形質転換し、これをＯＲＦ３−２４７キメラポリペプチドの発現に使用した。
【実施例１６】
【０１４３】
実施例１６ ＮＥ２Ｄをインフルエンザ由来赤血球凝集素抗原に結合させたキメラポリペプチドの調製
対のプライマーＨＡＦＰ／Ｅ２ＲＤを使用する、実施例１で調製したＨＥＶ−ＯＲＦ２変異配列（配列番号６）を鋳型とするＰＣＲで増幅することによって、キメラペプチドのヌクレオチド配列を得た。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の予備加熱；９４℃で５０秒間の変性、５６℃で５０秒間のアニーリング、７２℃で７０秒間の伸長を３０サイクル；および最後に７２℃で１０分間の伸長という条件下で実施する。得られたＰＣＲ産物は、インフルエンザウイルス由来ＨＡおよび本発明のポリペプチドＮＥ２Ｄを含むキメラポリペプチドをコードする、約８００ｂｐのＤＮＡ断片である。前方向プライマーＨＡＦＰは、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限部位を含む。逆方向プライマーＥ２ＲＤは、ＥｃｏＲＩ制限部位および翻訳終止コドンＴＡＡを含む。ＮｄｅＩに対する配列はＣＡＴ ＡＴＧであり、ＡＴＧは翻訳開始コドンである。さらに、２種のペプチドＨＡおよびＮＥ２Ｄの立体配座を厳密に維持するために、ＨＡペプチドとＮＥ２Ｄペプチドの間にそれぞれ、ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣによってコードされる柔軟なリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−を導入した。したがって、キメラポリペプチドＨＡ−ＮＥ２Ｄは、ＨＥＶワクチンに適切に使用できる。一対のプライマーの配列は、以下のとおりである。
ＨＡＦＰ：５’−ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＡＡ
ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ ９１ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＣＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＴＣＴ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ
ＴＴＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ
Ｌｅｕ１０８ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＧＴ ＣＣ−３’
Ｅ２ＲＤ：５’−ｇａａｔｔｃｔｔａｇｇｇｇｇｃｔａａａａｃａｇｃ−３’
【０１４４】
得られたキメラポリペプチドをコードする核酸構築物を含む発現ベクターの調製
前述のＰＣＲ産物を市販のプラスミドｐＭＤ１８−Ｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）中にクローン化した。次いで、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＭＤ１８−Ｔ−ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄプラスミドから問題の配列を得、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでの消化および連結によって発現ベクターに組み込んだ。ｐＴＯ−Ｔ７−ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄ発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＥＲＲ２５６６宿主細胞から、ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄキメラペプチドを単離した。このアミノ酸配列を配列番号１２と称した。
【実施例１７】
【０１４５】
実施例１７ 本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉを主体とした間接Ｅｌｉｓａキットよる生物検体中の対ＨＥＶＩｇＧの検出
ＨＥＶに対するＩｇＧを本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉで検出するキットは、組換えポリペプチドＮＥ２Ｉを塗布し、ブロッキング用緩衝液（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、２％のゼラチン）でブロッキングしたマイクロタイタープレート；検体希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、１％のカゼイン）；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で希釈したＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ））；２０×ＰＢＳＴ、色素原Ａ、色素原Ｂ、および停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ ｗａｎｔａｉ）など、生物活性のない材料を含む。
【０１４６】
ＮＥ２Ｉに基く抗ＨＥＶ ＩｇＧキットで一連のサル血清を検出し、Ｂｅｉｊｉｎｇ ｗａｎｔａｉおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｌａｂｓから得た２種の市販抗ＨＥＶ ＩｇＧキットと比較した。これらのサル血清は、静脈内接種後０〜１８週（ｗ）までに得た、ＨＥＶに自然感染したサルを模倣したサルＮｏ１、Ｎｏ２、Ｎｏ３、およびＮｏ１３の血清であった。
【０１４７】
操作手順は以下のとおり、すなわち、各マイクロタイターに検体溶媒１００ｕｌを加え；マイクロタイターに検体１０ｕｌを加え；マイクロプレートのすべての側面を穏やかに叩くことによって十分に混合し；３７℃で３０分間インキュベートし；マイクロプレートを１回、ＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレートを逆さにし、吸収性の紙にしっかりと軽く叩くことによってブロットドライし；すべてのウェルに作用コンジュゲート１００ｕｌを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし；マイクロプレートを再度５回洗浄してブロットドライし；色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加えて、穏やかに叩いて十分に混合し；暗所においてそのマイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートし；各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを軽く叩くことによって穏やかに混合し；各ウェルの４５０ｎｍ／６２０ｎｍの吸光度を測定するものである。２種の市販の抗ＨＥＶ ＩｇＧキットでも、各々のアッセイ手順に従って厳密なアッセイを行った。
【０１４８】
結果は以下のとおり、すなわち、ＮＥ２Ｉを主体としたキットは、７〜１４日目までにＷａｎｔａｉおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｌａｂｓからの２種の市販のキットよりも早く抗体陽転を検出し；抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧの持続時間は、Ｇｅｎｅｌａｂｓの抗ＨＥＶ−ＩｇＧおよびＷａｎｔａｉの抗ＨＥＶ−ＩｇＧより長く；抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧの検出率は、２種の市販の抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットより高かった（図１０を参照のこと。表５に未処理データを示す）。無作為の３４件の健常者血清を検出した場合、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＧｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ３５％および１１％であり、後者は、完全に前者に含まれていた。肝炎患者の２６３件の臨床血清では、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＷａｎｔａｉ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ２７．２％および１０．６％であった。非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清では、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＧｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ６９．２％および２４．２％であった。一言で言えば、本発明のＮＥ２Ｉを素材とした抗ＨＥＶ−ＩｇＧは、市販の抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットよりも感度がよい。
【０１４９】
【表５】
【実施例１８】
【０１５０】
実施例１８ 本発明の組換えタンパク質をＨＲＰで標識する方法
超純粋（ＵＰＷ）にそれぞれ１ｍｇのＨＲＰ（ＢｉｏｚｙｍｅＲ／Ｚ＞３）およびＮａＩＯ４を溶解させ；攪拌しながらＮａＩＯ４溶液を滴下し；この混合溶液を室温で３０分間暗所に静置し；混合しながら１％のエチレングリコール溶液１００ｕｌを段階的に加え；それを４℃で３０分間暗所に静置する。組換えタンパク質を３時間炭酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．６）での透析にかけ；適度に透析した組換えタンパク質を酸素添加したＨＲＰに加え、炭酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．５）中、穏やかに攪拌しながら室温（または４℃）で６時間透析し；上述の混合物に新しく調製した０．１ＭのＮａＢＨ４溶液２０ｕｌを加え；暗所に４℃で２時間静置し、３０分間ずつ１回穏やかにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し；これをＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、４℃で終夜透析にかける。
【実施例１９】
【０１５１】
実施例１９ 生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する診断キット、および生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する捕捉アッセイ
実施例１８で記載した方法に従って、ポリペプチド２２５ＮをＨＲＰで標識した。
【０１５２】
ＨＲＰで標識した本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉを含有する、ＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する診断キットは、マウス抗ヒトＩｇＭμ鎖多クローン抗体（デンマークＤａｋｏ社）を予め塗布し、ブロッキング用緩衝液でブロッキングしたマイクロタイターストリップ；検体希釈剤（２０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢ、１％のカゼイン）；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で適切に希釈したＨＲＰ標識ポリペプチド２２５Ｎ）；２０×ＰＢＳＴ、色素原薬品Ａ、色素原薬品Ｂ、および停止溶液（ＷＡＮＴＡＩ社、Ｂｅｉｊｉｎｇ）など、生物活性のない材料を含む。
【０１５３】
この診断キットを使用する捕捉アッセイを以下のようにして、すなわち、マウス抗ヒトＩｇＭμ鎖多クローン抗体を予め塗布した各ウェルに希釈緩衝液１００ｕｌを加え；希釈緩衝液に検出対象の検体１ｕｌを加え；穏やかに叩くことによって十分に混合し；３７℃で３０分間インキュベートし；ＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレートを逆さにし、ティッシュペーパー上にしっかりと軽く叩くことによってブロットドライし；各ウェルに作用コンジュゲート（適切に希釈したＨＲＰ標識ポリペプチド２２５Ｎ）１００ｕｌを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし；再度５回洗浄し、ブロットドライし；次いで色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加え、穏やかに叩くことによって十分に混合し；暗所において３７℃で１０分間インキュベートし；各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを穏やかに叩くことによって混合し；各ウェルの吸光度をＯＤ450nm/620nmで測定することによって実施する。
【０１５４】
本発明に従って調製した抗ＨＥＶ−ＩｇＭ診断キットを使用して、前述の捕捉アッセイによって、肝炎患者の２６３件の臨床血清を検出にかけると、陽性率は１１％であり；また前記捕捉アッセイによって非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清を検出にかけると、陽性率は４８．４％であった。一方、Ｇｅｎｅｌａｂｓの抗ＨＥＶ−ＩｇＧ診断キットによって検出したこの９１件の血清検体の陽性率は、２４．２％に過ぎなかった。上記の結果が示すように、捕捉アッセイを利用して本発明の抗ＨＥＶ−ＩｇＭ診断キットによって検出された陽性検体は、臨床的な診断とよく一致している。さらに、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットによって検出された陽性検体の大部分も、この捕捉アッセイにおいて陽性である。すなわち、本発明の抗ＨＥＶ−ＩｇＭキット、ならびに前記捕捉アッセイは、臨床上のＨＥＶ診断において現存する市販のキットよりも感度および特異性が高い。
【実施例２０】
【０１５５】
実施例２０ 生物検定においてＨＥＶに対する全抗体を検出する診断キット、および生物検体においてＨＥＶに対する全抗体を検出する方法
実施例１８で記載した方法に従って、ポリペプチド２２５Ｎを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。
【０１５６】
本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２２５Ｎを含有する、ＨＥＶに対する全抗体を検出するキットは、組換えポリペプチドＮＥ２Ｉを予め塗布し、ブロッキング用緩衝液（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、２％のゼラチン）でブロッキングしたマイクロタイターストリップ；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で希釈したＨＲＰで標識したポリペプチド２２５Ｎ）；２０×ＰＢＳＴ、色素原薬品Ａ、色素原薬品Ｂ、および停止溶液（北京ＷＡＮＴＡＩ社）など、生物活性のない材料を含む。
【０１５７】
当該キットの検出プロトコルは、以下のとおり、すなわち、予めポリペプチドＮＥ２Ｉを塗布した前記ストリップのマイクロタイターに血清５０ｕｌおよび適切に希釈した組換えポリペプチド２２５ＮをＨＲＰで標識したもの５０ｕｌを加え；マイクロプレートのすべての側面を穏やかに叩いて混合し；３７℃で６０分間インキュベートし；マイクロプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレート逆さにすることによってブロットドライし；色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加え；次いでマイクロプレートを３７℃で１５分間インキュベートし；最後に各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを穏やかに叩いて混合し；各ウェルのＯＤ450nm/620nmの吸光度を測定するものである。
【０１５８】
得られた検出結果は、次のとおり、すなわち、本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２２５Ｎを主体とするサンドウィッチ式全抗ＨＥＶ抗体キットでの検出では、肝炎患者からの２６３件の臨床血清が陽性率５２％で検出されたが、ＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットでの検出では、１０．６％しか判定されなかった。さらに、同じサンドウィッチ式キットを使用して、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清を検出すると、陽性率は５４．９％であった。しかし、この９１件の血清において、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧによって検出された陽性率は、２４．２％に過ぎなかった。上記のデータが示すように、臨床的な診断において、当該診断キットでの検出は、現存する市販のキットに優っている。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｎ重合体ポリペプチド（Ｎは１〜１８０の整数である）の形の、配列番号１で示す、Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片；本発明のポリペプチドとインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質；Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来のエピトープを含むポリペプチド又はその免疫原性断片に結合した本発明のポリペプチド；上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター、及び本発明のポリペプチドを発現させることのできる、前記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。
【０００２】
本発明はさらに、上述のポリペプチドを含む、Ｅ型肝炎ウイルスに対処するワクチン組成物、又はＥ型肝炎ウイルス用のＩｇＧ、ＩｇＭ、もしくは全抗体診断キットを含めて、上述のポリペプチドを含むＥ型肝炎ウイルス感染用診断キット、並びにＥ型肝炎ウイルス感染の予防、診断、及び／もしくは治療のための、ワクチン組成物及び診断キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、経腸的に伝染した非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体として１９８３年に最初に確認された（Ｂａｌａｙａｎ等、１９８３年、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ第２０巻：２３ページ、）。Ｅ型肝炎は、主に、アジア、アフリカ、中央アメリカの開発途上国に特有である。先進国でのＥ型肝炎の症例は、ほとんど外国からの移民又は旅行者に見られた。散発性の症例も大規模な流行も報告されている。１９５０年代から１９９０年代の期間に、飲料水の汚染のために、Ｅ型肝炎の数件の大発生が連続して起こった（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ、１９５７年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．第４５巻：１〜３０ページ；Ｗｏｎｇ等、１９８０年、Ｌａｎｃｅｔ．第２巻：８８２〜８８５ページ；Ｍｙｉｎｔ等、１９８５年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第３４：１１８３〜１１８９ページ；Ｂｅｌａｂｂｅｓ等、１９８５年、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第１６巻：２５７〜２６３ページ；Ｈａｕ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第６０巻：２７７〜２８０ページ）。大部分のＥ型肝炎感染は、自己制限的であり、慢性に発展することはほとんどないが、妊婦については予後が重く、死亡率が１７％を上回る。（Ｔｓｅｇａ等、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ．第１４巻：９６１〜９６５ページ；Ｄｉｌａｗａｒｉ等、１９９４年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１３巻：４４〜４８ページ；Ｈｕｓｓａｉｎｉ等、１９９７年、Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．第４巻：５１〜５４ページ）。
【０００４】
１９９１年に、研究者等は、エンベロープをもたない１本鎖のプラスＲＮＡウイルスであるＨＥＶの最初の完全なゲノム配列を得た（Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ）。配列分析によって、ゲノムが７．２ｋｂであり、３つのオープンリーディングフレームを有することが示された。５’末端に位置するＯＲＦ１は、ウイルスの非構造タンパク質をコードし、３’末端に位置するＯＲＦ２は、ウイルスの主要な構造タンパク質をコードする。ＯＲＦ３ ５’末端には、ＯＲＦ１ ３’末端と重複した１ｂｐが存在する。ＯＲＦ３ ３’末端には、ＯＲＦ２末端と重複した３３９ｂｐが存在する。ＯＲＦ３が未知の機能を備えた別の構造タンパク質をコードすることが認められている（Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ；Ａｙｅ等、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２０巻：３５１２ページ；Ａｙｅ等、１９９３年、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ．第７巻：９５〜１０９ページ；Ｈｕａｎｇ等、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１９１巻：５５０〜５５８ページ；Ｒｅｙｅｓ等、１９９３年、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ Ｓｕｐｐｌ．第７巻：１５〜２５ページ）。
【０００５】
ＨＥＶ感染の検出は、長い間、主に免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）又は免疫蛍光技術に頼っていたが、このような技術は非常に複雑で高価であり、多くの研究所では実施しにくいものである。ＨＥＶゲノムがクローン化され、配列決定された後、ＥＲＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＰＣＲなどのようなより感度のよい技術が開発されて、ＨＥＶ感染の検出に使用されている。
【０００６】
血清ＨＥＶ抗体キットの開発が絶対的に必要であることは十分に認知されているが、感染したヒト又は動物が分泌するＨＥＶウイルスの濃度が非常に低いために、血清を抗原の供給源として使用することは不可能である。現在もなお、ＨＥＶ細胞培養の効率は非常に低く、これがＨＥＶを検出するために十分な抗原を利用できる可能性を制限した。したがって、ＨＥＶ抗体の検出は、依然として合成のポリペプチド又は組換え抗原に頼っている。残念なことに、多くの血清学的研究によって、合成ポリペプチド類又は異なるＨＥＶゲノム領域に由来する組換え抗原での整合性が大幅にずれていることが示された。たとえば、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ等（１９９２年、Ｌａｎｃｅｔ、第３９９巻：３２８〜３３１ページ）は、ＯＲＦ２ ３−２（Ｍ）抗原（ａ．ａ．６１３〜６６０、Ｍｅｘｉｃｏ株）を使用して、院内のＥ型肝炎ウイルス感染の症例を検出した。ＩｇＧの検出率は９１％であり、６〜１２カ月後には２７〜５０％に下がった。彼が３−２（Ｂ）（Ｂｕｒｍａ株由来の同じＯＲＦ２断片）を検出に使用したとき、検出率はほんの６４％であり、６〜１２カ月後には陽性の結果が見られなかった。それどころか、３−２（Ｍ）は、パキスタン人の対象の回復期血清と反応しないが、３−２（Ｂ）は、４．５年後に同じ症例の血清と反応した。このようなタンパク質では、抗体が陰性に逆転する場合もあれば、依然として力価が高いままである場合もあった。大腸菌中に発現したいくつかの線状エピトープを有するモザイクタンパク質を使用した場合の結果は類似していた。良好なＨＥＶ抗体キットがないことは、ＨＥＶに感染している間の抗体の動態を深くまで研究する制約になった。一般に、ＨＥＶに感染している間、特定のＩｇＧ抗体が初期の段階で検出可能になり、２〜４週間後に最高点に達し、急速に降下する。大部分は９カ月後に陰性に逆転するが、何年も後に陽性のままである患者もいる。最近では、急性相と回復期相の両方に由来する血清とも強く反応する、数種の組換え抗原がバキュロウイルス及び大腸菌中に発現されている。原則として、血清疫学調査にはこのような抗原がより適している。血清ＨＥＶ ＩｇＧの力価が、急性段階の後急速に降下するものの、なお検出可能なレベルに保たれるからである。抗体が、疾患の流行中に感染を防御することに関係しているということは特筆に価する。
【０００７】
他の手段では、現在のところ利用できる検出法が間接的な方法だけであるために、確立されたＨＥＶ ＩｇＭキットは、世界中で未だ開発されていない。間接的方法については、一方では検出結果が様々な要因によって影響されるので再現しにくく、他方では偽陽性の可能性が高く、陰性の値がより高く、又は感度が低いために結果の信頼性が低い。最近の報告によると、臨床サンプルを検出する際、ＩｇＭの結果が陽性であった場合、一般にＩｇＧも陽性であり、したがって、早期に診断されたその値は、限界があるものの、急性感染の診断特異性の向上において役立つといえる。
【０００８】
報告されているところでは、いくつかの合成ペプチド及び何らかの組換え抗原に対する抗体は、多くの感染対象において急速に消失するので、急性Ｅ型肝炎ウイルス感染の臨床的診断は、一般に臨床的な一致が高いＩｇＧ抗体に基づいているが、この方法の最も重大な欠陥は、過去の感染を最近の感染と区別できないことであり、これは、Ｅ型肝炎ウイルスが多く発生している区域においても、疫学的研究の際にＥ型肝炎ウイルス感染の有病率を評価する上でも、誤った診断をもたらすことになる。したがって、回復期血清に対する感度が高いことを特徴とする、信頼性があり、かつ感度のよい抗μ鎖ＩｇＭ診断キット及びＩｇＧ診断キットを開発することが早急に求められている。
【０００９】
近年では、高感度のＩｇＧ診断キットの開発に若干の進歩があった。Ｍａｓｔ等（１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ第２７巻：８５７〜８６１ページ）は、世界中の１０種の主要なＩｇＧ抗体ＥＩＡの包括的評価を提示している。既知の陽性血清の検出では多くのキットが実によく一致していたが、アメリカ人血液供与者の検出では、異なるキットで大きな相違があった。これは、非発生地域でのＨＥＶ有病率研究における結果の信頼性が低いことを示唆している。このようなキットの大部分の抗原は、ＨＥＶの線状エピトープを素材としていたが、２種のキットは、立体配座のエピトープを抗原として使用していた。１種目はＯＲＦ２．１（ａａ３９４〜６６０）であり、他方はバキュロウイルス中で発現させたＶＬＰ（ａａ１１２〜６０７）である。どちらの抗原も回復期抗体を検出できるが、これら２種の抗原の一致を比較した直接のデータは、今もまだ得られていない。これら２種の抗原が異なる抗体を識別することは可能である。さらに、ＶＬＰキットを使用して、流行のないアメリカで２０％近い有病率が報告され、これによってその特異性に疑いが生じたこともあった。しかし、ブタ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、ラット、野生のサル、及び飼われているサルでの陽性のＨＥＶ感染の報告、並びにメリーランド州の野生ラットとルイジアナ州の野生ラットの抗体有病率が、相違する７７％と４４％であることから、動物のＨＥＶは、その病原性による臨床疾患を引き起こし得ないものの、アメリカ人集団の抗体有病率が過小評価されている可能性はある。（Ｋａｂｒａｎｅ−Ｌａｚｉｚｉ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第６１巻：３３１〜３３５ページ）。さらに、ＯＲＦ２．１キットは、ＣＭＶ感染及び自己免疫疾患においてより高い陽性率を検出することができる。さらに、報告されているＯＲＦ２．１ポリペプチドは、ＧＳＴとのキメラタンパク質又はポリアルギニンとのキメラタンパク質であるが、実際には偽陽性の結果をもたらすことになる。
【００１０】
ＨＥＶでは細胞培養も組織培養も成功しておらず、大量のウイルスを得るための実際的な方法が未だ得られないので、遺伝子工学を通じて、旧来の死菌ワクチン又は弱毒ワクチンからサブユニットワクチン又はＤＮＡワクチンへと転換を図ることが唯一の研究手段である。
【００１１】
ＨＥＶ ＯＲＦ２は、５１４７に位置する塩基から始まって、１９８０個のヌクレオチドを有するものであり、主要な構造タンパク質であると推定されているアミノ酸６６０個のポリペプチドをコードするものであり、ウイルスのキャプシドを構成している。ＯＲＦ２タンパク質のＮ末端には、古典的なシグナル配列の後に、正の電荷を大量に帯びた領域であり、かつウイルス構築中にゲノムＲＮＡのキャプシド形成に関与すると考えられているアルギニン高含有領域が存在する。翻訳プロセスの間、ＯＲＦ２は、シグナルペプチド認識タンパク質（ＳＲＰ）の機構によって小胞体（ＥＲ）に侵入し、さらにグリコシル化され、ＥＲ内に蓄積し、次いでおそらくは揃ってキャプシドのキャプソメアを形成する。３箇所のＮ−グリコシル化部位、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−３１０、及びＡｓｎ−５６２が、ＯＲＦ２に位置している。これらは、異なるウイルス株間でも高度に保存されており、Ａｓｎ−３１０は、主要なグリコシル化部位である。ＯＲＦ２を形質移入した哺乳動物細胞ＣＯＳ、ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ−７、ＨｅｐＧ２は、それによって、細胞質にも膜にも見出される８８ｋＤの糖タンパク質を発現させることができる。これらのグリコシル化部位での突然変異は、ＰＯＲＦ２の細胞膜上への配置には影響を及ぼさない。しかし、シグナルペプチド配列がそこから除去された後では、細胞質中でしかＰＯＲＦ２を見出すことができない。これは、タンパク質の細胞膜上への配置にはグリコシル化でないＰＯＲＦ２の変化が必要なことを示唆している。ＨＢＶのＭＳタンパク質のように、ＰＯＲＦ２も、ゴルジ体の代わりにＥＲを介して細胞膜に直接分泌される可能性がある。形質移入した細胞の表面では、ｇｐＯＲＦ２はランダムに分布しておらず、あるゾーンに集中しているが、これはタンパク質サブユニットの合同プロセスが活性であることを示唆しており、ことによると凝集して、さらに指令された何らかの前進した形になる。ウイルスの最終的な構築／成熟には、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成が必要であるので、ＥＲの外の細胞質又は細胞膜の壁面内でこれを起こさなければならない。膜内のｇｐＯＲＦ２の蓄積は、ウイルス構築を示唆するといえる。同時に、膜上のキャプシドタンパク質の配置は、成熟したウイルスが出芽を経て細胞外へ分泌する可能性を示唆する。さらに記載すべき注目される点は、翻訳及び修飾機能を備えたｉｎ−ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＯＲＦ２の転写及び翻訳によって、８８ｋＤのｇｐＯＲＦ２を単量体と二量体の両方の形で産生できることである。ｇｐＯＲＦ２が相同的な二量体を形成する傾向があり、前記の相同的なｇｐＯＲＦ２二量体によってキャプシドのキャプソメアが構成されることが例示されている（Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻：２０７〜２１６ページ）。Ｌｉ等は、Ｆｒｏｓｔ Ｅｔｃｈｉｎｇ ｅｌｅｃｔｉｏｎ顕微鏡によって、バキュロウイルスによって発現した組換えＨＥＶ ＶＬＰが、直径２２〜２３ｎｍの６０個のｐ５０サブユニットでできた正二重面体の対称ビリオン（Ｔ＝１）を有することを発見した。この大きさの粒子の内腔は、約１ｋｂのＲＮＡを含むことができ、ＨＥＶゲノムは、長さ７．５ｋｂであるので、自然のＨＥＶは、Ｔ＞３の結晶格子構造であると推測されるが、キャプソメアの形態上の構造は類似している。Ｔ＝３サブユニットの総数は、９０個のキャプソメアである（Ｌｉ等、１９９９年、ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ）。
【００１２】
上記のことによると、ＨＥＶは、エンベロープをもたないウイルスである。ウイルスのキャプシドは、ＯＲＦ２によってコードされたタンパク質でできている。このタンパク質には、主要な免疫エピトープおよび一部の中和性エピトープが組み込まれており、サブユニットワクチンを研究する際、最も好都合な断片となる。
【００１３】
米国特許第５，８８５，７６８号のＲｅｙｅｓ等の最初の報告では、４匹のカニクイザルに、ＨＥＶ Ｂｕｒｍａ株ＯＲＦ２ Ｃ末端２／３（ａａ２２５〜６６０）を含む大腸菌中に発現させた組換えタンパク質ｔｒｐＥ−Ｃ２にミョウバンアジュバントを配合したものを、０、３０日で５０μｇ／１回分を投与することによって筋肉内注射した。別の２匹のサルを対照として使用し、アジュバントのみを与えた。４週間後、収集血液の抗体の増加に関する陽性の結果で、ウェスタンブロット法によって見出されたものはなかった。８０μｇのアジュバント未配合不溶性組換えタンパク質を投与することによる、そのうちの２匹のサルでの３回目の免疫化。４週間後、どちらのサルも陽性であった（ＷＢ）。次いで、６匹のサルを、各々が３匹のサルを含む第一群と第二群に分けたが、そのうちの２匹が３回又は２回の接種によって免疫化されており、１匹が対照である。第一群にはＢｕｒｍａＨＥＶを接種し、第二群にはＭｅｘｉｃｏＨＥＶを接種した。結果は、（１）免疫化した群ではＡＬＴが常に正常であったが、対照では免疫化前よりも６〜１０倍高く上昇した。（２）免疫蛍光法によって肝臓生検試料で検出を行った。３回の投与で免疫化し、Ｂｕｒｍａ株を接種したものを除くすべてのサルで抗原が発見された。（３）３回の投与で免疫化し、Ｂｕｒｍａ株を接種したものを除くすべてのサルで、糞便中へのウイルスの排泄が連続的に見出された。この研究の検体は少ないが、ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質が、ウイルス肝炎の生化学指数を出さないようにし、サルが野生のＨＥＶを接種された場合には、感染から完全に防御したことを示唆している。
【００１４】
Ｔｓａｒｅｖ等（１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９１巻：１０１９８〜１０２０２ページ；Ｔｓａｒｅｖ等、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１６８巻：３６９〜３７８ページ；Ｔｓａｒｅｖ等、１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ第１５巻：１８３４〜１８３８ページ）は、昆虫（ＳＦ細胞）中のバキュロウイルスを使用して、ＨＥＶ ＯＲＦ２を発現させ、細胞溶液中に２０ｎｍ〜３０ｎｍの様々な大きさのタンパク質粒子を得た。感染細胞の分裂後期には、より小さい粒子の百分率が実質的に増大する。ＷＢ法を使用して、バキュロウイルスによって発現させたＯＲＦ２を検出すると、２５ｋＤ、２９ｋＤ、３５ｋＤ、４０〜４５ｋＤ、５５〜７０ｋＤ、７２ｋＤに大きさの異なる多数の特定のバンドが検出された。イオン交換法及び分子スクリーニング法を使用して、ＨＥＶに特異的なタンパク質を精製した。細胞に組換えウイルスを感染させた後１日目に、７２ｋＤの全ＯＲＦ２ペプチドが最初に出現し、次いで徐々に消失した。２日目には、６３ｋＤ及び５５ｋＤのペプチドが出現した。５３ｋＤのペプチドは、初日に大量に細胞溶液中に出現し、３日目に最高点に達した。これは、最初の７２ｋＤのタンパク質がランダムに切断されて、５５ｋＤ（細胞溶解溶液中）及び／又は５３ｋＤ（細胞溶液）のＨＥＶタンパク質となることを示唆している。これら２種のタンパク質の配列決定によって、５５ｋＤがＯＲＦ２のａａ１１２〜６０７に位置することが示されたが、５３ｋＤがａａ１１２〜５７８に位置し、６３ｋＤがａａ１１２〜６６０に位置することも示された。ＥＬＩＳＡの結果は、５５ｋＤの活性が５３ｋＤよりも明らかに強いことを示した。昆虫内のバキュロウイルス中にａａ１１２〜６６０断片が発現した場合、６３ｋＤに加え、５５ｋＤの組換えＨＥＶタンパク質も見出される。
【００１５】
細胞を感染させてから７日目にＳＦ９細胞を収集した。タンパク質を一次精製し、ミョウバンアジュバントと併せた。次いで、１回に５０μｇのタンパク質の筋肉内注射によってカニクイザルを免疫化した。４匹には１回分を与え、他の４匹には２回分を与えた（０ｄ、２８ｄ）。最終投与の後、同じＨＥＶ系統（ＳＡＲ−５５、パキスタン人患者由来）の１０００〜１００００ＣＩＤ５０の投与量ですべてのサルに静脈内接種をした。１５週間以内の、肝臓生検材料、血清、及び大便を毎週収集した。１回投与のサルでのウイルス接種前の抗体の力価は、１：１００〜１：１００００であったが、２回投与群では、すべて１：１００００であった（精製された５５ｋＤでコートされていた）。１回投与群では、ウイルス接種後９週間で１匹のサルが麻酔事故のために死亡した（結果では計算されている）。２回投与群では、ウイルス接種後すぐに２匹のサルが原因不明で死亡した（結果では計算せず）。免疫化後の６匹のサルに、ＡＬＴの上昇もしくは肝臓生検の病理学的変化は見受けられず、ウイルス血症もなかった。１回投与群の４匹のサルでは、３匹がウイルスを排泄したが、２回投与群の２匹のサルでは、ウイルスの排泄が見られなかった。
【００１６】
イオン交換法及び分子篩法によってバキュロウイルス系に発現させた５５ｋＤのタンパク質をさらに精製して、精製が９９％超に到達するようにした。ミョウバンアジュバントと併せた後、１回分が５０μｇ、１０μｇ、２μｇ、０．４μｇ、０μｇ（対照）のタンパク質を４匹のアカゲザルにそれぞれ注射し、０及び２８日投与した。最終投与後の４週間目に、同じウイルス（ＳＡＲ−５５）をサルに接種した。免疫化群の１６匹のサルは、すべて正常であり、２μｇ投与の１匹のサル及び０．４μｇ投与の他のサルだけに、非常に軽度の病理学的変化が現われた。免疫化されたサルは、感染したが、肝炎を予防することができた。５０μｇ投与の１匹のサル及び１０μｇ投与の他のサルを除き、免疫化したすべてのサルにウイルスの排泄、及びウイルス血症も見られた。ほとんどのサルのウイルス量が制限されたが、期間は短縮されなかった。別の４匹のサルは、２×５０μｇで免疫化し、最終投与後４週間目に１００，０００ＭＩＤ５０の他のＨＥＶを接種した。結果は同様であった。４匹のサルがすべて、ＡＬＴの上昇及び病理学的変化を示したわけではなかったが、１匹のサルだけはウイルス排泄及びウイルス血症を示さなかった。ウイルス量は、明らかに減少したが、期間は短縮されなかった。著者の意見によると、これらのサルでの全面的な防御の効果は、前回よりも悪かった。接種に使用したウイルス量が一因である可能性がある。この実験でのウイルス量は、３００，０００に達したが、前回は１０００〜１００００ＭＩＤ５０であった。さらに、０．４μｇ〜５０μｇ群の抗体の力価は、接種前には差を示さなかった。
【００１７】
Ｇｅｎｅｌａｂｓ ｃｏｍｐａｎｙのスタッフは、同じ昆虫内バキュロウイルスを使用してＯＲＦ２ａａ１１２〜６６０を発現させ、大量の可溶性組換え６２ｋＤタンパク質を得た。精製した後、カニクイザルに免疫化を施すと、投与量１０００ＣＩＤ５０のウイルス（Ｍｅｘｉｃｏ株）接種から防御された（２０μｇで免疫化した３匹のサルは、罹患しなかった。２匹のサルではウイルスの排泄が見られず、１匹のサルでウイルス排泄量が減少した）。（Ｚｈａｎｇ等、１９９７年、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４巻：４２３〜８ページ。）
【００１８】
ＭｃＡｔｅｅ等（１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ第８巻：２６２〜２７０ページ）は、組換えバキュロウイルス中に発現させたＢｕｒｍａＯＲＦ２の６２ｋＤ二量体を調製した。ＨＰＬＣ−ＭＳによって、この二量体を別々に分離して、５６．５ｋＤと５８．１ｋＤの２本のペプチドにした。ペプチド集合体のフィンガープリント解析では、この２本のペプチドのＮ末端が同じａａ１１２であり、Ｃ末端がａａ６３７及びａａ６５２で異なっていることが示された。さらに、５６．５ｋＤのタンパク質は、非常に良好な免疫原であった。
【００１９】
オーストラリアのＡｎｄｅｒｓｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．第８１巻：１３１〜１４２ページ；Ｌｉ等、１９９４年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．第３２巻：２０６０〜２０６６ページ；Ｌｉ等、１９９７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第５２巻：２８９〜３００ページ；Ｌｉ等、２０００年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第６０巻：３７９〜３８６ページ）は、大腸菌中に発現させたＯＲＦ２のａａ３９４〜６６０（ＯＲＦ２．１）を使用した。この産物は、ＧＳＴとのキメラタンパク質又はポリアルギニンタンパク質であり、高次構造の回復期エピトープを形成し得る。このエピトープは、回復期血清を非常に高率で検出できるが、断片のＮ末端側に伸長又は切断があった場合に消失する。ラットを組換えＯＲＦ２．１タンパク質で免疫化した後３０週目の血清を使用して、バキュロウイルス中に発現させたＶＬＰを被覆抗原として有する回復期の患者からの血清にブロッキングをかけた。阻止率は、８１％〜８６％に達することになる。ＯＲＦ２．１タンパク質で単クローン抗体を調製すると、ＯＲＦ２．１の立体配座エピトープを識別できる２種の単クローン抗体２Ｅ２及び４Ｂ２と、識別可能な５種の単クローン抗体らしいものを得た。抗原としてＶＬＰを有する回復期血清に２Ｅ２又は４Ｂ２のどちらを使用してブロッキングをかけても、阻止率は、６０％に達し得る。これは、これら２種の単クローン抗体が、エピトープを識別でき、回復期血清中で抗体によって識別されるエピトープの主要な構成要素であることを示唆している。別のデータによって、ＯＲＩＦ２．１が、ＶＬＰにかなり類似した主要なエピトープ構造を有することが示された。このエピトープへの抗体は、ＨＥＶ感染血清中に長期間存在し得る。このエピトープは、重要な防御エピトープであるが、ＯＲＦ２．１についての動物の防御実験は、今までに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，８８５，７６８号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｂａｌａｙａｎ等、１９８３年、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ第２０巻：２３ページ
【非特許文献２】Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ、１９５７年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．第４５巻：１〜３０ページ
【非特許文献３】Ｗｏｎｇ等、１９８０年、Ｌａｎｃｅｔ．第２巻：８８２〜８８５ページ
【非特許文献４】Ｍｙｉｎｔ等、１９８５年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第３４：１１８３〜１１８９ページ
【非特許文献５】Ｂｅｌａｂｂｅｓ等、１９８５年、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第１６巻：２５７〜２６３ページ
【非特許文献６】Ｈａｕ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．第６０巻：２７７〜２８０ページ
【非特許文献７】Ｔｓｅｇａ等、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ．第１４巻：９６１〜９６５ページ
【非特許文献８】Ｄｉｌａｗａｒｉ等、１９９４年、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１３巻：４４〜４８ページ
【非特許文献９】Ｈｕｓｓａｉｎｉ等、１９９７年、Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．第４巻：５１〜５４ページ
【非特許文献１０】Ｔａｍ等、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１８５巻：１２０〜１３１ページ
【非特許文献１１】Ａｙｅ等、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２０巻：３５１２ページ
【非特許文献１２】Ａｙｅ等、１９９３年、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ．第７巻：９５〜１０９ページ
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇ等、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１９１巻：５５０〜５５８ページ
【非特許文献１４】Ｒｅｙｅｓ等、１９９３年、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ Ｓｕｐｐｌ．第７巻：１５〜２５ページ
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ等、１９９２年、Ｌａｎｃｅｔ、第３９９巻：３２８〜３３１ページ
【非特許文献１６】Ｍａｓｔ等、１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ第２７巻：８５７〜８６１ページ
【非特許文献１７】Ｋａｂｒａｎｅ−Ｌａｚｉｚｉ等、１９９９年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第６１巻：３３１〜３３５ページ
【非特許文献１８】Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻：２０７〜２１６ページ
【非特許文献１９】Ｌｉ等、１９９９年、ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ
【非特許文献２０】Ｔｓａｒｅｖ等（１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９１巻：１０１９８〜１０２０２ページ
【非特許文献２１】Ｔｓａｒｅｖ等、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１６８巻：３６９〜３７８ページ
【非特許文献２２】Ｔｓａｒｅｖ等、１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ第１５巻：１８３４〜１８３８ページ
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ等、１９９７年、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４巻：４２３〜８ページ
【非特許文献２４】ＭｃＡｔｅｅ等、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ第８巻：２６２〜２７０ページ
【非特許文献２５】Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．第８１巻：１３１〜１４２ページ
【非特許文献２６】Ｌｉ等、１９９４年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．第３２巻：２０６０〜２０６６ページ
【非特許文献２７】Ｌｉ等、１９９７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第５２巻：２８９〜３００ページ
【非特許文献２８】Ｌｉ等、２０００年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第６０巻：３７９〜３８６ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の概要）
本発明の一態様では、ｎ重合体ポリペプチド（ｎは１〜１８０の整数である）の形の、Ｅ型肝炎ウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２（配列番号１で示す）のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片であって、前記の配列番号１で示すＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２又はその断片のアミノ酸を含むポリペプチドが、
１）アミノ末端がアミノ酸残基１１３と４６９の間から出発し、カルボキシル末端がアミノ酸残基５９６と６６０の間で終結しているポリペプチド、
２）アミノ末端がアミノ酸残基３７０と４６９の間から出発し、カルボニル末端がアミノ酸残基６０１と６２８の間で終結しているポリペプチド、
３）アミノ末端がアミノ酸残基３９０と４５９の間から出発し、カルボキシル末端がアミノ酸残基６０１と６１０の間で終結しているポリペプチド、
４）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２４７、
５）配列番号１のアミノ酸残基４２９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３２、
６）配列番号１のアミノ酸残基４３９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２２、
７）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０１、
８）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３５Ｎ、
９）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６１８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２５Ｎ、
１０）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０９Ｎ、
１１）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０８Ｎ、
１２）配列番号１のアミノ酸残基３９４〜６０６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチドＮＥ２Ｉ、
１３）配列番号１のアミノ酸残基３９０〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２１７Ｄ、
１４）配列番号１のアミノ酸残基３７４〜６１８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０５、
１５）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド１８９、
１６）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６０１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド１８８、
１７）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
１８）Ｎ末端にＭｅｔが付加され、Ｃ末端の３’末端上のアミノ酸残基６０３のＰｒｏにおいて、５’〜３’方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されてＣ末端が修飾されている、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
ａ）Ｘがアミノ酸残基３９４である場合の、配列番号２で示す前記ポリペプチド、すなわちＮＥ２、
ｂ）Ｘがアミノ酸残基４１４である場合の、配列番号３で示す前記ポリペプチド、すなわち１９３Ｃ、
ｃ）Ｘがアミノ酸残基４２９である場合の、配列番号４で示す前記ポリペプチド、すなわち１７８Ｃ、
ｄ）Ｘがアミノ酸残基４３９である場合の、配列番号７で示す前記ポリペプチド、すなわち１６８Ｃ、
ｅ）Ｘがアミノ酸残基４４９である場合の、配列番号８で示す前記ポリペプチド、すなわち１５８Ｃ、
ｆ）Ｘがアミノ酸残基４５９である場合の、配列番号９で示す前記ポリペプチド、すなわち１４８Ｃ、
ｇ）Ｘがアミノ酸残基４６９である場合の、配列番号１０で示す前記ポリペプチド、すなわち１３８Ｃが含まれるもの
からなる群から選択されているポリペプチドを提供する
本発明の別の態様では、上の１）から１８）で表される前述のポリペプチドのいずれか１つとの相同性が少なくとも８０％であり、抗原性や免疫原性など、生物学的特性がほぼ同一であるポリペプチドをさらに提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明はさらに、上述の本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも提供する。もう１つの態様では、本発明はさらに、本発明のポリペプチドを発現させることのできる、上記の組換え発現ベクターのいずれか１種で形質転換した宿主細胞も提供する。
【００２４】
本発明の別の態様では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドもしくはその任意の組合せ、及び場合により薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物をさらに提供する。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素抗原の保存断片を含むキメラタンパク質をさらに提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物であって、本発明のポリペプチドの１種とインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質、並びに任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／又はアジュバントを含む組成物も提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物にワクチン接種を施してＥ型肝炎ウイルス感染を予防するための、上述のワクチン組成物の使用を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明はさらに、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するための方法であって、対象に、予防及び／もしくは治療有効量の少なくとも１種の上述のポリペプチド、又は上述のポリペプチドの少なくとも１種及びインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片からなるキメラタンパク質を投与することを含む方法も提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明はさらに、診断に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含む、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断するための診断キットも提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断するための診断キットであって、診断に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含み、さらにＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来免疫原性エピトープを含有するポリペプチド又はその免疫原性断片も含み、前記のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来免疫原性エピトープを含有するポリペプチド又はその免疫原性断片が、任意選択で前記ポリペプチドに共有結合しているキットも提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断する方法であって、抗原と抗体の相互作用に適する条件下、上述の診断キットと検出対称の検体とを接触させることを含む方法も提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明はさらに、生物検体において、Ｅ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法、Ｅ型肝炎ウイルスに対するＩｇＧ抗体を検出する方法、及びＥ型肝炎ウイルスに対するＩｇＭ抗体を検出する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ポリペプチド２０１を発現するプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１の作製を示す略図である。
【図２】発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１で形質転換した誘導大腸菌の培養物可溶化液（培地を遠心分離にかけるステップ、沈殿した細胞を収集するステップ、次いでペレットを０．１％のＳＤＳを含む供給液で再懸濁させるステップ、これを沸騰湯中で１０分間さらに処理するステップ、次いで１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離するステップ、上清を取り出して測定するステップを経た）に関して、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色）によって分析した結果を示す図である。レーン１および２は、それぞれ２種の異なる細菌培養物可溶化液を含む。Ｕｖｉゲル画像処理システム（ＵＶＩｔｅｃ，ｌｔｄ．、型式ＤＢＴ−０８）によって解析すると、発現された産物は総タンパク質のほぼ３５％までになる。
【図３】４回分のポリペプチド２０１からの精製ポリペプチド２０１の封入体の２Ｍおよび４Ｍ尿素溶液に関する、クーマシーブルーＲ２５０で染色を行った１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の解析結果を示す図であり、前記試料は、発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１が組み入れられている組換え大腸菌から得る。この結果は、二量体ポリペプチドの割合が１０％〜６０％に変動しており、再生を経て二量体ポリペプチドを形成したポリペプチド２０１が若干あることを示している。再生割合は、１×ＰＢＳ（２０×ＰＢＳ（１Ｌ）：Ｎａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ、７３．３４４ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、４ｇ；ＮａＣｌ、１６３．６３２ｇ；ＫＣｌ、４．０２４ｇ、ｐＨ７．４５）中で再生した試料よりも低い。図４で示すように、二量体の百分率は９９％である。
【図４】ポリペプチド２０１とＨＥＶ感染患者からの血清のウェスタンブロット分析結果を示す図である。レーン１〜３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ対照であり、レーン１はタンパク質分子量マーカーであり、レーン２は、１×ＰＢＳ中の再生ポリペプチド２０１試料であり、レーン３は、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生ポリペプチド２０１であり、レーン４および５は、それぞれレーン２および３の試料に対応するウェスタンブロット結果である。
【図５】前述のポリペプチド２０１の、動的光散乱計による水和状態の動的半径から得た結果を示す図であり、ポリペプチド２０１は、ゲル濾過ＨＰＬＣによって予め精製し、１０分間２００００ｇで遠心分離し、０．１ｕｍの濾過膜で濾過してある。
【図６】ポリペプチド２０８Ｎ、２０９Ｎ、および２２５Ｎと、マウスのＭａｂ１Ｆ６、２Ｃ９、および３Ｆ５との反応のウェスタンブロット結果を示す図である。レーン１、２、３はそれぞれ、ポリペプチド２０８Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン４、５、６はそれぞれ、ポリペプチド２０９Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン７、８、９はそれぞれ、ポリペプチド２２５Ｎの、沸騰湯浴中で１０分間処理した再生試料、再生試料、および沈殿させた再生試料に対応し、レーン１０は、対照としての単量体ポリペプチド２０１である。
【図７】様々な投与量の（フロイントアジュバントを含有する）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図８】様々な投与量の（アジュバントを含まない）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図９】様々な投与量の（アジュバントとして水酸化アルミニウムを含有する）ポリペプチド２０１ワクチンで免疫化した後のマウスの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、および１０Ｄは、それぞれＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、およびＮｏ．１３にグループ分けしたアカゲザルの血清中に産生されたＨＥＶ抗体のプロフィールを示すグラフである。これらの対象動物にはすべて、静脈内注射によってＨＥＶを接種している。水平座標は、最初の免疫化からの日数である。垂直座標は、ＥＬＩＳＡによって測定したＯＤ450nm/620nmである。この結果は、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、およびＮｏ．３の群のサル血清中に、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧがＧＥＮＥＬＡＢＳ−ＩｇＧおよびＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧより５〜１０日早く存在していること、ならびにＮｏ．１３のサルの血清において抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧは検出可能であるが、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧおよびＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧは、ＮＯ．１３のサル血清中に検出されないことを例示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
別段の指示がない限り、本明細書で使用する用語又は術語は、当技術分野で通常使用されているものと同じである。細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学的手順における通常の製造が、当技術分野で定型化した技術として実施される。本発明では、別段の指示がない限り、本明細書で使用するこれらの用語は、以下のような意味である。
【００３５】
「Ｅ型肝炎ウイルス」又は「ＨＥＶ」は、ｉ）水系感染による肝炎を引き起こし、ｉｉ）血清学的特性に関して、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）と区別し、ｉｉｉ）ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に挿入された１．３３ｋｂのｃＤＮＡに相同的なゲノム領域を含むウイルス、ウイルスの型、又はウイルスのクラスを指し、前記プラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に目録番号６７７１７で保管されている大腸菌株の中に含まれている。
【００３６】
本発明のポリペプチド
一態様では、本発明は、驚くべきことに、抗体との十分な反応性及び／又は免疫原性を有する一連のＨＥＶポリペプチド断片であり、配列番号１で示すＨＥＶ ＯＲＦ２のアミノ酸配列中に含まる断片を提供する。個々の断片の名称は、実施例６の表１に出ている。
【００３７】
本発明における、アミノ酸配列内の配置によるアミノ酸残基の番号付けは、国際純正及び応用化学連合及び国際生化学連合、Ｊｏｉｎｔ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、「アミノ酸及びペプチドの命名及び記号表示（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．第５６巻、５９５〜６２４ページ（１９８４年）の発番方式に従う。具体的には、配列番号１のコード出発部位Ｍｅｔを１位と示し、５’から３’の方向に大きくなる。
【００３８】
本発明の一態様では、ｎ−重合体ポリペプチド（ｎは１〜１８０の整数である）の形の、配列番号１で示す、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドを提供する。ｎが２であるとき、前記ポリペプチドは二量体ポリペプチドであり、ｎが３であるとき、前記ポリペプチドは三量体ポリペプチドであり、ｎが４であるとき、前記ポリペプチドは四量体ポリペプチドであり、以下同様である。
【００３９】
本発明では、配列番号１で示すアミノ酸配列を含む前記ポリペプチド断片のアミノ末端（５’末端）は、アミノ酸残基１１３と４６９の間、好ましくはアミノ酸残基３７０と４６９の間、より好ましくはアミノ酸残基３９０と４５９の間から出発し、前記ポリペプチドのカルボキシル末端（３’末端）は、アミノ酸残基５９６と６６０の間、好ましくはアミノ酸残基６０１と６２８の間、より好ましくはアミノ酸残基６０１と６１０の間で終結する。具体的には、本発明の好ましいポリペプチドは、ポリペプチド２４７、ポリペプチド２３２、ポリペプチド２２２、ポリペプチド２０１、ポリペプチド２３５Ｎ、ポリペプチド２２５Ｎ、ポリペプチド２０９Ｎ、ポリペプチド２０８Ｎ、ポリペプチドＮＥ２Ｉ、ポリペプチド２１７Ｄ、ポリペプチド２０５、ポリペプチド１８９、ポリペプチド１８８、及び配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００４０】
本発明はさらに、Ｎ末端にＭｅｔが付加され、Ｃ末端の３’末端上のアミノ酸残基６０３のＰｒｏにおいて、５’〜３’方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されてＣ末端が修飾されている、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ〜６０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関するものであり、これには、ａ）ＮＥ２、ｂ）１９３Ｃ、ｃ）１７８Ｃ、ｄ）１６８Ｃ、ｅ）１５８Ｃ、ｆ）１４８Ｃ、ｇ）１３８Ｃが含まれる。
【００４１】
別の態様では、本発明はさらに、前述のポリペプチドのいずれか１種との相同性が少なくとも８０％であり、抗原性や免疫原性など、生物学的特性がほぼ同一であるポリペプチド、すなわち、本発明のポリペプチドの派生物に関する。具体的には、このポリペプチドは、前記ポリペプチドのアミノ酸が、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と共に、当該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に隣接する、自然配列でないアミノ酸を含むが、それでも抗原性や免疫原性など、生物学的特性が当該ポリペプチドとほとんど類似したままであるという条件の本発明のポリペプチド派生物であると考えられる。したがって、同じ物に相当するＤＮＡ断片を本発明の派生ＤＮＡと称する。たとえば、発現及び／又は精製の目的のために、そのＮ末端に開始アミノ酸（メチオニン）又は他のリーディングペプチド及び／もしくはシグナルペプチドを加える、あるいはそのＣ末端にいくつかのヒスチジンを加えることによってその精製が促進される。
【００４２】
本発明はさらに、抗原性及び／もしくは免疫原性など、生物学的特性が前述のポリペプチドのいずれか１種と同一であるポリペプチド、又は前述のポリペプチドのいずれか１種との配列同一性が少なくとも８０％であるポリペプチドも考えている。用語「同一性百分率」は、最適に並べ合わせて得た２種の比較しようとする配列間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率を表すものとし、この百分率は単に統計的なものであり、２配列間の相違は、ランダムに、かつその全長にわたって分布している。２種のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の配列比較は、その各配列を最適に並べ合わせた後にこれらの配列を比較することによって従来どおりに実施し、局所領域の配列類似性を特定及び比較するためには、区分又は「比較のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」によって前記の比較を行う。比較のための最適な配列の並べ合わせは、手作業でなく、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）のＡｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．第２巻：４８２ページの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３ページの局所相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８５巻：２４４４ページの類似性検索法、並びにこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（米国ウィスコンシン州マディソン５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって生じさせる。
【００４３】
２種の核酸配列又はアミノ酸配列の同一性百分率は、最適に並べ合わせたその２種の配列を比較することによって決定するが、その２種の配列の最適な並べ合わせでも、比較対象の核酸配列又はアミノ酸配列が基準配列に対して付加又は欠失を含んでいるかもしれない。同一性百分率は、２種の配列間でヌクレオチド又はアミノ酸残基が一致する同一位置の数を決定し、これを比較する位置数で割り、得られた結果を１００倍することによって計算して、この２種の配列間の同一性百分率を得る。
【００４４】
たとえば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌから入手できるプログラムＢＬＡＳＴ「ＢＬＡＳＴ２配列」が使用できるが、これでは、パラメータはデフォルト（特に、空のギャップペナルティーは５、伸長のギャップペナルティーは２であり、行列はプログラム「ｂｌｏｓｕｍ６２」などによって得る）であり、並べ合わせる２種の配列間の同一性百分率は、このプログラムによって直接に計算される。
【００４５】
本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、化学的合成方法や組換えＤＮＡ技術など、当技術分野で知られている方法によって調製できる。好ましくは、本発明のポリペプチドの調製方法は、組換えＤＮＡを発現させることによって行うことができる。組換えタンパク質を調製する方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書で詳細に述べる必要はないが、実施例中の方法を参照することもできる。組換えタンパク質の産生に使用できる細胞に関して言及すべきものとしては、細菌細胞（Ｐ．Ｏ．Ｏｌｉｎｓ及びＳ．Ｃ．Ｌｅｅ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５２０〜５２５ページ）、酵母細胞（Ｒ．Ｇ．ｂｕｃｋｈｏｌｚ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５３８〜５４２ページ）、動物細胞、特に哺乳動物細胞培養物（Ｃ．Ｐ．Ｅｄｗａｒｄｓ及びＡ．Ａｒｕｆｆｏ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５５８〜５６３ページ）、及び昆虫細胞がある。昆虫細胞での方法については、たとえば、バキュロウイルス（Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第４巻：５６４〜５７２ページ）を参照されたい。これに関して、本発明はさらに、上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも提供する。本発明はさらに、そこに含まれるヌクレオチド配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現させることのできる、上述の組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞も提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態では、大腸菌を使用して、次の本発明のポリペプチド、すなわち、ポリペプチド２４７、ポリペプチド２３２、ポリペプチド２２２、ポリペプチド２０１、ポリペプチド２３５Ｎ、ポリペプチド２２５Ｎ、ポリペプチド２０９Ｎ、ポリペプチド２０８Ｎ、ポリペプチドＮＥ２Ｉ、ポリペプチド２１７Ｄ、ポリペプチド２０５、ポリペプチド１８９、ポリペプチド１８８、及びポリペプチドａ）ＮＥ２、ｂ）１９３Ｃを個々に発現させる。
【００４７】
前記ポリペプチドの単量体と二量体の比、重合体ポリペプチドの生成量、及びその個々のラジウムを測定する（詳細は実施例６を参照のこと）。結果として、発現した産物は、リフォールディングされる傾向があることが示されている。リフォールディング後に溶液中に安定な重合体が自己生成する能力によって、ＨＥＶを予防及び／又は治療するためのワクチンとして使用するのに特に適する本発明のポリペプチドができる。本発明の実施形態の１つでは、ある試験で、二量体、三量体、及び四量体を含む重合体が検出されている。現在の方法では限度があるが、推定上の三量体は、実際には二量体と四量体の適切な比の混合物でできている可能性がある。方法論が向上することによって、本発明のポリペプチドがより大きなポリペプチドを生成し得ることも想定できる。刊行された参照文献（Ｊａｍｅｅｌ等、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第７０巻：２０７〜２１６ページ；Ｌｉ等、１９９９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２６５巻：３５〜４５ページ）から推論すると、自然のＨＥＶは９０個の小粒子からなり、各小粒子がＯＲＦ２ポリペプチドの二量体である可能性が高い。したがって、本発明のポリペプチドは、最高で１８０重合体のポリペプチドである重合体、又はそれよりも長い重合体を形成し得ると予想するのが妥当であり、ウイルスの構造を知る上での進展となる。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態では、封入体の形のポリペプチド２０１が大腸菌によって高い収率で発現されるが、発明者は、驚くべきことに、前記封入体がｐＨ７．４５のＰＢＳ緩衝液中で自発的に自己再生でき、これによって、塩酸グアニジンを加え、次いで多段階の透析にかけるステップを含めて、実質的に回収率を低下させる、時間がかかりかつ冗長な従来の変性／再生プロセスが回避されることを発見した。その上、大腸菌によって同時に発現される他の望ましくないタンパク質封入体は、自発的に自己再生できないので、単に遠心分離し、上清を回収することによって、本発明の問題のタンパク質が実質的に精製できる。
【００４９】
本発明のポリペプチドとインフルエンザウイルス由来赤結集凝集素抗原の保存断片からなるキメラタンパク質
本発明の別の態様では、上述のポリペプチドのいずれか１種とインフルエンザウイルス由来赤血球凝集素抗原の保存断片とからなるキメラタンパク質も提供する。赤血球凝集素抗原（以下ではＨＡと示す）は、２種のインフルエンザウイルス表面抗原の１つであり、対象血清中のインフルエンザウイルスに対する抗体を特異的に検出する際に使用される最もよく導入される抗原である。動物にＨＡをワクチン接種して産生させた抗体によって、レシート（ｒｅｃｅｉｐｔ）がインフルエンザウイルスに再感染するのを有効に予防できることは知られている。したがって、ＨＡに対する抗体が集団の大部分に与えられていると考えるのが妥当である。これまでの報告（ＭｃＥｗｅｎ Ｊ．等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２年；第１０巻（６）：４０５〜１１ページ）によると、エピトープ９１〜１０８ａａは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ３株すべてのＨＡ遺伝子中にある保存アミノ配列である。本発明の好ましい一実施形態ではまず、遺伝子工学によって、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなど、免疫原性の高い本発明のＨＥＶ ＯＲＦ２遺伝子のポリペプチド断片に、ＨＡ遺伝子（９１〜１０８ａａ）を柔軟に連結して、原核生物発現系、特に大腸菌中でのキメラ発現を確立させる。次いで、予めインフルエンザウイルスを感染させることによって産生させたＨＡ抗体で追加免疫を行って、力価の高い防御的な抗ＨＥＶ抗体を得る。この方法では、本発明のポリペプチドのＯＲＦ２断片だけを含むワクチンに優るＨＥＶワクチンが得られる。
【００５０】
本発明での教示を考えて、当分野の技術者は、ＨＡ遺伝子中の他の保存断片から、本発明のワクチン組成物に有用なエピトープを選沢することもできる。ＨＡの特定のエピトープと本発明のポリペプチドを連結する特定の柔軟なリンカーについては、適切なペプチド断片又はその類似体からなっていてよいが、ただし、本発明のポリペプチドと選択されたＨＡ断片の連結を助長し、哺乳動物のＨＥＶ感染の予防／治療に関して本発明のポリペプチドの使用にほとんど影響を及ぼさないものとする。本発明のポリペプチドとＨＡを連結するリンカーの選択が、主として選択された本発明のポリペプチドの特性に応じて決まることは理解されるはずである。たとえば、ＨＡに連結することにした選択された本発明のポリペプチドに応じて、異なるリンカーを選択すればよい。本発明では、使用するＨＡの保存断片がアミノ酸残基９１〜１０８からの断片であることが好ましい。
【００５１】
免疫原としての本発明のポリペプチドと選択したＨＡ断片を連結するリンカーは、化学合成技術など、従来の合成技術によって望ましく合成することができる。さらに、当分野の技術者には、自動ペプチド合成装置によるｔ−ＢＯＣ法など、標準の化学的方法に従ってペプチドを合成することもできる（たとえば、Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第７９巻：４４２７ページ、１９５７年を参照のこと）。しかし、ペプチドは、タンパク質を化学的に加水分解しても、他の知られている方法によっても産生できる。
【００５２】
あるいは、本発明のポリペプチドとＨＡのキメラタンパク質は、ＨＡ断片及び本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子の核酸配列で形質転換した宿主細胞によって産生させることができ、前記ＤＮＡ分子は組換えＤＮＡ技術など、従来の遺伝子工学的方法によって宿主微生物又は宿主細胞中でクローン化することによって得られる。形質転換した細胞での組換え技術によって生成させる場合、得られる組換えキメラタンパク質は、型通りの方法によって培地もしくは宿主細胞、又はその両方から精製及び回収できる。組換え法によって産生された前記キメラタンパク質は、組換えＤＮＡ技術による組換え産生の際、得られるペプチドを細胞体又は培地からほとんど分離できる程度に単離される。さらに、得られるペプチドのためのコード配列は、合成によって、あるいは知られている方法に従ってウイルスＲＮＡを使用し、又はそのｃＤＮＡを含む入手可能なプラスミドを使用することによって調製できる。
【００５３】
この方法における使用では、上述のキメラタンパク質は、その産生を増大させ、又はその精製を促進する目的で、一般に知られている作製物向けにも他の作製物向けにも設計できる。適切な系及びベクターは知られており、公的に入手でき、又は大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、哺乳動物、酵母、昆虫細胞、及び植物細胞など、様々な微生物及び細胞中のクローン化及び発現キメラペプチドが市販されている。
【００５４】
組換え又は合成によって産生されたキメラタンパク質は、型通りの精製方法によって精製できる。当分野の技術者には、問題の用途に合致するポリペプチドの所望の純度が容易に決定できる。
【００５５】
ワクチン組成物
別の態様では、本発明はさらに、少なくとも１種の本発明のポリペプチドもしくはその何らかの併用物と、任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントとを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物も提供する。
【００５６】
さらに別の態様では、本発明はさらに、本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルスの赤血球凝集素抗原由来保存断片を含有するキメラタンパク質と、任意選択の薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントとを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物も提供する。
【００５７】
本発明のさらに別の態様では、哺乳動物にワクチン接種を施してＥ型肝炎ウイルス感染を予防する、上記のワクチン組成物の使用も提供する。
【００５８】
本発明では、接種又は治療の対象となる哺乳動物には、それだけに限らないが、ヒト、及びヒヒ、類人猿、サルなど、他の霊長類、ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウスなど、実用動物、並びにネコ、イヌなど、ペット類が含まれる。前記ワクチン組成物は、治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含有し、前記の有効量は、ある期間投与した後、ＨＥＶに感染した対象を有効に治療し、又は対象のＨＥＶ感染を予防するのに十分な量である。
【００５９】
本発明のワクチン組成物は、単独で使用することも、医薬用又は予防法向け処方の成分として使用することもでき、任意選択で、放出制御剤を含む、薬剤として許容される賦形剤を含有する。前記賦形剤はさらに、ＨＥＶ感染を治療及び／又は予防するための投与に適する薬剤として許容される媒介物又は希釈剤を含んでもよい。薬剤として許容される適切な媒介物とは、生物学的に不活性かつ／又は非毒性のものを指す。所望の用途に従って、当技術分野で知られている様々な媒介物が選択できる。通常、前記媒介物は、それだけに限らないが、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、オルトリン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ミョウバン、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、及び水からなる群から選択できる。さらに、媒介物又は希釈剤は、単独又はパラフィンとの併用で、モノステアリン酸グリセリル／ジステアリン酸グリセリルなど、放出制御性物質をさらに含んでよい。さらに、可溶性ガラスを含む従来の徐放性重合体製剤も使用できる。
【００６０】
さらにまた、所望時には、少なくとも１種の本発明のポリペプチド又はその何らかの併用物を含む本発明のワクチン組成物は、他の治療／予防薬をさらに含んでもよい。たとえば、前記組成物は、ＨＥＶ感染の治療又は予防で有用な様々な薬品の「カクテル混合物」を含んでよい。このようなカクテル混合物は、インターフェロン、ヌクレオチド類似体、及び／又はＮ−アセチル−システインなど、他の薬品をさらに含んでよい。
【００６１】
少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、任意選択で、アジュバントやサイトカインなど、対象における抗体及びＴ細胞の応答をさらに誘導するのに有用な免疫系調節薬をさらに含んでもよい。前記調節薬には、従来のミョウバンを主体としたアジュバント、ムラミルジペプチド、保存剤、化学安定剤、又は他の抗原タンパク質が含まれる。一般に、安定剤、アジュバント、又は保存剤などは、所望の適用例での効果が最高の処方を最も効果的に決定する。適切な保存剤には、クロリルブチノール（ｃｈｌｏｒｙｌｂｕｔｙｎｏｌ）、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、グリセリン、及びフェノールが含まれる。
【００６２】
本発明のワクチン組成物を使用して哺乳動物のＨＥＶ感染を予防及び／又は治療する方法
別の態様では、本発明は、対象に予防及び／又は治療に有効な量の本発明のポリペプチド、又は少なくとも１種の本発明のポリペプチド及びインフルエンザウイルス赤血球凝集素の保存断片からなるキメラタンパク質を投与することを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療する方法を提供する。特に、前記方法は、対象に本発明のワクチン組成物を投与するステップを含む。本発明が選択する保存断片は、９１〜１０８個のアミノ酸残基からのアミノ酸断片であることが好ましい。
【００６３】
これらの組成物の適量は、所望の応答レベルに基づいて決定してよい。一般に、本発明のポリペプチドを含む組成物は、約５ｕｇと約２００ｕｇの間の粒子を含有してよい。このような組成物は、１回又は一続きの接種、たとえば、２〜６カ月間隔で３回の接種として投与してよい。また適切な投与量は、単剤治療として投与する場合、患者の健康状態、体重、又は年齢、並びに免疫原成分の従来の投与量などの要因を考慮に入れて、治療を行う医師の判断によって決定してよい。患者の状態が改善し、又は所定の病原体への暴露の増加が見込まれれば、本発明のポリペプチドを含む維持量の組成物を必要に応じて投与すればよい。その後、投与量、投与頻度、又はその両方を、所望の効果が保たれるレベルに減らせばよい。その時に、治療を止めるべきである。しかし、所定の好ましくない状態が再発すれば、各個体に長期間の断続的な治療が求められることもある。
【００６４】
本発明のポリペプチドを含む組成物は、たとえば非経口投与、特に筋肉内又は皮下、並びに経口投与など、何らかの適切な経路によって投与してよい。経肺、経鼻、点耳、経肛門、経皮、点眼、静脈内、動脈内、腹腔内、経粘膜、舌下、皮下、脳内など、他の経路を使用してもよい。
【００６５】
本発明のワクチン組成物の調製をして、液状の溶液又は懸濁液としての注射用組成物又はワクチンを製剤すればよい。注射の前に液体になる溶液又は懸濁液に適する固体剤形を調製してもよい。ある実施形態では、製剤が、放出を制御し、かつ／又は送達を長引かせるために、乳化されていても、リポソーム又は可溶性ガラスに封入されていてもよい。あるいは、製剤は、エアロゾル又はスプレーの形でもよい。製剤は、経皮パッチに含まれていてもよい。活性成分は、薬剤として許容され、活性成分と適合するいくらかの医薬添加物と混合してよい。医薬添加物には、たとえば、フロイント不完全アジュバント、細菌性のリポ多糖体、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、レシチン、緩衝物質、セルロースを素材とした物質、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００６６】
生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は全抗体を検出する診断キット及び方法
本発明のポリペプチドは、生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は全抗体の存在を検出するために使用でき、既存の検出キット又は検出法より感度及び特異性が高いことが特徴である。したがって、本発明は、抗体／抗原相互作用に適する条件下、検出すべき検体と検出に有効な量の本発明のポリペプチドを接触させるステップを含む、生物検体におけるＨＥＶ感染の存在を判定する方法を提供する。
【００６７】
本発明で検出対象となる生物検体を供与するものには、それだけに限らないが、ヒト、及びヒヒ、類人猿、サルなど、他の霊長類、ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウスなど、実用動物、並びにネコ、イヌなど、ペット類が含まれる。
【００６８】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを判定する診断キットであって、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含み、望むなら、前記ポリペプチドは、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出対象の生物検体のＩｇＧに指向性のある、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＧ、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＧ抗体用検出キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７０】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７１】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定する診断キットであって、検出対象の生物検体に由来するＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＭを含み、望むなら、前記捕捉抗体は、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の本発明のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＭ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＭ抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７３】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７４】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定する診断キットであって、検出対象の生物検体に由来するＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗体抗ＩｇＭを含み、望むなら、前記捕捉抗体は、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の本発明のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；望むなら、適切な緩衝系をさらに含むキットを提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態では、検出対象の前記生物検体はヒト由来であり、抗体は抗ヒトＩｇＭ抗体である。より具体的には、本発明のＩｇＭ抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７６】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００７７】
本発明のさらにまた別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を判定する診断キットであって、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含み、望むなら、前記ポリペプチドは、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；請求項１に記載のポリペプチドから選択された、支持体表面に予め塗布するための前記ポリペプチド、及び請求項１に記載のポリペプチドから選択された検出可能な標識ポリペプチドが同じポリペプチドでも異なるものでもよいキットを提供する。
【００７８】
より具体的には、本発明の全抗体用診断キットは、ＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープを有するポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片は、任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合している。
【００７９】
前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片が任意選択で本発明のポリペプチドに共有結合した状態にするには、遺伝子組換え法によってキメラポリペプチドを産生させることが好ましい。化学的方法を使用して、前述のポリペプチドに前記のＨＥＶ ＯＲＦ３内免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を共有結合させることもできる。
【００８０】
当技術分野では、前述の診断キットにおいて、様々な市販品を得ることも、様々な動物を利用する方法によって型通りに産生することもできる抗ヒトＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＭを使用することが知られている。あるいは、検出対象の生物検体を供与する特定の動物に対する抗ＩｇＧ又は抗ＩｇＭを使用するが、これは、関係のある動物を利用することによって生成できる。抗体を調製する目的では、選択される動物には、それだけに限らないが、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ブタなどが含まれる。標識化のための前記の検出可能な標識を単独又は他の組成物もしくは化合物との併用で使用すると、検出可能なシグナルが得られて、検体中の問題の物質の存在を視覚化できる。前記の検出可能な標識は、検出の技術分野で知られており、かつ容易に入手できる材料でよく、それには、これだけに限らないが、酵素マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカーなどが含まれる。したがって、本発明は、検出標識を特定の選択に限定するものではなく、当技術分野で知られている検出法がすべて含まれるものと考える。利便性を考えて、前記検出剤は、キットの形で提供できる。
【００８１】
前記キットは、任意選択で、本発明のポリペプチドを予め塗布したマイクロタイタープレート、適切に処方された様々な希釈剤及び／もしくは緩衝剤、標識物質、又は酵素基質、補因子、発色団など、特異的に結合した抗原／抗体複合体を検出するためのシグナルを発生する他の薬品をさらに含む。その中の他の構成要素は、当分野の技術者に容易に選択できる。
【００８２】
さらに、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の本発明のポリペプチドを固定化するステップ；次いで、適切な緩衝液で洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；次いで、市販又は型通りに生成された検出可能な標識抗ＩｇＧ抗体と共に、抗原／抗体が十分に相互作用する一定の時間インキュベートするステップであって、前記抗ＩｇＧが、検出対象の生物検体を供与した動物に対するものであるステップ；並びに、その後、前記検出標識に合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の抗体ＩｇＧの量を算出するステップを含む方法も提供する。
【００８３】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、使用する前記抗体は抗ヒトＩｇＧである。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、前もって決められた支持体の表面に抗原としてのポリペプチドＮＥ２Ｉを予め塗布する。本発明の別の実施形態では、特定の支持体表面を予め塗布する抗原として、ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープと結合したポリペプチド２４７を使用する。
【００８５】
本発明の別の態様では、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に、市販又は型通りに生成された抗体抗ＩｇＭを固定化するステップであって、前記抗ＩｇＭが、検出対象の生物検体を供与した動物に対するものであるステップ；適切に洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体、好ましくは血清を接触させるステップ；適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；次いで少なくとも１種の検出可能に標識された本発明のポリペプチドと共に、抗原と抗体が相互作用するのに十分な時間インキュベートするステップ；並びに、その後、前記の検出可能な標識に合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の抗体ＩｇＭの量を算出するステップを含む方法を提供する。
【００８６】
本発明の一実施形態では、検出対象となる前記生物検体はヒト由来であり、使用する前記抗体は抗ヒトＩｇＭである。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたポリペプチド２２５Ｎによって、検体中の前記ＩｇＭ抗体を検出する。本発明のさらにまた別の実施形態では、ＨＥＶ ＩＲＦ３のエピトープと結合させたポリペプチド２４７を、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させて、検体中に含まれるＩｇＭを検出する。
【００８８】
さらに、生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の本発明のポリペプチドを固定化するステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の生物検体を接触させるステップ；任意選択で、適切な緩衝液で再度洗浄するステップ；検出可能な標識された当該ポリペプチドの１つと共に、抗原と抗体が相互作用するのに十分な時間インキュベートするステップ；並びに、検出可能な標識を有するＥ型肝炎ウイルス抗原及び合致する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出し、検体中の全抗体の量を算出するステップを含む方法も提供する。
【００８９】
本発明の一実施形態では、支持体表面上にＮＥ２Ｉを予め塗布し、西洋ワサビペルオキシダーゼと予め結合させたポリペプチド２２５によって、検体中の全抗体を検出する。本発明の別の実施形態では、支持体表面上に、ＨＥＶ ＯＲＦ３からのエピトープと結合させたＮＥ２Ｉを予め塗布し、ＨＥＶ ＯＲＦ３からのエピトープと前もって結合させてある、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたポリペプチド２２５によって、検体中の全抗体を検出する。
【００９０】
以下の図面及び実施例の記載に関して、本発明の詳細をさらに説明するが、これは、いかようにも本発明の保護範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【００９１】
（実施例）
別段の指示がない限り、本発明の分子生物学の実験方法およびイムノアッセイはすべて、「分子クローニング：実験室必携（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、および「分子生物学におけるショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年の基本的な記載事項に従う。制限エンドヌクレアーゼの使用は、提供者が提示するプロトコルに従う。
【実施例１】
【００９２】
実施例１ 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の調製、およびそれを含む発現ベクターの作製
鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２画分の調製
問題の遺伝子を調製するにあたり、中国新疆省のＨＥＶ感染患者からクローン化した、鋳型としての全長ＨＥＶ遺伝子（Ａｙｅ，Ｔ．Ｔ．、Ｕｃｈｉｄａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻（１３）３５１２ページ（１９９２年）；遺伝子銀行受入れ番号Ｄ１１０９２）、ならびに上方のプライマーとしてのＯＲＦ２ ＦＰ：５’−ａｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃｃａ−３’および下方のプライマーとしてのＯＲＦ２ ＲＰ：５’−ａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’の２種のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲサーマルサイクラー（ＢＩＯＭＥＴＲＡｔ３）において、９４℃で５分間；次いで９４℃で５０秒間、５７℃で５０秒間、および７２℃で２．５分間を２５サイクル；最後に７２℃で１０分間という条件下で実施する。本発明のポリペプチドを調製する鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２からのＤＮＡ断片約２ｋｂが得られる。先述のＰＣＲ産物を市販のベクターｐＭＤ１８−Ｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）にさらに連結し、次いでＯＲＦ２遺伝子が挿入された陽性クローンが識別されるようにＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。Ｍ１３（＋）／（−）をプライマーとして使用して、得られたものの配列を決定し、それによって本発明のポリペプチドを調製する鋳型として使用する２本のＨＥＶ ＯＲＦ２ＤＮＡ断片、すなわち一方が保存配列（鋳型１、配列番号５）、他方が変異配列（鋳型２、配列番号６）を識別する。
【００９３】
配列を並べ合わせ、ＯＲＦを解析することによって、本発明のポリペプチドを調製する鋳型としてのＨＥＶ ＯＲＦ２の変異配列（配列番号６）は、保存配列（配列番号５）に対して塩基Ａが欠落しており、これがＯＲＦ２内のアミノ酸残基６０４〜６０５がＨｉｓ−Ｓｅｒ−ＶａｌからＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇに変異するシフト変異をもたらし、さらにこのために、この変異によって生成した終止コードタグによって前記ポリペプチドへの翻訳が停止することが判明している。
【００９４】
以下では本発明のポリペプチド２０１を使用する実施例によって、ポリペプチド２０１をコードする核酸およびそれを含む発現ベクターの調製を例示する。
【００９５】
本発明のポリペプチド２０１をコードするポリヌクレオチドおよびそれを含む発現ベクターの調製
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）において、上記で得た配列の配列番号５を鋳型として使用し、ならびにＢａｍＨＩ部位、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴ ＡＴＧ）、および大腸菌系の翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを導入した前方向プライマー２０１ＦＰ：５’−ｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｔｔｃａｇｇａｔｔａｔｇａｃ−３’（表１を参照のこと）と、終止コドンおよびＥｃｏＲＩ部位を導入した逆方向プライマーとしての２０１ＲＰ：５’−ｃｔｃｇａｇａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’（表１を参照のこと）とを使用するものを利用して遺伝子を合成する。ＰＣＲは、サーモサイクラーにおいて、９４℃で５分間熱変性させ、次いで９４℃で５０秒間、５７℃で４０秒間、および７２℃で４０秒間のサイクルを３０回、さらに最後に７２℃で１０分間増幅させて実施する。得られた〜６００ｂｐのＰＣＲ産物が本発明のポリペプチド２０１をコードするヌクレオチド配列であることを確認する。
【００９６】
本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７の作製は、参照文献のＬＵＯ Ｗｅｎ−Ｘｉｎ等、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００年、第１６巻：５３〜５７ページにある方法に従うものである。前記方法は、前述のＰＣＲ産物を市販のｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローン化するステップ；ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ヌクレオチドによってコードされたポリペプチド２０１が挿入された陽性サブクローンを識別し、これを得るステップ；前記陽性サブクローンをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲｌでさらに消化して、ポリペプチド２０１の遺伝子を含むヌクレオチド配列を得るステップ；次いでＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＴＯ−Ｔ７にクローン化するステップを含む。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化することによって、ポリペプチド２０１のコード化配列が組み入れられている陽性クローンｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１を識別する。図１に、ＯＲＦ２０１ポリペプチドの発現ベクターを作製するための方策を例示する。
【００９７】
同様に、カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇでない他方の本発明のポリペプチドも、配列番号６の配列を鋳型として使用し、個々の問題のポリペプチド向けに特別に設計された表中の各プライマーを使用することによって、上記の方法に従って得ることができる。
【００９８】
カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド、およびそれを含む発現ベクター
カルボキシル末端がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである本発明のポリペプチドは、上述のＯＲＦ２−２０１の発現ベクターでの方法に従って得た発現ベクターで大腸菌ＥＲＲ２５６６を形質転換することによって発現される。具体的には、上述のＨＥＶ ＯＲＦ２変異配列の配列番号６を鋳型とし、本発明の個々のポリペプチド向けに特別に設計された個々の前方向／逆方向プライマー（表１を参照のこと）を使用して、ポリペプチド２０１の発現ベクターを作製するのと同様の条件下でのＰＣＲによって対応する発現ベクターを得る。この方法では、免疫原性および免疫反応性の良好な一連の本発明のポリペプチドが得られ、得られるポリペプチドは、そのＮ末端にＭｅｔが付加され、カルボキシル末端のアミノ酸６０３のＰｒｏである３’末端において、５’から３’の方向にアミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが付加されている。
【００９９】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【実施例２】
【０１００】
実施例２ ポリペプチド２０１の発現
形質転換用の（塩化カルシウム法で発生させた）大腸菌ＥＲＲ２５６６コンピテント細胞４０ｕＬにプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２０１（０．１５ｍｇ／ｍＬ）１ｕＬを加えた。次いで、混合物をカナマイシンＬＢプレートにスクロールし、個々のクローンが得られるまでプレートを３７℃で１０〜１２時間インキュベートした。個々のクローンを選び取り、さらに管中ＬＢ培地４ｍＬに接種し、培養物のＯＤ550nm値が約１．５になるまで、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振とうした。次いで、１ｍＬの培地を後の使用に備えて４℃で保管し、残りの３ｍｌの培地（最終濃度は０．３ｍＭ）に０．５ＭのＩＰＴＧ２ｕＬを加えた。ＩＰＴＧ含有培地を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で４時間インキュベートを続けて、問題のポリペプチドの発現を誘導した。誘導を行った培地１．５ｍＬを３０秒間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。沈殿した細胞を１００ｕＬのタンパク質添加液（５０ｍＭのトリスＣｌｐＨ６．８、１００ｍＭのＤＴＴ、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセロール）に再懸濁させ、さらに１０分間煮沸し、次いで１０分間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。１０ｕｌの上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ポリペプチド２０１の発現を解析した。高い収率で発現したクローンをさらなる発酵に使用した。
【０１０１】
ＬＢ培地５００ｍＬを含む１Ｌ容エルレンマイヤーフラスコにシーク培地２００ｕＬを加えた。培養物のＯＤ550nm値が２．０に達するまで、１９０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で約１１時間インキュベートした後、０．５ＭのＩＰＴＧ３００ｕＬを加えて、最終含有量を０．３ｍＭとした。前述の条件下、この混合物をさらに４時間インキュベートした。誘導を行った１．５ｍＬの培養物を３０秒間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。細胞を１００ｕＬのタンパク質添加液に再懸濁させ、１０分間煮沸し、次いで１０分間１２０００ｇでの遠心分離にかけた。１０ｕｌの上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ポリペプチド２０１の発現を解析した。ＵＶＩゲル画像処理器（Ｕ−ＶＩｔｅｃｈ、ＤＢＴ−０８モデル）によって示された（クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色を行う）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの解析結果は、ポリペプチド２０１の発現が、発現した総細胞タンパク質の約３５％であることを示した。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３ 大腸菌中に発現させたポリペプチド２０１封入体の精製
実施例２で得た組換えポリペプチド２０１を含有する大腸菌の培地を１５分間４０００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、培養物の沈殿各５００ｍＬを１５ｍＬの溶解緩衝液（ｄＨ2Ｏ中５０ｍＭのトリスＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。超音波処理器において細胞を超音波処理した（Ｕｉｌｂｒａ−ＣｅｌｌＶＣＸ５００、ＳＯＮＩＣＳ ＆ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ｃｏｍｐａｎｙ、パワー７０％、４０秒間オン、６０秒間オフ、合計２０分間の超音波処理）。超音波処理した混合物を４℃で１０分間１２０００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、ペレットを２％のトリトンＸ１００を含む緩衝液Ｉ溶液（２００ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．５；５ｍＭのＥＤＴＡ；１００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁させ、最終体積は、元の溶解液と同じである。混合物を３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とうし、次いで４℃で１０分間１００００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。ペレットを等しい体積の緩衝液Ｉに再懸濁させ、混合物を超音波処理した（４０秒間オン、６０秒間オフ、パワー７０％、合計で３分間の超音波処理）。その後、混合物を４℃で１０分間遠心分離した（１００００ｒｐｍ）。ペレットを２％のトリトンＸ１００を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を前と同じにした。混合物を３７℃で３０分間振とう（２００ｒｐｍ）した後、４℃で１０分間遠心分離した（１００００ｒｐｍ）。ペレットを３７℃で３０分間振とう（２００ｒｐｍ）して、等しい体積の緩衝液Ｉに再懸濁させた。次いで、混合物を４℃で１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを２Ｍの尿素を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を元の混合物と同じにした。３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とうした後、混合物を４℃で１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。この上清に２０１−２Ｍと印をつけた。ペレットは、４Ｍの尿素を含む緩衝液Ｉに再懸濁させて、最終体積を前と同じにした。３７℃で１時間振とう（２００ｒｐｍ）した後、混合物を一晩４℃で保管し、次いでこれを４℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。この上清に２０１−４Ｍと印をつけた。上記の試料の純度はすべて、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。図３に結果を示す。
【実施例４】
【０１０３】
実施例４ 組換えポリペプチド２０１の再生
実施例３に従って調製した試料２０１−４Ｍ１００ｍｌを２袋の透析バッグ（３６ＤＭ、保持ＭＷ：８０００〜１００００、米国Ｕｎｉｔｅｄ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に装入し、１×ＰＢＳ（Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ ７３．３４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、ＮａＣｌ １６３、６３２ｇ、ＫＣｌ ４．０２４ｇを含有する２０×ＰＢＳ（１Ｌ）、ｐＨ７．４５）９００ｍｌを含む１Ｌ容ビーカー中で攪拌しながら、２５℃で終夜（１０時間）透析を行うと、透析バッグ中に白色の沈殿が認められた。透析液を補給し、透析を続け、次いで透析液を３時間毎に４回補給した。原則として、透析が済んだときの試料中の尿素含有量は、４×１０−６Ｍである。透析した試料を２５℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を０．２２μｍの濾過膜で濾過してさらに精製し；４Ｍの尿素／緩衝液Ｉに懸濁させたペレットを新しい透析で使用して、その間に沈殿を出現させることもできるが、得られるタンパク質試料の濃度が最初に得たものより低くなる。
【実施例５】
【０１０４】
実施例５ ゲル濾過ＨＰＬＣによる組換えポリペプチド２０１の精製
実施例４の方法に従って調製した再生２０１の試料を以下のようなＨＰＬＣ、すなわち、
機器：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕ １２５ＮＭＰ／１６６ＮＭＰ ＨＰＬＣ、
カラム：ＴＳＫ ＧＥＬ ＳＷ３０００ ２１．５ｍｍ×６０ｃｍ、
溶離：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４５、
流速：４ｍｌ／分、
検出：２８０ｎｍのＵＶ、
試料：４ＭのＮＥ２（８ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、
収集：ウィンドウ式自動頂角収集（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｐｅｘ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｎｄｏｗ ｍｏｄｅ）、
収集時間：１チューブ／２０秒、
収集遅延：６秒によって精製した。
【０１０５】
クロマトグラムの結果は、分子の濾過が非常に有効であることを示したが、頂角の成分は、単量体および二量体、ならびにこれらの間に均等に分布するタンパク質を含んでいる。試料タンパク質を沸騰湯中で１０分間処理した後、最高で９５％を越える目的のタンパク質ピークの単量体純度について１２％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。それによって、ＯＲＦ２−２０１単量体が、自己凝集に加えて他の小さいタンパク質とも凝集し、クロマトグラムの際に一緒に溶離した多量体の間で相互作用が生じることも示されている。
【実施例６】
【０１０６】
実施例６ 本発明の組換えポリペプチド産物の特徴づけ
実施例１〜５の方法に従って、本発明の組換えポリペプチドを作製し、発現させた。さらに、各々の組換えペプチドを洗浄し、実施例３〜４の方法に従って透析にかけた。表２に、各組換えペプチドのＥ型肝炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配置、発現された組換え産物の再生特性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの単量体および二量体の比率、ならびに多量体の生成を示す。
【０１０７】
【表２−１】
【表２−２】
【０１０８】
表２で示したとおり、ＨＥＶ ＯＲＦ２の配列番号１のアミノ酸配列に含まれる本発明のポリペプチドは、そのカルボキシル末端が配列番号１のａａ６０１（Ｌｅｕ）とａａ６６０の間に位置する場合、よく再生する能力を有し、これによって自然のＨＥＶタンパク質に近い次元構造を示すようになる。具体的には、ペプチド２４７、２３２、２２２、２０１、２３５Ｎ、２２５Ｎ、２０９Ｎ、ＮＥ２Ｉ、２１７Ｄ、２０５、１８９、１８８、ＮＥ２（配列番号２）、および１９３Ｃ（配列番号３）は、単量体分子量および２倍の単量体分子量に相当する位置に発現バンドを有するが、二量体の量が明らかに単量体を上回っていることが判明した。ＮＥ２および１９３Ｃが、より大きい分子量の位置にはっきりとしたバンドを有することが判明し、前記ペプチドが自発的に多量体化することを示唆した。
【０１０９】
表２の再生可能な組換えペプチド１９３Ｃ、２０１、２０８Ｎ、２０９Ｎ、ＮＥ２、２２２、２２５Ｎ、２３２、および２４７をゲル濾過ＨＰＬＣによってさらに精製し、それぞれを１０分間２００００ｇで遠心分離し、０．１μｍのＡｌ2Ｏ3濾過膜で濾過した後、動的光散乱計（ＤＹＮＡＰＲ０９９−Ｄ−５０動的光散乱計、ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ製）によってこれらのペプチドの動的半径を測定し、表３ではその構築状態を推測してある。得られた各々の組換えペプチドの分子半径は、その単量体の予想半径よりも明らかに大きい。推定上の分子量に従うと、このようなペプチドの形状が、溶液中に少なくとも二量体を形成し、その大部分が高次の多量体を形成すると結論付けることができるが、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの挙動と同調している。実際、上記の方法で調製した本発明のポリペプチドは、最高で１８０個以上の単量体の多量体を形成し得る。さらに、発明のポリペプチドが予想外の特性、すなわち大腸菌系によって発現された上記の前記組換えペプチドが、変性剤を含まないＰＢＳ溶液中で自発的に多量体化するので、そのワクチンとしての免疫原性を増強するのに有利であることも実証された。
【０１１０】
【表３】
【実施例７】
【０１１１】
実施例７ ポリペプチドの物理化学的特性
封入体からの再生
実施例１〜３で記載したとおりに調製した組換えポリペプチドの封入体を４Ｍの尿素で変性させ、次いで実施例４で記載したとおりに、１００を超える量のＰＢＳでの透析にかけた。透析したものを１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は、若干またはすべての組換えポリペプチドを含んでおり、それによって前記組換えポリペプチドに再生能力があることを実証する。
【０１１２】
組換えペプチドの重合
従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用する上清の解析において、それぞれ単量体、二量体、および多量体に対応するバンドを識別した。従来のウェスタンブロット法によって前記バンドの特異性をさらに確かめ、それによって組換えポリペプチド２０１が再生後に重合体を形成することを実証した（図４を参照のこと）。
【０１１３】
光走査法によるポリペプチド２０１の分子サイズの決定
実施例６に従って、ポリペプチド２０１をＨＰＬＣによって精製した後、１０分間２０，０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで０．１ｕｍのアルミナ製ミリポア膜で濾過した。濾液を動的光走査計（ＤＹＮＡ−ＰＯＲ９９−Ｄ−５０、米国ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ Ｃｏｍ．Ｌｔｄ．）による８２４．０ｎｍでの測定にかけた。算出には制御アルゴリズムを使用し、数多くの標準試料によってその実用性を確かめた。分子の半径は、％ピーク強度に対応する動的半径から算出した。溶媒は、試料緩衝液ＰＢＳとした。図５に示す測定結果は、変性剤を含まない溶液中のポリペプチド２０１の平均半径が３．０８ｎｍであったことを示唆し、（三量体に相当する）ＭＷ６２．７ＫＤが算出された。本発明の技術者には、前記の本発明のポリペプチドが実際に１８０個以上の単量体の重合体を形成したことが知られている。
【実施例８】
【０１１４】
実施例８ マウス抗ＮＥ２単クローン抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系の確立
第一次の免疫化では、各々のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウス（生後６〜８週間）に５ｕｇの組換え抗原ＮＥ２で乳化したフロイント不完全アジュバント（総体積５０ｕＬ）で免疫化を施した。１５日後、マウスにフロイント不完全アジュバント中に乳化された同じ量のＮＥ２を筋肉内投与して２回目の免疫化を施した。３０日後、アジュバントなしの抗原５ｕｇを（尾の静脈を通して）静脈内投与してマウスに追加免疫を施した。追加免疫の後７２〜９６時間でマウスを屠殺した。次いで血液を採取し、脾臓を切除して、（ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させて）脾細胞懸濁液を調製した。脾細胞を細胞計数器でカウントした。次いで、６：１の比で脾細胞をＳＰ２／０マウス黒色腫細胞と混合し、遠心分離した。細胞をＰＥＧ（ＰＥＧ１５００）で融合し、次いで等しい量の支持細胞と混合し、９６穴プレート（２００ｕＬ／ウェル）に移した。５％のＣＯ2雰囲気において、９６穴プレートを恒温器（ＥＳＰＥＣ ＢＮＡ−３１）において３７℃でインキュベートした。３日後、培地の半分を新鮮なＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｔ．）を加えて１００ｍＬとし、約４５〜５０℃で溶解させ、濾過して滅菌した１．３６１ｍｇのヒポキサンチンおよび０．３８８ｍｇのチミジン）に入れ替えた。７日後、９６穴プレートにＮＥ２を塗布し、以下に述べるようにハイブリドーマ細胞培養物についてのＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であった細胞を限界希釈法によってクローン化した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例５で述べたＨＰＬＣによって１００ｕＬのＮＥ２を３７℃で精製し、次いで０．０５モル／ＬのＣＢ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした２０．０２ｇのＮａ2ＣＯ3および２．５２ｇのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）に溶解させて、最終濃度を０．３ｕｇ／ｍＬとした。９６穴ポリビニルマイクロタイタープレートを、３７℃で２時間、次いで４℃で一晩かけて、得られた溶液で処理した。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇのＮａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で洗浄して、吸収されていない抗原を除去した。次いで、ウェル毎に２００ｕＬのブロッキング用緩衝液（１×ＰＢＳ中２％のグルチン、０．２％のカゼイン、および２％のスクロース）を加え、２時間インキュベートした。次いで溶液を流し、ウェルを乾燥させ、真空中に４℃で保管した。
【０１１６】
アッセイのために、１００ｕＬの細胞培養物を各ウェルに加え、各プレートに１陽性対照（１：１００に希釈した多クローン性抗ＮＥ２血清１００ｕＬを加えたもの）および１陰性対照（ＨＴ培地１００ｕＬを加えたもの）を設けた。３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで乾燥させた。ＨＲＰ−ＧＡＭ Ｉｇ（ＤＡＫＯ社）を加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。プレートを再度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、乾燥させた。プレートに５０ｕＬの基質溶液Ａ（ｄｄＨ2Ｏを加えて７００ｍＬとした１３．４２ｇのＮａ2ＨＰＯ4 １２Ｈ2Ｏ、４．２ｇのクエン酸Ｈ2Ｏ、および０．３ｇのＨ2Ｏ2）および５０ｕＬの基質溶液Ｂ（ｄｄＨ2Ｏを加えて７００ｍＬとした０．２ｇのＴＭＤおよび２０ｍＬのジメチルホルムアミド）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５０ｕＬの停止溶液を使用して、反応を停止した。各ウェルのＯＤ450値をＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。一般に、ＯＤ450値が陰性対象より少なくとも２０倍高いと、陽性であるとみなすことができる。
【０１１７】
腹水の調製および単クローン抗体の精製
生後１０週間のＢａｌｂ／Ｃマウス各々に０．５ｍＬのフロイント不完全アジュバントを腹腔内接種した。２〜７日後、ハイブリドーマ細胞を収集し、遠心分離した。次いで上清を捨て、細胞群に血清を含まない培地を加えて、最終濃度を２×１０5〜２×１０6細胞／ｍＬとした。得られた細胞懸濁液０．５ｍＬを使用して、各マウスに接種した。マウスの腹部が膨張してから７〜１０日目に腹水を採取し、次いで１５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した。管中間部の透明の液体をピペットで取り出し、０．４５ｕｍのミリポア膜で濾過して滅菌した。濾液を−２０℃で保管した。
【０１１８】
処理した腹水を等しい体積のＰＢＳ（通常の食塩水を加えて１００ｍＬとした０．２モル／ＬのＮａ2ＨＰＯ4８１ｍＬおよび０．２モル／ＬのＮａＨ2ＰＯ4１９ｍＬ）で希釈した。次いで５０％飽和になるまで、穏やかに攪拌しながら（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。ペレットを（２の量の腹水を使用した）ＰＢＳに溶解させた。３３％飽和になるまで、得られた溶液に攪拌しながら再度（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。ペレットを（２の量の腹水を使用した）ＰＢＳに溶解させた。５０％飽和になるまで、穏やかに攪拌しながら（ＮＨ4）2ＳＯ4を滴下し、終夜４℃に保った。溶液を４℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。次いでペレットを透析バッグ中の適量のＰＢＳに溶解させ、５０〜１００の量の、１２０ミリモル／ＬのトリスＨＣｌ緩衝液（２０ミリモル／ＬのＮａＣｌ含有、ｐＨ７．８）において４℃で約１２時間攪拌しながら透析した。緩衝液は３回より頻繁に入れ替えた。透析したものを−２０℃で保管した。
【０１１９】
上記で述べた方法に従い、本発明のポリペプチドＮＥ２でＢａｌｂ／Ｃマウスに免疫化を施すことによって単クローン抗体を調製し、８種の抗ＮＥ２単クローン抗体（１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５、８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８、１５Ｂ２、および１６Ｄ７）が識別された。前記８種の抗体をエッペンドルフ管にそれぞれ塗布し、捕捉ＲＴ−ＰＣＲ（実施例９を参照のこと）によって、前記抗体が自然のＨＥＶを結合する能力を試験した。その結果、８Ｃ１１、８Ｈ３、および１３Ｄ８が、顕著なＨＥＶ結合活性を示し、その認識部位がウイルス外皮表面上の自然のエピトープであることを示唆した。前記の３種の抗体を実施例１０で使用した。
【実施例９】
【０１２０】
実施例９ 抗体捕捉ＲＴ−ＰＣＲによるｍＡｂのＨＥＶ結合能試験
１．５ｍＬ容エッペンドルフ管に３０分間紫外線を照射し、次いでＣＢ（ｄｄＨ2Ｏを加えて１Ｌとした２０．０２ｇのＮａ2ＣＯ3および２．５２ｇのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）中に１：１０００で希釈したｍＡｂ５００ｕＬを加えた。３７℃で終夜インキュベートした後、緩衝液を流し、１．５ｍＬのブロッキング用緩衝液（２％アルブミン添加１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を加えて、３７℃で２時間ブロッキングした。次いでブロッキング用緩衝液を流し、滅菌した通常食塩水中１０％のＨＥＶ陽性排泄物５００ｕＬを加えた。３７℃で２時間反応させた後、エッペンドルフ管をＰＥＳＴで６回洗浄し、次いで各エッペンドルフ管に２５０ｕＬのｄｄＨ2Ｏを加えた。次いで実施例１４に従ってＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。その結果、８Ｃ１１、８Ｈ３、および１３Ｄ８の単クローン抗体はＨＥＶを結合できたが、１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５、１５Ｂ２、および１６Ｄ７はＨＥＶを結合できなかった。
【実施例１０】
【０１２１】
実施例１０ 本発明のポリペプチドと、陽性アカゲザル由来血清、ヒト由来血清、およびマウス由来単クローン抗体とのＥＬＩＳＡ、ならびに本発明のポリペプチドとマウス由来単クローン抗体のドットブロット
組換えポリペプチドと、陽性アカゲザル由来血清、ヒト由来血清、およびマウス由来単クローン抗体とのＥＬＩＳＡ
実施例１〜６で述べた方法に従って、表２で示した本発明のポリペプチドを作製し、精製した。得られた濃度１ｍｇ／ｍｌの精製組換えタンパク質の試料をＰＢＳ緩衝液（２０Ｍｍ、ｐＨ７．４）で１：５００に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルを塗布し、次の条件下、すなわち３７℃で２時間インキュベートし、次いで４℃で終夜約１２時間インキュベートする条件下に置いた。自動洗浄器（ＴＥＣＡＮ、Ｍ１２／４Ｒ Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｐｌｕｓ）においてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液（非イオン性Ｈ2Ｏを加えて最終濃度１Ｌとしてある８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、乾燥させた後、ブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ中２％のグルチン、０．２％のカゼイン、および２％のスクロース）を２００μｌ／ウェル加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで適宜希釈した抗血清または単クローン抗体を３７℃で３０分間かけて加えた。自動洗浄器において２０秒間隔で５回、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液で洗浄し、乾燥させた後、適宜希釈したＨＲＰ標識二次抗体（ヤギ抗ヒト、マウスＩｇＧ抗体）を３７℃で３０分間かけて加えた。自動洗浄器において２０秒間隔で５回、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄溶液で洗浄し、乾燥させた後、色素産生性薬品ＡおよびＢ（Ａ：非イオン水で体積を７００ｍｌに調整してある１３．４２ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、４．２ｇのクエン酸・Ｈ2Ｏ、および０．３ｇのＨ2Ｏ2；Ｂ：非イオン水で体積を７００ｍｌに調整してある０．２ｇのＴＭＢ、２０ｍｌのジメチルホルムアミド）をそれぞれ１滴加えて、３７℃で１０分間かけて発色させた。停止溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）を１滴加えた。マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｒｅｍｏｔｅ／Ｔｏｕｃｈ Ｓｃｒｅｅｎ）で（６２０ｎｍの波長を基準として）ＯＤ450nmを測定した。陰性対象の３回の平均値を陽性閾値と定めてあり、結果のＯＤ値が閾値より高い場合が陽性である。
【０１２２】
本発明のポリペプチドと様々なマウス由来単クローン抗体のドットブロット
実施例１〜５の方法に従って得、ＨＰＬＣゲル濾過によって精製した、表２に載せたポリペプチド各１０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜にそれぞれをゆっくりとスポットし、風乾した。５％の脱脂乳によって室温で１．５時間ブロッキングした後、実施例８で述べたように得た様々なマウス由来単クローン抗体（５％の脱脂乳で１：１００に希釈した、単クローン性Ｂリンパ球によって分泌された細胞上清）を加えて、室温で１時間反応させた。次いで、ＴＮＴ（１０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ＭｍのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を使用して膜を５分間隔で３回洗浄した。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＪＩＮＧＭＥＩ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、５％の脱脂乳で１：１０００に希釈したもの）を加え、室温で１時間反応させた。５分間隔で３回、ＴＮＴで洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｃ40Ｈ30Ｎ10Ｏ6Ｃｌ2／Ｃ8Ｈ6ＢｒＣｌＮＯ4Ｐ．Ｃ7Ｈ9Ｎ）を加えて発色させた。ドットをゲル画像処理システムでスキャンし、黒色度の値に転用し、＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、＋−の５陽性段階および−の陰性段階に分類した。古典的なウェスタンブロットに比べ、この方法は、ＳＤＳでの変性にかけないために変性剤の存在なしで、免疫反応性をより如実に反映できる。
【０１２３】
【表４−１】
【表４−２】
【０１２４】
結果
表４に載せた精製組換えポリペプチドをそれぞれ、マイクロタイタープレートに塗布し、実施例８で述べた３種のマウス由来単クローン抗体８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８、回復相のＨＥＶ患者の血清、および急性相のＨＥＶ感染アカゲザル由来血清に対するその反応性をＥＬＩＳＡによって調べ、使用した３種の単クローン抗体に対するその反応性をドットブロットアッセイによって調べた。その結果は、ポリペプチドＮＥ２、１９３Ｃ、１７８Ｃ、ＮＥ２Ｉ、２３５Ｎ、２２５Ｎ、２０９Ｎ、２４７、２３２、２２２、および２０１が各々の血清／単クローン抗体に対してより反応性であることを示した。これは、これらのポリペプチドが自然のＨＥＶエピトープをより多く有しており、ＨＥＶの診断キットおよび／またはワクチンに使用できることを示唆している。
【０１２５】
ポリペプチド１３８Ｃ、Ｃ１６０、１５０、１４２、および１３４は、様々な抗体に対する反応性が弱かった。これによって、主要な自然のエピトープＯＲＦ２の形成には、少なくともａａ４６９〜ａａ６００の断片が関与することが示された。
【０１２６】
ポリペプチド１７０、Ｃ１６０、Ｎ１６０、１５０、１４４、１４２、および１３４の配列は、ＯＲＦ２のａａ４５９〜ａａ６２８、ａａ４６９〜ａａ６２８、ａａ４５９〜ａａ６１８、ａａ４６９〜ａａ６ｌ８、ａａ４５９〜ａａ６０２、ａａ４５９〜ａａ６００の配列がそれぞれ開始アミノ酸（Ｍｅｔ）に結合したものである。
【実施例１１】
【０１２７】
実施例１１ 本発明のポリペプチドとマウス由来単クローン抗体のウェスタンブロット
実施例１〜５で述べたようにして得た本発明のポリペプチド２０８Ｎ、２０９Ｎ、および２２５Ｎと、実施例８で得たマウス由来単クローン抗体１Ｆ６、２Ｃ９、３Ｆ５のウェスタンブロットを実施した。前記ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで従来の方法に従ってニトロセルロース膜に移し、５％の脱脂乳を加えて１．５時間ブロッキングし、様々なマウス由来単クローン抗体（５％の脱脂乳で１：１００に希釈した、単クローン性Ｂリンパ球によって分泌された細胞上清）を加えて、室温で１時間反応させ、５分間隔で３回洗浄した後、（５％の脱脂乳で１：１０００に希釈した）ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを室温で１時間かけて加え、５分間隔で３回、ＴＮＴで洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて発色させた。図６にウェスタンブロットの結果を示す。その結果は、特にレーン８の、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０での染色では観察できない重合体バンドが、ウェスタンブロットアッセイの酵素に関連した増幅効果によって観察できることを示している。さらに、本発明の組換えポリペプチド２０８Ｎが１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中には重合体にならないこと、ならびに２０９Ｎおよび２２５Ｎに対する単クローン抗体１Ｆ６の活性が、単クローン抗体２Ｃ９および３Ｆ５より強いことも確かである。
【実施例１２】
【０１２８】
実施例１２ ポリペプチド２０１を含むワクチンの調製およびそれによるマウスの免疫化アッセイ
フロイントアジュバントと併せたポリペプチド２０１含有ワクチンの調製
上述のようにして得、ＨＰＬＣによって精製した本発明のポリペプチド２０１（純度＞９５％およびタンパク質濃度１．０２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈し、等価な体積の（ＢＣＧを含有する）フロイント完全アジュバントを加えて、ポリペプチド２０１が所望の最終濃度に達するようにした（たとえば、各マウスを１００μｌ、５μｇで免疫化することが望まれれば、ポリペプチド２０１の濃度を０．０５ｍｇ／ｍｌに調製することになる）。この溶液を混合し、３０分間動かさずにした後分離する液体相が現われなくなるまで３０分間かけて乳化した。
【０１２９】
フロイントアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、４グループの各々のマウス（各群に３匹のＫｕｎｍｉｎｇ白色マウス）に１００μｌ中０．５、１、２、５μｇ／マウスを筋肉内注射した。図７に結果を示す。その結果は、２μｇを超える用量のフロイントアジュバントを加えて調製したＯＲＦ２−２０１ワクチンが非常に強い免疫原性を有しており、免疫化後２週間目に抗原が産生され始め、４週間目には力価が最高に達したことを示唆した。免疫学についての一般の書籍および文献によると、３０〜７０μｇ／マウスの用量のタンパク質抗原で免疫化したマウスにおいてのみ力価のより高い抗体が産生できると考えられている。したがって、この結果は、このワクチン、すなわちフロイントアジュバントと併せた本発明のポリペプチド２０１が、入手可能なワクチンに比べて著しく高い免疫原性効果を有することを示している。
【０１３０】
アルミニウムアジュバントと併せたポリペプチド２０１含有ワクチンの調製
Ｌａｎｚｈｏｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａからの所望の量の原物アルミニウムアジュバント（Ａｌ３＋１３．６８％、Ｎａ＋３．３６％、ｐＨ５．５５）を沈殿が生じるまで１ＮのＮａＯＨで調整した。完全に混合した後、１×ＰＢＳを加えて体積を２倍にした。次いで、１分間１０，０００で遠心分離し、上清を捨てた。沈殿を１×ＰＢＳで再懸濁させて、再度体積を２倍にし、１分間１０，０００で遠心分離し、上清を捨てた。ｐＨが７〜７．４に達するまで、このプロセスを数回繰り返した。最後に、沈殿を等しい体積の１×ＰＢＳで再懸濁させ、溶液を滅菌し、４℃で保管し、９倍の保存溶液として使用した。
【０１３１】
同様に、上述のようにして得、ＨＰＬＣによって精製したポリペプチド２０１（純度＞９５％およびタンパク質濃度１．０２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈し、１／９の量のアルミニウムアジュバントを加えて、ポリペプチド２０１が所望の最終濃度に到達するようにし、４℃で終夜混合した。免疫化用量は、１００μｌ／マウスである。アルミニウムアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、各群の３匹のＢａｌ ｂ／ｃマウス各々に２、５、１０μｇ／マウスを筋肉内注射した。図９に結果を示す。その結果は、５、１０μｇ／マウスの用量の免疫原生効果がより高いことを示唆したが、これは、粒子抗原であり、単量体抗原より免疫原性が高いと考えられている最近の入手可能なＨＢＶ表面抗原ワクチンに匹敵する。したがって、この結果は、本発明の重合体がワクチンに有用であることを示している。
【０１３２】
アジュバントなしのポリペプチド２０１の免疫アッセイ
上述のようにして得たポリペプチド２０１を４Ｍの尿素に溶かし、上清をＰＢＳ（ｐＨ７．４５）での透析にかけて再生させ、純度を約９５％とした。フロイントアジュバントをワクチンアジュバントとして使用して、０、７、２８日の免疫化スケジュールに従い、各群の３匹のＫｕｎｍｉｎｇ白色マウス各々に５、２５、５０μｇ／マウス（対照群には５μｇ／マウス）を筋肉内注射した。図８に結果を示す。その結果は、アジュバントなしのＯＲＦ２−２０１ワクチンで免疫化したマウスにおいて抗体が顕著に産生されたことを示し、その使用した投与量は、フロイントアジュバントを加えてある従来の抗原の投与量と同等であった。本発明の重合体ポリペプチドの免疫原性が従来の抗原よりも高いことをさらに示している。
【０１３３】
上記の結果から、フロイントアジュバントまたはアルミニウムアジュバントの配合にかかわらず、組換えポリペプチド２０１とＮＥ２（５μｇ／マウス）の両方で免疫化した場合も、Ｂａｌｂ／ｃマウスによる特定の抗体の産生が誘発できると結論付けられる。フロイントアジュバントを配合した他の再生可能なポリペプチドも、マウスによる特定の抗体の産生を誘発し得る。したがって、本発明のポリペプチドは、ワクチンとしての使用に好適な特性を有する。
【実施例１３】
【０１３４】
実施例１３ 本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンによるアカゲザルの免疫化
ＡＬＴが正常であり、ＨＥＶ陰性のアカゲザル６匹を選択し、２つの群に分け、一方の群をＨＦ１、ＨＦ２、およびＨＦ３と称し、他方の群をＨＦ４、ＨＦ５、およびＨＦ６と称した。実施例１〜５および１２で記載したとおりに調製した、投与量２０μｇのアルミニウムアジュバント含有ポリペプチドＮＥ２Ｉワクチンおよびポリペプチド２０１ワクチンを三角筋内注射することによって、対象アカゲザルの２つの群にそれぞれワクチン接種を施した。このワクチン接種をそれぞれ０、１０、および３０日目に行った。最後のワクチン接種から３週間目に、この動物からの抗ＮＥ２ＩＩｇＧ抗体の力価を間接ＥＬＩＳＡによって試験すると、結果は次のとおり、すなわちＨＦ１（１：１６０００）、ＨＦ２（１：４０００）、ＨＦ３（１：８０００）、ＨＦ４（１：２０００）、ＨＦ５（１：３０００）、およびＨＦ６（１：５０００）であった。
【０１３５】
ポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２０１によって例示された上記の結果は、本発明の組換えポリペプチドが、米国特許第５８８５７６８号で免疫原として使用されたＨＥＶ ＯＲＦ２ポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２（配列番号１のアミノ酸２２５〜６６０）よりも高い免疫原性を有することを示唆している。Ｒｅｙｅｓ等の米国特許第５８８５７６８号では、大腸菌から発現させたＨＥＶ ＯＲＦ２ポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２と改良アルミニウムアジュバントの併用物５０ｕｇをそれぞれ０および３０日目に静脈内注射することによって、４匹のカニクイザルにワクチン接種を施している。アジュバントのみを注射した２匹のカニクイザルが対照として使用されている。２回目のワクチン接種後４週間目には、ワクチン接種したサルの群においてＨＥＶに対する抗体が検出されなかった。ワクチン接種したサルの２匹を選択して、５８日目に不溶性のアジュバントを含まないｔｒｐＥ−Ｃ２ポリペプチド８０ｕｇによる３回目のワクチン接種を施したが、抗ＨＥＶ抗体が検出されたのは４週間後までだけであった。
【実施例１４】
【０１３６】
実施例１４ 本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンで免疫化したアカゲザルへのＨＥＶ接種
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の調製および定量化
中国新疆省出身のＨＥＶ患者からの糞便を無菌生理食塩水中１０％懸濁液に調製した。この懸濁液を４℃で２０分間、１２０００ｇで遠心分離し、上清を０．２μｍの無菌フィルター（ＮＡＬＧＥＮＥ（登録商標）カタログ番号１９０−２５２０）での濾過によって滅菌した。ＰＣＲでの検出が可能な量のＨＥＶを感染投与量として使用した。
【０１３７】
糞便由来ＨＥＶ ＲＮＡの抽出、逆転写、およびＰＣＲ：その操作指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＬ）を使用し、１０％の糞便懸濁液からＨＥＶ ＲＮＡを抽出し、さらにＡＭＶ逆転写酵素を使用して、２０μｌの反応体積で、４２℃で４０分間、特定のプライマーＡ３（４５６６〜４５８６、５’−ｇｇｃｔｃａｃｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ−３’）をＲＴプライマーとして用いる、それの逆転写を行った。次いで、２ｕｌのＲＴ産物を鋳型として使用し、Ａ３プライマーおよびＡ５プライマー（４３４１〜４３６２、５’−ｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間の予備変性；９４℃で４０秒間の変性および６８℃で４０秒間の伸長を３５サイクル；７５℃で５分間の伸長によって、１回目のＲＴ−ＰＣＲを実施して、最終体積を２０ｕｌにした。１回目の反応産物２ｕｌを鋳型として使用し、プライマーＢ５（４３７２〜７３９２、５’−ｇｃｃｇｃａｇｃａａａｇｇｃａｔｃｃａｔｇ−３’）およびＢ３（４５５４〜４５７５、５’−ｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃｃａａａａｃｃｃｔｃｇｃ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間の予備変性；９４℃で４０秒間の変性、５６℃で４０秒間のアニーリング、および７２℃で１分２０秒間の伸長を３５サイクル；７５℃で５分間の伸長によって、２回目のＰＣＲを実施して、最終体積を２０ｕｌとした。
【０１３８】
この実験で扱うアカゲザルのグループ分け：免疫化群１は、それぞれ実施例２のＨＦ１、ＨＦ２、およびＨＦ３の動物に対応するアカゲザルＶ１０、Ｖ１１、およびＶ１２を含み；免疫化群２は、それぞれ実施例２のＨＦ４、ＨＦ５、およびＨＦ６に対応するアカゲザルＶ１３、Ｖ１４、およびＶ１５を含み；対照群は、Ｖ１６、Ｖ１７、およびＶ１８と称した３匹の非免疫化アカゲザルを含む。
【０１３９】
ＨＥＶ接種
ＰＣＲで検出できる量のＨＥＶを１感染投与量として用いた。実施例１３で記載した、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンをアカゲザルＨＦ１〜６に最後に接種してから３週間目に、１，０００感染投与量のＨＥＶを上記のサルに接種した。ＨＥＶ接種後、どのサルのＡＬＴも上昇しなかった。４週間目にＶ１６およびＶ１７の動物で抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧが検出され、５週間目にＶ１８の動物で抗ＮＥ２−ＩｇＧが検出された。Ｖ１０〜１５の動物では１〜３７日目までＨＥＶ排泄物が検出されず；Ｖ１６の動物では５日目にＨＥＶの排泄が始まり３０日目に終わり；Ｖ１７およびＶ１８の動物ではこれも５日目にＨＥＶの排泄が始まったが、３７日目になっても止まらなかった。これらの結果は、ワクチンとしての本発明のポリペプチドが米国特許第５８８５７６８号のＨＥＶ ＯＲＦ２のポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２よりも高い免疫原性を有し、強い防御をもたらすことを示唆している。
【０１４０】
これらの結果から、少ない投与量の本発明のワクチンを使用してサルにワクチン接種を施した場合、ワクチン接種を受けたサルは、ＨＥＶに応答して優れた抗体を産生できるので、ＨＥＶを接種後、異常なＡＬＴおよび糞便中のウイルス排泄が認められなかったことがわかる。したがって、ＨＥＶ ＯＲＦ２からのポリペプチドｔｒｐＥ−Ｃ２を使用して調製したワクチン（米国特許第５８８５７６８号）およびＴｓａｒｅｖ等が調製したポリペプチドを含むワクチンについての報告されているワクチン接種結果に比べて、より優れた免疫防御がもたらされた。さらに、Ｔｓａｒｅｖ ａｎｄ Ｇｅｎｅｌａｂｓ ｃｏ．が利用したバキュロウイルス発現系は、人体に有害である可能性があるので、この系によって発現された組換えタンパク質が、ヒトに使用する市販薬または市販ワクチンとして認可されたことはこれまで報告されていない。対照的に、本発明による大腸菌発現系によって発現されたいくつかの組換えタンパク質は、ヒトに使用するｉｎ ｖｉｖｏ市販薬として認可されており、安全性がより確かである。
【実施例１５】
【０１４１】
実施例１５ ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープに結合させた本発明のポリペプチド２４７を含むキメラポリペプチドの調製
その５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを導入する前方向プライマーの３７２ＦＰ（５’−ｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇａａｔａａｃａｔｇｔｃｔｔｔｔｇｃｔ−３’）と、その５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩを導入する逆方向プライマーの３７２ＢＲＰ（５’−ｇｇａｔｃｃｔｃｇｇｃｇｃｇｇｃｃ−３’）を使用して、次の反応条件下、すなわち９４℃で５分間；９４℃で５０秒間、５６℃で５０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル；および７０℃で１０分間の反応条件下において、中国新疆省のＨＥＶ患者から単離したＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の全長ゲノム（Ａｙｅ，Ｔ．Ｔ．、Ｕｃｈｉｄａ等のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻（１３）３５１２ページ（１９９２年）；遺伝子銀行受入れ番号ＧＩ２２１７０１）を鋳型とするＰＣＲ反応を行った。ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープをコードする、大きさ約３７０ｂｐの特定のＤＮＡ断片を得た。上記の得られたＰＣＲ産物を市販のｐＭＤ１８−Ｔプラスミド（ＴＡＫＡＲＡ社）に連結した。ＢａｍＨＩでの消化によって、ＨＥＶ ＯＲＦ３内のエピトープ遺伝子が挿入された陽性サブクローンを識別した。ＤＮＡの配列決定によって、クローン中に変異がないことが示され、それによって配列番号１１で示す、ＨＥＶ ＯＲＦ３内エピトープ遺伝子のアミノ酸配列が得られた。
【０１４２】
ＢａｍＨＩでの消化によってＨＥＶ−ＯＲＦ３の遺伝子断片を得、ＢａｍＨＩで消化した（実施例１に記載の方法に従って調製した）ｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ２−２４７発現プラスミドベクターに連結した。ＢａｍＨＩで消化して、ＨＥＶ ＯＲＦ３の遺伝子断片が挿入された陽性発現クローンｐＴＯ−Ｔ７−ＯＲＦ３−２４７を識別した。このクローンを大腸菌ＥＲＲ２５６６株に形質転換し、これをＯＲＦ３−２４７キメラポリペプチドの発現に使用した。
【実施例１６】
【０１４３】
実施例１６ ＮＥ２Ｄをインフルエンザ由来赤血球凝集素抗原に結合させたキメラポリペプチドの調製
対のプライマーＨＡＦＰ／Ｅ２ＲＤを使用する、実施例１で調製したＨＥＶ−ＯＲＦ２変異配列（配列番号６）を鋳型とするＰＣＲで増幅することによって、キメラペプチドのヌクレオチド配列を得た。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の予備加熱；９４℃で５０秒間の変性、５６℃で５０秒間のアニーリング、７２℃で７０秒間の伸長を３０サイクル；および最後に７２℃で１０分間の伸長という条件下で実施する。得られたＰＣＲ産物は、インフルエンザウイルス由来ＨＡおよび本発明のポリペプチドＮＥ２Ｄを含むキメラポリペプチドをコードする、約８００ｂｐのＤＮＡ断片である。前方向プライマーＨＡＦＰは、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限部位を含む。逆方向プライマーＥ２ＲＤは、ＥｃｏＲＩ制限部位および翻訳終止コドンＴＡＡを含む。ＮｄｅＩに対する配列はＣＡＴ ＡＴＧであり、ＡＴＧは翻訳開始コドンである。さらに、２種のペプチドＨＡおよびＮＥ２Ｄの立体配座を厳密に維持するために、ＨＡペプチドとＮＥ２Ｄペプチドの間にそれぞれ、ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣによってコードされる柔軟なリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−を導入した。したがって、キメラポリペプチドＨＡ−ＮＥ２Ｄは、ＨＥＶワクチンに適切に使用できる。一対のプライマーの配列は、以下のとおりである。
ＨＡＦＰ：５’−ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＡＡ
ＢｇｌＩＩ ＮｄｅＩ ９１ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＣＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＴＣＴ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ
ＴＴＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ
Ｌｅｕ１０８ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＧＴ ＣＣ−３’
Ｅ２ＲＤ：５’−ｇａａｔｔｃｔｔａｇｇｇｇｇｃｔａａａａｃａｇｃ−３’
【０１４４】
得られたキメラポリペプチドをコードする核酸構築物を含む発現ベクターの調製
前述のＰＣＲ産物を市販のプラスミドｐＭＤ１８−Ｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）中にクローン化した。次いで、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＭＤ１８−Ｔ−ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄプラスミドから問題の配列を得、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでの消化および連結によって発現ベクターに組み込んだ。ｐＴＯ−Ｔ７−ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄ発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＥＲＲ２５６６宿主細胞から、ＨＡ−ＯＲＦ２−ＮＥ２Ｄキメラペプチドを単離した。このアミノ酸配列を配列番号１２と称した。
【実施例１７】
【０１４５】
実施例１７ 本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉを主体とした間接Ｅｌｉｓａキットよる生物検体中の対ＨＥＶＩｇＧの検出
ＨＥＶに対するＩｇＧを本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉで検出するキットは、組換えポリペプチドＮＥ２Ｉを塗布し、ブロッキング用緩衝液（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、２％のゼラチン）でブロッキングしたマイクロタイタープレート；検体希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、１％のカゼイン）；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で希釈したＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ））；２０×ＰＢＳＴ、色素原Ａ、色素原Ｂ、および停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ ｗａｎｔａｉ）など、生物活性のない材料を含む。
【０１４６】
ＮＥ２Ｉに基く抗ＨＥＶ ＩｇＧキットで一連のサル血清を検出し、Ｂｅｉｊｉｎｇ ｗａｎｔａｉおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｌａｂｓから得た２種の市販抗ＨＥＶ ＩｇＧキットと比較した。これらのサル血清は、静脈内接種後０〜１８週（ｗ）までに得た、ＨＥＶに自然感染したサルを模倣したサルＮｏ１、Ｎｏ２、Ｎｏ３、およびＮｏ１３の血清であった。
【０１４７】
操作手順は以下のとおり、すなわち、各マイクロタイターに検体溶媒１００ｕｌを加え；マイクロタイターに検体１０ｕｌを加え；マイクロプレートのすべての側面を穏やかに叩くことによって十分に混合し；３７℃で３０分間インキュベートし；マイクロプレートを１回、ＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレートを逆さにし、吸収性の紙にしっかりと軽く叩くことによってブロットドライし；すべてのウェルに作用コンジュゲート１００ｕｌを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし；マイクロプレートを再度５回洗浄してブロットドライし；色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加えて、穏やかに叩いて十分に混合し；暗所においてそのマイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートし；各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを軽く叩くことによって穏やかに混合し；各ウェルの４５０ｎｍ／６２０ｎｍの吸光度を測定するものである。２種の市販の抗ＨＥＶ ＩｇＧキットでも、各々のアッセイ手順に従って厳密なアッセイを行った。
【０１４８】
結果は以下のとおり、すなわち、ＮＥ２Ｉを主体としたキットは、７〜１４日目までにＷａｎｔａｉおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｌａｂｓからの２種の市販のキットよりも早く抗体陽転を検出し；抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧの持続時間は、Ｇｅｎｅｌａｂｓの抗ＨＥＶ−ＩｇＧおよびＷａｎｔａｉの抗ＨＥＶ−ＩｇＧより長く；抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧの検出率は、２種の市販の抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットより高かった（図１０を参照のこと。表５に未処理データを示す）。無作為の３４件の健常者血清を検出した場合、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＧｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ３５％および１１％であり、後者は、完全に前者に含まれていた。肝炎患者の２６３件の臨床血清では、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＷａｎｔａｉ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ２７．２％および１０．６％であった。非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清では、抗ＮＥ２Ｉ−ＩｇＧおよびＧｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧの陽性率は、それぞれ６９．２％および２４．２％であった。一言で言えば、本発明のＮＥ２Ｉを素材とした抗ＨＥＶ−ＩｇＧは、市販の抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットよりも感度がよい。
【０１４９】
【表５】
【実施例１８】
【０１５０】
実施例１８ 本発明の組換えタンパク質をＨＲＰで標識する方法
超純粋（ＵＰＷ）にそれぞれ１ｍｇのＨＲＰ（ＢｉｏｚｙｍｅＲ／Ｚ＞３）およびＮａＩＯ４を溶解させ；攪拌しながらＮａＩＯ４溶液を滴下し；この混合溶液を室温で３０分間暗所に静置し；混合しながら１％のエチレングリコール溶液１００ｕｌを段階的に加え；それを４℃で３０分間暗所に静置する。組換えタンパク質を３時間炭酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．６）での透析にかけ；適度に透析した組換えタンパク質を酸素添加したＨＲＰに加え、炭酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．５）中、穏やかに攪拌しながら室温（または４℃）で６時間透析し；上述の混合物に新しく調製した０．１ＭのＮａＢＨ４溶液２０ｕｌを加え；暗所に４℃で２時間静置し、３０分間ずつ１回穏やかにボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し；これをＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、４℃で終夜透析にかける。
【実施例１９】
【０１５１】
実施例１９ 生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する診断キット、および生物検体においてＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する捕捉アッセイ
実施例１８で記載した方法に従って、ポリペプチド２２５ＮをＨＲＰで標識した。
【０１５２】
ＨＲＰで標識した本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉを含有する、ＨＥＶに対する抗体ＩｇＭを検出する診断キットは、マウス抗ヒトＩｇＭμ鎖多クローン抗体（デンマークＤａｋｏ社）を予め塗布し、ブロッキング用緩衝液でブロッキングしたマイクロタイターストリップ；検体希釈剤（２０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢ、１％のカゼイン）；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で適切に希釈したＨＲＰ標識ポリペプチド２２５Ｎ）；２０×ＰＢＳＴ、色素原薬品Ａ、色素原薬品Ｂ、および停止溶液（ＷＡＮＴＡＩ社、Ｂｅｉｊｉｎｇ）など、生物活性のない材料を含む。
【０１５３】
この診断キットを使用する捕捉アッセイを以下のようにして、すなわち、マウス抗ヒトＩｇＭμ鎖多クローン抗体を予め塗布した各ウェルに希釈緩衝液１００ｕｌを加え；希釈緩衝液に検出対象の検体１ｕｌを加え；穏やかに叩くことによって十分に混合し；３７℃で３０分間インキュベートし；ＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレートを逆さにし、ティッシュペーパー上にしっかりと軽く叩くことによってブロットドライし；各ウェルに作用コンジュゲート（適切に希釈したＨＲＰ標識ポリペプチド２２５Ｎ）１００ｕｌを加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし；再度５回洗浄し、ブロットドライし；次いで色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加え、穏やかに叩くことによって十分に混合し；暗所において３７℃で１０分間インキュベートし；各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを穏やかに叩くことによって混合し；各ウェルの吸光度をＯＤ450nm/620nmで測定することによって実施する。
【０１５４】
本発明に従って調製した抗ＨＥＶ−ＩｇＭ診断キットを使用して、前述の捕捉アッセイによって、肝炎患者の２６３件の臨床血清を検出にかけると、陽性率は１１％であり；また前記捕捉アッセイによって非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清を検出にかけると、陽性率は４８．４％であった。一方、Ｇｅｎｅｌａｂｓの抗ＨＥＶ−ＩｇＧ診断キットによって検出したこの９１件の血清検体の陽性率は、２４．２％に過ぎなかった。上記の結果が示すように、捕捉アッセイを利用して本発明の抗ＨＥＶ−ＩｇＭ診断キットによって検出された陽性検体は、臨床的な診断とよく一致している。さらに、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットによって検出された陽性検体の大部分も、この捕捉アッセイにおいて陽性である。すなわち、本発明の抗ＨＥＶ−ＩｇＭキット、ならびに前記捕捉アッセイは、臨床上のＨＥＶ診断において現存する市販のキットよりも感度および特異性が高い。
【実施例２０】
【０１５５】
実施例２０ 生物検定においてＨＥＶに対する全抗体を検出する診断キット、および生物検体においてＨＥＶに対する全抗体を検出する方法
実施例１８で記載した方法に従って、ポリペプチド２２５Ｎを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。
【０１５６】
本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２２５Ｎを含有する、ＨＥＶに対する全抗体を検出するキットは、組換えポリペプチドＮＥ２Ｉを予め塗布し、ブロッキング用緩衝液（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、２％のゼラチン）でブロッキングしたマイクロタイターストリップ；作用コンジュゲート（酵素希釈剤（２０ｍＭかつｐＨ７．２のＰＢ、０．５％のカゼイン、１０％のＮＢＳ）で希釈したＨＲＰで標識したポリペプチド２２５Ｎ）；２０×ＰＢＳＴ、色素原薬品Ａ、色素原薬品Ｂ、および停止溶液（北京ＷＡＮＴＡＩ社）など、生物活性のない材料を含む。
【０１５７】
当該キットの検出プロトコルは、以下のとおり、すなわち、予めポリペプチドＮＥ２Ｉを塗布した前記ストリップのマイクロタイターに血清５０ｕｌおよび適切に希釈した組換えポリペプチド２２５ＮをＨＲＰで標識したもの５０ｕｌを加え；マイクロプレートのすべての側面を穏やかに叩いて混合し；３７℃で６０分間インキュベートし；マイクロプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し；マイクロプレート逆さにすることによってブロットドライし；色素原Ａ５０ｕｌおよび色素原Ｂ５０ｕｌを加え；次いでマイクロプレートを３７℃で１５分間インキュベートし；最後に各ウェルに停止溶液５０ｕｌを加え、プレートを穏やかに叩いて混合し；各ウェルのＯＤ450nm/620nmの吸光度を測定するものである。
【０１５８】
得られた検出結果は、次のとおり、すなわち、本発明のポリペプチドＮＥ２Ｉおよび２２５Ｎを主体とするサンドウィッチ式全抗ＨＥＶ抗体キットでの検出では、肝炎患者からの２６３件の臨床血清が陽性率５２％で検出されたが、ＷＡＮＴＡＩ抗ＨＥＶ−ＩｇＧキットでの検出では、１０．６％しか判定されなかった。さらに、同じサンドウィッチ式キットを使用して、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎患者の９１件の血清を検出すると、陽性率は５４．９％であった。しかし、この９１件の血清において、Ｇｅｎｅｌａｂｓ抗ＨＥＶ−ＩｇＧによって検出された陽性率は、２４．２％に過ぎなかった。上記のデータが示すように、臨床的な診断において、当該診断キットでの検出は、現存する市販のキットに優っている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の配列番号１に記載されたアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、該断片は：
１）配列番号１におけるアミノ末端がアミノ酸残基４１４と４５９の間から出発して、カルボキシル末端がアミノ酸残基６６０で終結するポリペプチド；
２）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２４７；
３）配列番号１のアミノ酸残基４２９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３２；
４）配列番号１のアミノ酸残基４３９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２２；
５）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０１；
６）上の１）から５）の前述のポリペプチドのいずれか１つとの相同性が少なくとも８０％であり、抗原性又は免疫原性が実質的に同一であるポリペプチド；
からなる群から選ばれるものである、上記ポリペプチド。
【請求項２】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項１に記載のポリペプチドである、上記多量体。
【請求項３】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチドもしくは請求項２に記載の多量体もしくはその任意の組合せもしくは少なくとも１種の請求項２に記載の多量体もしくはその任意の組み合わせ、及び場合により薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチド及びインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素抗原の保存断片を含むキメラタンパク質。
【請求項５】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項４に記載のキメラタンパク質である、上記多量体。
【請求項６】
請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項５に記載の多量体、及び任意選択で薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチド及びＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を含む、キメラタンパク質。
【請求項８】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項１に記載のポリペプチド及びＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を含むキメラタンパク質である、上記多量体。
【請求項９】
請求項７に記載のキメラタンパク質又は請求項８に記載の多量体、及び場合によって、薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項７に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
それぞれ請求項１に記載のポリペプチド、請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項７に記載のキメラタンパク質を発現することができる、請求項１０に記載の組み換え発現ベクターで形質転換した、宿主細胞。
【請求項１２】
診断に有効な量の少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド若しくはその任意の組合せ、又は少なくとも１種の請求項２に記載の多量体若しくはその任意の組み合わせを含む、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断する診断キット。
【請求項１３】
Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープを含むポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来の免疫原性エピトープを含む該ポリペプチド又はその免疫原性断片が、場合により請求項１に記載の選択されたポリペプチドに共有結合している、請求項１２に記載の診断キット。
【請求項１４】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を含み、所望であれば、前記ポリペプチドが適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出対象の生物検体のＩｇＧに指向性のある検出可能に標識された抗体抗ＩｇＧ、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；所望であれば、適切な緩衝系をさらに含む、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを判定するための、請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
検出対象の生物検体のＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、検出可能に標識した抗体抗ＩｇＭを含み、所望であれば、前記捕捉抗体が、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１又は請求項２に記載の多量体に記載のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；所望であれば、適切な緩衝系をさらに含む、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定するための請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１６】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を含み、望むなら、前記ポリペプチドが、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；支持体表面に予め塗布するための前記ポリペプチド又は多量体、及び検出可能な標識ポリペプチド又は多量体が同じでも異なるものでもよい、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を判定するための請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１７】
生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び検出可能な標識を有するＥ型肝炎ウイルス抗原及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項１８】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及びＥ型肝炎ウイルスに対する検出可能に標識した抗体抗ＩｇＧ及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項１９】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に抗体抗ＩｇＭを固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び検出可能に標識した少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗ＩｇＭ／ＩｇＭ複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項２０】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に抗体抗ＩｇＭを固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；次いで抗原と抗体の相互作用に適する条件下、少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び、次いで検出可能に標識した抗ＨＥＶ多クローンもしくは単クローン抗体及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項２１】
請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項５に記載の多量体を含む、生物検体におけるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のため、又は生物検体におけるＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧ、抗体ＩｇＭ、全抗体の判定のための診断キット。
【請求項２２】
請求項７に記載のキメラタンパク質又は請求項８に記載の多量体を含む、生物検体におけるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のため、又は生物検体におけるＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧ、抗体ＩｇＭ、全抗体の判定のための診断キット。
【請求項１】
Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の配列番号１に記載されたアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、該断片は：
１）配列番号１におけるアミノ末端がアミノ酸残基４１４と４５９の間から出発して、カルボキシル末端がアミノ酸残基６６０で終結するポリペプチド；
２）配列番号１のアミノ酸残基４１４〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２４７；
３）配列番号１のアミノ酸残基４２９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２３２；
４）配列番号１のアミノ酸残基４３９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２２２；
５）配列番号１のアミノ酸残基４５９〜６６０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわちポリペプチド２０１；
６）上の１）から５）の前述のポリペプチドのいずれか１つとの相同性が少なくとも８０％であり、抗原性又は免疫原性が実質的に同一であるポリペプチド；
からなる群から選ばれるものである、上記ポリペプチド。
【請求項２】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項１に記載のポリペプチドである、上記多量体。
【請求項３】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチドもしくは請求項２に記載の多量体もしくはその任意の組合せもしくは少なくとも１種の請求項２に記載の多量体もしくはその任意の組み合わせ、及び場合により薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチド及びインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素抗原の保存断片を含むキメラタンパク質。
【請求項５】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項４に記載のキメラタンパク質である、上記多量体。
【請求項６】
請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項５に記載の多量体、及び任意選択で薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチド及びＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を含む、キメラタンパク質。
【請求項８】
精製した単量体ポリペプチドの多量体であって、該多量体は２〜１８０の精製した単量体ポリペプチドが自己凝集によって形成し、各々の該精製した単量体ポリペプチドは請求項１に記載のポリペプチド及びＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープ又はその免疫原性断片を含むキメラタンパク質である、上記多量体。
【請求項９】
請求項７に記載のキメラタンパク質又は請求項８に記載の多量体、及び場合によって、薬剤として許容される賦形剤及び／もしくはアジュバントを含む、哺乳動物のＥ型肝炎ウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項７に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
それぞれ請求項１に記載のポリペプチド、請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項７に記載のキメラタンパク質を発現することができる、請求項１０に記載の組み換え発現ベクターで形質転換した、宿主細胞。
【請求項１２】
診断に有効な量の少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド若しくはその任意の組合せ、又は少なくとも１種の請求項２に記載の多量体若しくはその任意の組み合わせを含む、生物検体のＥ型肝炎ウイルス感染を診断する診断キット。
【請求項１３】
Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３からの免疫原性エピトープを含むポリペプチド又はその免疫原性断片をさらに含み、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ３由来の免疫原性エピトープを含む該ポリペプチド又はその免疫原性断片が、場合により請求項１に記載の選択されたポリペプチドに共有結合している、請求項１２に記載の診断キット。
【請求項１４】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を含み、所望であれば、前記ポリペプチドが適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出対象の生物検体のＩｇＧに指向性のある検出可能に標識された抗体抗ＩｇＧ、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；所望であれば、適切な緩衝系をさらに含む、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを判定するための、請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
検出対象の生物検体のＩｇＭに指向性のある捕捉抗体としての、検出可能に標識した抗体抗ＩｇＭを含み、所望であれば、前記捕捉抗体が、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１又は請求項２に記載の多量体に記載のポリペプチド、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；所望であれば、適切な緩衝系をさらに含む、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを判定するための請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１６】
少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を含み、望むなら、前記ポリペプチドが、適切な支持体の表面に予め塗布されており；さらに、検出可能に標識された少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体、及び前記の検出可能な標識に合致する検出剤を含み；支持体表面に予め塗布するための前記ポリペプチド又は多量体、及び検出可能な標識ポリペプチド又は多量体が同じでも異なるものでもよい、生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を判定するための請求項１２又は請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１７】
生物検体中のＥ型肝炎ウイルスに対する全抗体を検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び検出可能な標識を有するＥ型肝炎ウイルス抗原及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項１８】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧを検出する方法であって、支持体表面上に少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及びＥ型肝炎ウイルスに対する検出可能に標識した抗体抗ＩｇＧ及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項１９】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に抗体抗ＩｇＭを固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び検出可能に標識した少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗ＩｇＭ／ＩｇＭ複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項２０】
生物検体においてＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＭを検出する方法であって、支持体表面上に抗体抗ＩｇＭを固定化するステップ；抗原と抗体の相互作用に適する条件下、これに検出対象の検体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；次いで抗原と抗体の相互作用に適する条件下、少なくとも１種の請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載の多量体を接触させるステップ；適切な緩衝液で洗浄するステップ；及び、次いで検出可能に標識した抗ＨＥＶ多クローンもしくは単クローン抗体及び対応する検出剤を使用して、支持体表面上の抗原／抗体複合体を検出するステップを含む方法。
【請求項２１】
請求項４に記載のキメラタンパク質又は請求項５に記載の多量体を含む、生物検体におけるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のため、又は生物検体におけるＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧ、抗体ＩｇＭ、全抗体の判定のための診断キット。
【請求項２２】
請求項７に記載のキメラタンパク質又は請求項８に記載の多量体を含む、生物検体におけるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のため、又は生物検体におけるＥ型肝炎ウイルスに対する抗体ＩｇＧ、抗体ＩｇＭ、全抗体の判定のための診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【公開番号】特開２０１１−２０１８８１（Ｐ２０１１−２０１８８１Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８８８１０（Ｐ２０１１−８８８１０）
【出願日】平成２３年４月１３日（２０１１．４．１３）
【分割の表示】特願２００２−５４２９９４（Ｐ２００２−５４２９９４）の分割
【原出願日】平成１３年９月３０日（２００１．９．３０）
【出願人】（５０８１９８２５８）ベイジン ワンタイ バイオロジカル ファーマシー エンタープライズ カンパニー， リミテッド (3)
【出願人】（５１０１８３２８０）シャアメン ユニバーシティ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１３日（２０１１．４．１３）
【分割の表示】特願２００２−５４２９９４（Ｐ２００２−５４２９９４）の分割
【原出願日】平成１３年９月３０日（２００１．９．３０）
【出願人】（５０８１９８２５８）ベイジン ワンタイ バイオロジカル ファーマシー エンタープライズ カンパニー， リミテッド (3)
【出願人】（５１０１８３２８０）シャアメン ユニバーシティ (2)
【Ｆターム（参考）】
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