Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子解析による血栓性疾患関連の遺伝子変異検出方法
【課題】血栓性疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供すること。
【解決手段】Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異の検出を手段とする、血栓性疾患（末梢動脈疾患、冠動脈疾患や脳卒中等）を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、該検出方法を利用した血栓性疾患罹患危険率検査方法、該１塩基変異を有する遺伝子、前記方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キット。
【解決手段】Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異の検出を手段とする、血栓性疾患（末梢動脈疾患、冠動脈疾患や脳卒中等）を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、該検出方法を利用した血栓性疾患罹患危険率検査方法、該１塩基変異を有する遺伝子、前記方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の解析による、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に関する。また前記検出方法を利用する血栓性疾患罹患危険率の検査方法に関する。さらに、前記１塩基変異を有する遺伝子、並びに前記検出方法および前記検査方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ２Ｙ１２受容体は、アデノシン ５´ジホスフェート（以下、ＡＤＰと略称する）と結合することにより、血小板を活性化させる受容体である（非特許文献１および非特許文献２）。血小板活性化は止血に関わる重要な生理現象である一方、血栓形成にも関わり血管閉塞や虚血性ダメージを引き起こす。
【０００３】
ＡＤＰは血小板中の濃染顆粒に含まれており、血小板活性化に伴い細胞外に放出される。放出されたＡＤＰは周辺の血小板表面に存在する２種類のＡＤＰ受容体（Ｐ２Ｙ１受容体およびＰ２Ｙ１２受容体）に結合することにより血小板凝集を促進する。Ｐ２Ｙ１受容体は三量体Ｇ蛋白質であるＧｑと共役しており、細胞内カルシウム濃度の上昇を介して形態変化等の血小板凝集の初期反応に関与している。Ｐ２Ｙ１２受容体はＧ蛋白質であるＧｉと共役しており、低分子量Ｇ蛋白質のＲａｐ１ｂやセリンスレオニンキナーゼのＡｋｔの活性化を介して血小板凝集塊の成長や安定化に関与している。
【０００４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子は、第３染色体ｑ２４−ｑ２５遺伝子座に存在する遺伝子である。該遺伝子は２つのエキソンを含み、その全長は約３．１ｋｂであり、３４２アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。
【０００５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子にはＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている（特許文献１、非特許文献３および非特許文献４）。Ｈ１ハプロタイプは、アリル頻度が高く、正常遺伝子型であると考えられる。一方、Ｈ２ハプロタイプを有する個体ではＡＤＰ誘起血小板凝集能が亢進していること、およびＨ２ハプロタイプが末梢動脈障害発症の危険因子となることが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体で血小板凝集能が亢進するメカニズムについては明らかになっていない。恐らく、細胞表面のＰ２Ｙ１２受容体数が増加しているのではないかと推測されている。
【０００６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプには、４種類の１塩基変異が存在する（表１）。以下、これら１塩基変異を既知１塩基変異と称する。これら既知１塩基変異を同定することにより、Ｈ２ハプロタイプを特定できることが開示されている（特許文献１）。また、Ｈ２ハプロタイプと末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＰＡＤと略称することがある）との間に高い相関性が存在することが開示されている（特許文献１）。さらに、Ｈ２ハプロタイプの特定により、アテローム性血栓症の罹患危険率およびチエノピリジン抗血栓薬（例えばＰ２Ｙ１２受容体をターゲットとするクロピドグレルやチクロピジン等）に対する低感受性の検出を実施できると考えられることが開示されている（特許文献１）。
【０００７】
【表１】
【０００８】
表１において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体のゲノム塩基配列における位置として表した。
【０００９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースに開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００１０】
したがって、表１において、１塩基変異が存在する位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置として表した。
【００１１】
止血機構は、生体内で血管が損傷した場合、血管の機能、血小板機能、凝固・線溶系等の密接な相互作用のもとに働く生理的機構である。止血機構の異常は各種の出血性疾患や血栓性疾患等の原因になる。病的生理条件では、例えばアテローム斑の破裂により病的な血小板活性化が惹起され、その結果、動脈血栓が形成され、ひいては心筋梗塞、虚血性脳卒中、および末梢動脈疾患が引き起こされる可能性がある。
【００１２】
血栓性疾患は、血栓による血管の狭窄あるいは閉塞に起因する疾患であり、血栓症と塞栓症とに分類できる。血栓症は、血栓がその形成箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状であり、塞栓症は血栓がその形成箇所から剥がれて血流により移動し、他の箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状をいう。向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患として冠動脈疾患、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳梗塞、および深部静脈血栓症を例示できる。
【００１３】
冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＡＤと略称することがある）は、冠状動脈の閉塞による疾患として知られている。ＣＡＤは虚血性心疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、心筋への血液供給が著しく減少するため、心筋梗塞、狭心症あるいは不整脈等の症状が引き起こされる。
【００１４】
虚血性脳卒中は虚血性脳血管障害であり、脳梗塞や一過性脳虚血発作等が含まれる。脳梗塞は、脳卒中のなかに占める割合が高い。脳梗塞はその原因により２つ、すなわち脳血栓によるものと脳塞栓によるものとに大別される。脳血栓は脳の血管が動脈硬化等の変化により狭窄し、血流が悪くなって血栓を形成することに起因する。脳塞栓は心臓内や頚動脈において形成された血栓が血流により脳血管に運ばれた結果、脳血管の閉塞を起こすことに起因する。脳梗塞は心原性と非心原性に分類される。心原性脳梗塞では抗凝固薬、非心原性脳梗塞では抗血小板薬が特に有効であることが示されている。
【００１５】
末梢動脈の閉塞による疾患として末梢動脈疾患（ＰＡＤ）が知られている。ＰＡＤは、ほとんどの患者ではアテローム性動脈硬化が基礎にあり、ＣＡＤおよび心原性を除く脳梗塞と病態生理学的には極めて近いと考えられている。急性の虚血は近位の動脈硬化性プラークの破裂、先在するアテローム性動脈硬化による急性血栓症、心臓、大動脈または他の大型の脈管から飛来した塞栓、動脈瘤解離が原因である。慢性の虚血はアテローム斑が徐々に拡大することにより起こるとされている。この病態では、抗血小板薬が有効とされている。
【００１６】
静脈血栓症は全身の表在性や深部のどの静脈にも起こり得るが、下腿静脈、大腿静脈、骨盤内深在静脈等の深部静脈血栓症（Ｄｅｅｐ Ｖｅｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、以下ＤＶＴと略称することがある）は頻度も多く、致命的となり得る肺塞栓を生じる可能性があり臨床的に重要である。ＤＶＴでは、血管内皮細胞の傷害によりコラーゲンが露出し、組織トロンボブラスチンが放出され、ここにうっ血を伴うと血液凝固が亢進して血栓が形成すると考えられている。この病態では、抗凝固薬（ヘパリンやワーファリン等）や抗血小板薬（アスピリン等）が血栓の形成や拡大の防止に有効であることが知られている。
【００１７】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ２００４／０３５８２６号パンフレット。
【非特許文献１】ドーサム（Ｄｏｒｓａｍ，Ｒ．Ｔ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、第３号、ｐ．３４０−３４５。
【非特許文献２】クナプリ（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．）ら、「バイオケミカル ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９８年、第３３６巻、ｐ．５１３−５２３。
【非特許文献３】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．９８９−９９５。
【非特許文献４】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．２９７１−２９７３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
血栓形成に起因する血栓性疾患、例えば冠動脈疾患や脳卒中はヒトの死因において多くの割合を占める疾患である。冠動脈疾患や脳卒中は、これら疾患のリスクを高める因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正により、その発症の危険率を低下させることができる。これら疾患の発症リスクの回避、早期治療、治療法の選択および薬物の用量設定を可能にするため、当該疾患の早期診断が望まれる。
【００１９】
血栓形成における初期反応である血小板凝集に中心的役割を果たすヒトＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子には、Ｈ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている。Ｈ２ハプロタイプを有する個体では、血小板凝集能の亢進が認められている（非特許文献３および非特許文献４）。
【００２０】
本発明の課題は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定するのに有用な１塩基変異を見出し、さらに血栓性疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異が該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していることを明らかにした。そして、これら１塩基変異を、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に利用すること、並びに該疾患の早期診断および罹患危険率判定のための検査方法に利用することにより本発明を完成した。
【００２２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の検出は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のテンプレートとして、遺伝子変異およびハプロタイプが考慮されていないＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３遺伝子配列（第３染色体塩基配列であり、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列を含む）を用い、日本人のゲノム試料を母集団として実施した。このテンプレート配列を参照配列と呼称することがある。本明細書において、１塩基変異部位は、参照配列における塩基の位置として定義する。
【００２３】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ公開データベースに開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００２４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列ではＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたものと比較して１６１７８９ｂｐ下流にシフトしている。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域内の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における当該各塩基の位置と比較して、１６１７８９ｂｐ下流に位置する。
【００２５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位に相当する。一方、本領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位に相当する。
【００２６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位の塩基配列と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位の塩基配列は、完全に一致している。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版の改訂前後において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列は変化していない。
【００２７】
このように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８とＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９とでその位置が相違するのみであることから、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を該位置に相当するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したとき、位置を示す塩基番号は異なるが、それぞれの塩基番号により特定されるのは同じ１塩基変異である。
【００２８】
本明細書においては、特に定義しない限り、参照配列としてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列を用い、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示した。これら各塩基は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置の１６１７８９ｂｐ下流に位置する。すなわち、これら各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における塩基番号に１６１７８９を加算した塩基番号で表すことができる。
【００２９】
後述するヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置について、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置とを対比して、表２−１、表２−２、および表２−３に示す。
【００３０】
【表２−１】
【００３１】
【表２−２】
【００３２】
【表２−３】
【００３３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、上述のように、ヒト第３染色体塩基配列を開示しているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版により、その版におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置がシフトすることがあるため、異なることがある。また、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列におけるものとは異なることがある。
【００３４】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位は、次に示すように特定することができる。まず、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列であって該１塩基変異部位のヌクレオチドを含む部分塩基配列を指標として用い、該部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出し、さらに該部分塩基配列と参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列とを比較して、参照配列における該１塩基変異部位を特定することにより決定することができる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列において検索することは、自体公知の相同性検索法、例えばブラストサーチ（ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ）により実施できる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と、参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列は、完全に相同である必要はなく、参照配列中に複数の該部分塩基配列と相同な塩基配列が存在しない限りにおいて、１ないし数個の塩基が異なっていてもよい。
【００３５】
具体的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８１６７３位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８１６７３位は、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３６】
また、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８０１８８位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８０１８８位は、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３７】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３８】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８０８４位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８０８４位は、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３９】
参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位の決定に有用な塩基配列情報、すなわちＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列情報と、該部分塩基配列情報におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３中、「＊」にて表示したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位は、表１に示すように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ２ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドの塩基はＡであるが、Ｈ１ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドは欠失している。このような場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位（目的の塩基の位置と称することがある）は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いるとき、該参照配列における位置を、次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。次いで、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列の第１０７番目から第１０８番目のヌクレオチド（ＡＡ）に相当する部位を指標にして、参照配列における目的の塩基の位置を特定できる。
【００４２】
すなわち、本発明は、
１．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
２．１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位または第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、前記１．の遺伝子変異の検出方法、
３．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
４．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
５．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
６．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
７．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７９３５０位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
８．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８１６７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
９．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８０１８８位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
１０．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７８０８４位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
１１．前記３．から１０．のいずれかの１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする前記１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、
１２．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１３．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１４．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１５．配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、
１６．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１７．血栓性疾患がアテローム性血栓症である前記１６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１８．血栓性疾患が末梢動脈疾患である前記１６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１９．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、
２０．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法、
２１．前記１３．の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに前記１４．または１５．のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット、
２２．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
２３．１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位、第１５２５４１９７７位、第１５２５４１１３９位または第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、前記２２．の遺伝子変異の検出方法、
２４．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２５．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２６．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２７．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２８．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
２９．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４３４６２位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３０．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１９７７位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３１．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９８７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３２．前記２４．から３１．のいずれかの１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする前記２２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、
３３．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３４．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３５．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３６．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３７．血栓性疾患がアテローム性血栓症である前記３６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３８．血栓性疾患が末梢動脈疾患である前記３６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３９．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、
４０．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法、
４１．前記３４．の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに前記１５．または３５．のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列における１塩基変異を解析することにより、該遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することができる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においては、血小板凝集能の亢進が認められる（非特許文献３）。また、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプが、末梢動脈障害発症の危険因子となること（非特許文献４）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）との間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されている。さらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定により、アテローム性血栓症の罹患危険率およびチエノピリジン抗血栓薬（例えばＰ２Ｙ１２受容体をターゲットとするクロピドグレルやチクロピジン等）に対する低感受性の検出を実施できると考えられている（特許文献１）。したがって、本発明によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することで、血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出が可能になる。本発明により血栓性疾患の罹患危険率が高いと判定された場合、発症する前にそれらの危険因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正を行なうことができる。また、本発明によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することで、チエノピリジン抗血栓薬や、Ｐ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬に対する低感受性の判定が可能になる。本発明によりチエノピリジン抗血栓薬やＰ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬に対して低感受性であると判定された場合は、これら薬剤の用量を増加するといった選択や、これら薬剤を用いる治療法以外の治療法の選択が可能になる。
【００４４】
このように本発明は、血栓性疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、ヒト血小板表面に存在するＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子のゲノム配列における１塩基変異を、血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に利用することにより達成したものである。さらに、本発明において、該検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率の検査方法を提供することができる。
【００４６】
本発明において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異が該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していることを明らかにした。以下、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子とは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を意味する。
【００４７】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においては、血小板凝集能の亢進が認められることが報告されている（非特許文献３）。また、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプが、末梢動脈障害発症の危険因子となること（非特許文献４）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）との間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されている。ＰＡＤと同様に脳卒中や冠動脈疾患は動脈血栓を発症原因とする疾患であることから、脳卒中や冠動脈疾患とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの間に高い相関性が存在すると考える。一方、深部静脈血栓症は、脳卒中、冠動脈疾患およびＰＡＤとは異なり、静脈血栓を発症原因とする疾患である。深部静脈血栓症では抗血小板薬が血栓の形成や拡大の防止に有効であることから、血小板凝集能の亢進は、深部静脈血栓症の発症に関与する可能性がある。これらから、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに認められる１塩基変異は血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異であると考える。
【００４８】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、該遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することができ、さらに血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。
【００４９】
以下においてＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【００５０】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は、第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位および第１５２３７８０８４位における１塩基変異である。これら１塩基変異が認められたＰ２Ｙ１２受容体遺伝子において、各位置の塩基はそれぞれ、シトシン（Ｃ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であった（実施例および表７参照）。これら各位置の塩基は、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子においては、それぞれグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。これら１塩基変異とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖を示唆する報告はない。
【００５１】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプは、表１に示した既知１塩基変異４種類の検出により特定できることが開示されている（特許文献１）。これら既知１塩基変異は、白色人種健常人由来のゲノム試料において見出されたものである。また、欧米人においてＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプのアリル頻度は、それぞれ８６．２％および１３．８％であることが報告されている（非特許文献３）。
【００５２】
しかしながら、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する５例を日本人健常人由来のゲノム試料において見出した。これらの例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（実施例および表７参照）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。
【００５３】
このように、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった（実施例および表８参照）。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する（例数＝５）。Ｈ２´ハプロタイプの存在は日本人のゲノムＤＮＡ試料を用いた解析で判明したが、既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。Ｈ２´ハプロタイプには、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の４種類すべてが認められた。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【００５４】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異について検討したゲノムＤＮＡ１４１例において、Ｈ１ハプロタイプのホモ接合体は９４例であった。また、Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体、Ｈ１／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体およびＨ２／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体はそれぞれ、４２例、４例および１例であった。
【００５５】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出によりＨ２ハプロタイプであると特定されるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子には、Ｈ２´ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が含まれる。上記のように、Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。したがって、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出により、血小板凝集能の亢進に起因する疾患、例えば血栓性疾患を惹き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を実施できる。
【００５６】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定は、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出により行うことができる。該遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定は、表１に示した既知１塩基変異４種類の検出によっても行うことができるが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出をさらに行うことにより、特定の確度はより高くなる。既知４種類の１塩基変異（表１）のうちイントロン１に存在する１塩基変異は全てＨ２ハプロタイプと完全に連鎖するのに対し、エキソン２に存在する１塩基変異とＨ２ハプロタイプには完全な連鎖が認められない。したがって、エキソン２に存在する１塩基変異の検出のみではＨ２ハプロタイプの特定は難しい。また、イントロン１に存在する１塩基挿入を伴う１塩基変異の検出は、一般的に塩基の挿入による変異の検出の精度が低いことが知られていることから、その検出の精度が低いと考える。それに対し、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異はいずれも置換変異であり、Ｈ２ハプロタイプと完全に連鎖している。このことから、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、既報の１塩基変異（表１）の検出と比較して、より高い精度および確度でＨ２ハプロタイプを検出することができる。
【００５７】
また、従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型（Ｈ２´ハプロタイプ）を示す例が存在することが判明した。Ｈ２´ハプロタイプは、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の４種類すべてが認められた。したがって、表１に示した４種類の既知１塩基変異の全てを検出する方法においては、Ｈ２´ハプロタイプが検出されない。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、Ｈ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプの両方の検出ができる。
【００５８】
本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖する１塩基変異を検出することを手段とする。より具体的には、本検出方法は、（ｉ）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異が存在する位置における塩基を決定し、（ｉｉ）該塩基の種類とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無を特定し、（ｉｉｉ）それにより血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することを手段とする。
【００５９】
塩基の決定は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列における次の位置に相当する塩基について行なう：好ましくは第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位および第１５２３７８０８４位である。塩基の決定はこれら位置の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上、より好ましくは３箇所以上、さらに好ましくは４箇所について行う。これら位置の１塩基変異に加え、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに連鎖することが報告されている既知１塩基変異をさらに検出することもできる。
【００６０】
決定された塩基の種類とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無の特定は、該塩基の種類を本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、該変異はＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖すると判定できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異との比較に加え、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに連鎖することが報告されている既知１塩基変異と比較して既知１塩基変異と同一の１塩基変異の有無を判定することにより、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無を特定することもできる。
【００６１】
塩基の決定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により、所望の位置の塩基を含むＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。
【００６２】
塩基の決定は、具体的には以下のように実施できる。第１５２３８１６７３位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号１および配列番号２に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号１０および配列番号２８に記載の各ポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３８０１８８位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号３および配列番号４に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７９３５０位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号５および配列番号６に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号１８および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７８０８４位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号７および配列番号８に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを例示できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域を増幅するためのＰＣＲに用いるプライマーは上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、該所望の領域を増幅し得るプライマーであればいずれも使用できる。また、シークエンス法に用いるプライマーも上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域の塩基配列を決定し得るプライマーであればいずれも使用できる。ＰＣＲおよびシークエンス法は、一般的に知られている方法に準じて実施することができる。
【００６３】
塩基の決定は、その他、公知の１塩基変異検出法を使用して実施できる。１塩基変異検出法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法等の遺伝子タイピング法が挙げられる。ＳＮｕＰｅ法による塩基の決定は、具体的には、第１５２３７９３５０位の塩基の決定を例に取ると、該塩基を含むＤＮＡ断片を配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、得られた増幅産物の標的位置の塩基の種類を配列番号４１に記載のポリヌクレオチドをタイピング用プライマーとして用いてＳＮｕＰｅ法でタイピングすることにより実施できる（実施例参照）。また、タイピング用プライマーとして、配列番号４３に記載のポリヌクレオチドを使用して同様に第１５２３７９３５０位の塩基の種類を決定することができる。第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位および第１５２３７８０８４位の塩基の決定も、同様に実施できる。これら位置の塩基のタイピングに用いるタイピング用プライマーは、該位置に隣接する上流または下流の塩基配列から適宜設計し取得できる。具体的には、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３８０１８８位の位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７８０８４位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６４】
また、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出し、さらに、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であることを検出することまたは手段により、Ｈ２´ハプロタイプの特定ができる。第１５２３７７５０７位の塩基の決定は、具体的には例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の標的位置の塩基の種類を遺伝子タイピング法により決定することにより実施できる（実施例参照）。遺伝子タイピング法として、ＳＮｕＰｅ法が挙げられる。タイピング用プライマーとして、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６５】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出や手段は、その他、自体公知の１塩基変異解析方法を適用して実施できる。１塩基変異解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）を例示できる。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法として、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等を例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）およびタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００６６】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出や手段はまた、対立遺伝子特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により実施できる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ塩基配列の差に基づく差異を有する２個以上の遺伝子をいう。
【００６７】
核酸プローブとしては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において本発明に係る１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中において１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００６８】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、本発明に係る１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。プローブとして具体的には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分塩基配列であって本発明に係る１塩基変異のいずれか１を有する塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示できる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等の標識体で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブとそれに対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであればいずれも使用できる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【００６９】
被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは組織等から調製した核酸試料のいずれであってもよい。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、好ましくはゲノムＤＮＡを用いる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【００７０】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率の検査方法を実施することができる。また、本遺伝子変異の検出方法を用いて、血小板凝集能の亢進に係る疾患の早期診断を実施できる。
【００７１】
血小板凝集能の亢進に係る疾患として、血栓性疾患が挙げられる。好ましくはアテローム性血栓症が挙げられる。より具体的には、動脈の閉塞に起因する冠状動脈疾患、脳卒中、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）等、また、静脈の閉塞に起因する静脈血栓症等を例示できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においてＰＡＤとの間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されていることから、さらに好ましくはＰＡＤが挙げられる。
【００７２】
疾患の罹患危険率の検査方法は、具体的には、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子について、本発明に係る１塩基変異が認められた位置に相当する位置の塩基のうち少なくとも１の塩基を決定し、当該位置における塩基の種類をＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの塩基配列と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型はＨ２ハプロタイプであると判定でき、それにより血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率が高いと判定できる。対立遺伝子の双方の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであっても、一方の遺伝子型のみがＨ２ハプロタイプであっても血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率が高いと判定することができる。
【００７３】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血小板凝集能の亢進に係る疾患の予防および／または治療剤に対する反応性の予測方法を実施することができる。Ｈ２ハプロタイプの特定により、チエノピリジン抗血栓薬（Ｐ２Ｙ１２受容体を標的とするクロピドグレル、チクロピジンおよびＣＳ−７４７等）や、その他のＰ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬（以下、Ｐ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬と称する）に対する低感受性を検出できると考えられている（特許文献１）。また、Ｈ２ハプロタイプを有する個体では血小板凝集能が亢進していることが報告されており（非特許文献３）、この血小板凝集能の亢進には細胞表面のＰ２Ｙ１２受容体数の増加が関与していると推測されている。Ｐ２Ｙ１２受容体数の増加は、Ｐ２Ｙ１２受容体をターゲットとする抗血栓薬に対する低感受性の原因になり得ると考える。したがって、本発明によりＨ２ハプロタイプを特定することで、チエノピリジン抗血栓薬およびＰ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬に対する低感受性の判定が可能になる。
【００７４】
本発明に係る抗血栓薬に対する反応性の予測方法は、具体的には、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子について、本発明に係る１塩基変異が認められた位置に相当する位置の塩基のうち少なくとも１の塩基を決定し、当該位置における塩基の種類をＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの塩基配列と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型はＨ２ハプロタイプであると判定でき、それにより抗血栓薬に対する反応性が低いと判定できる。対立遺伝子の双方の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであっても、一方の遺伝子型のみがＨ２ハプロタイプであっても抗血栓薬に対する反応性が低いと判定することができる。
【００７５】
本発明に係る抗血栓薬に対する反応性の予測方法は、好ましくはチエノピリジン抗血栓薬（Ｐ２Ｙ１２受容体を標的とするクロピドグレル、チクロピジンおよびＣＳ−７４７等）や、その他のＰ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬に対する反応性の予測に使用できる。
【００７６】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、さらに、血小板凝集能の亢進に係る疾患の予防および／または治療剤の選択方法、および該予防および／または治療剤の用量を決定する方法を実施できる。本遺伝子変異の検出方法により、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであると判定された場合、抗血栓薬に対し低感受性であると判定できるため、抗血栓薬の用量を増加する等の調節を行うことができる。あるいは、低感受性であると考えられる抗血栓薬を選択せずに他の抗血栓薬を選択することができる。
【００７７】
本発明は、ゲノム塩基配列第１５２３８１６７３位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００７８】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３８０１８８位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３８０１８８位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００７９】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３７９３５０位がチミン（Ｔ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドの組合せ、または配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドの組み合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該該領域に含まれる標的位置の塩基のタイピングに用いるタイピング用プライマーとして配列番号４１に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３７９３５０位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００８０】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３７８０８４位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３７８０８４位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００８１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体的な塩基配列に関わる情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得できる。
【００８２】
プローブやプライマーは、本発明に係る１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製することができる。
【００８３】
上記ポリヌクレオチド、上記プロ−ブおよび上記プライマーは、いずれも試薬として使用できる。また、これらの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、１塩基変異検出用の標識物質、緩衝液、並びに塩等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬および試薬キットは、本発明に係る検出方法および検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【００８４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。本実施例においてＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【実施例１】
【００８５】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の解析）
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン１上流３ｋｂの地点からエキソン２の５´側約１５０ｂｐについて（全長約５ｋｂ）、ゲノム配列の解析により変異の検出を行なった。試料は１４１例の日本人健常人から供与を受けたゲノムＤＮＡを用いた。
【００８６】
まず、２０例のゲノムＤＮＡを用い、ゲノムＤＮＡからＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシークエンス法を用いて決定することにより変異の検出を実施した。
【００８７】
標的領域の増幅はＰＣＲにより行なった。標的領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたゲノム塩基配列を参照配列として、該ゲノム塩基配列に含まれるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の４箇所に設定し、ＰＣＲ用プライマーは、該塩基配列に基づいて設計し作製した（表４）。ゲノムＤＮＡ試料２μｌを鋳型として、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）またはＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、２０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、各標的領域により異なる反応条件を用いた（表５）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
【表５】
【００９０】
ＰＣＲ反応条件Ａ
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ６２℃ ３０秒間
４） ７２℃ ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ １０分間
【００９１】
ＰＣＲ反応条件Ｂ
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ５８℃ ３０秒間
４） ７２℃ ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ １０分間
【００９２】
ＰＣＲ増幅産物をエキソサップ（Ｅｘｏ ＳＡＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製し、シークエンス反応の鋳型として用いた。シークエンス反応は表６に示したプライマーおよびダイナミックＥＴダイターミネーターキット（ＤｙＥｎａｍｉｃ ＥＴ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。反応産物はセファデックス−５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−５０）を用いてゲルろ過法により精製した。シークエンサーは、メガベース１０００（ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【００９３】
得られた配列データを用いて、フレッド／フラップ／ポリフレッド（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ）ソフトウエアにより各塩基の精度（クオリティー値）の算出、アセンブルおよび変異の検出を行った。標準塩基配列および塩基位置として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列および塩基位置を使用した。
【００９４】
【表６】
【００９５】
塩基配列解析の結果、表７に示す４種類の１塩基変異がＨ２ハプロタイプと完全に連鎖していることが明らかになった。表７に示す４種類の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、既知１塩基変異（表１）のうち、イントロン１に存在する３種類の１塩基変異が全て認められた。
【００９６】
【表７】
【００９７】
また、塩基配列解析の結果、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していると報告されている既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する例を見出した。すなわち、エキソン２に存在するこの１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと完全に連鎖していないと考える。この例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（表
７）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。
【００９８】
このことから、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【００９９】
Ｈ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプと連鎖するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を表８にまとめて示す。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
表８において、＃１、＃２、＃３および＃７に示した１塩基変異は、本発明においてＨ２ハプロタイプと完全に連鎖することを明らかにした１塩基変異である。＃４、＃５および＃６に示した１塩基変異は、既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）である。＃８に示した１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと連鎖すると報告されている１塩基変異である（特許文献１、非特許文献３および特許文献４）が、日本人においてはこの１塩基変異が認められない数例を見出した。既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。
【０１０２】
（第１５２３７９３５０位の塩基および第１５２３７７５０７位の塩基の解析）
次に、１２１例の健常人のゲノムＤＮＡを用い、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異、およびＨ２ハプロタイプとの連鎖が完全ではないと判明した第１５２３７７５０７位の１塩基変異について解析した。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異として、第１５２３７９３５０位の１塩基変異を解析した。第１５２３７９３５０位の１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプであることから、第１５２３７９３５０位の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖する他の１塩基変異（第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７８０８４位の１塩基変異等）も存在する。
【０１０３】
これら２種類の１塩基変異の検出は、各ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の検出を標的位置の塩基を含むＤＮＡ断片を用いて、ＳＮｕＰｅ反応により行った。ＰＣＲは、各ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲプライマーを用いて行った。ＰＣＲプライマーは、第１５２３７９３５０位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。また、第１５２３７７５０７位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。具体的には、各鋳型２μｌを使用し、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いて１０μｌの反応系でＰＣＲを行った。なおポジティブコントロールは１０ｎｇ／μｌに調製したヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を使用し、ネガティブコントロールには鋳型を加えずにＰＣＲを行った。
【０１０４】
ＰＣＲ反応条件は以下に示す。
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ５４℃ ３０秒間
４） ７２℃ ４５秒間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ ４分間
【０１０５】
ＰＣＲ増幅産物は４℃で冷却後、セファデックス Ｇ５０ ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製し、ＳＮｕＰｅ反応に使用した。
【０１０６】
ＳＮｕＰｅ反応は、各１塩基変異が存在する位置の直前に設計したＳＮｕＰｅプライマー、鋳型である精製ＰＣＲ増幅産物およびメガベース ＳＮｕＰｅ遺伝子タイピングキット（ＭｅｇａＢＡＣＥ ＳＮｕＰｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、キットの添付資料に記載の方法に従って実施した。第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位の塩基のタイピング用ＳＮｕＰｅプライマーとしてそれぞれ表９に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。なお、配列番号４２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子ゲノム塩基配列の第１５２３７７５３２位から第１５２３７７５０８位までの２５ヌクレオチドからなる塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチドであるが、第１５２３７７５１９位のヌクレオチドを含まない２４ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
タイピング解析は９６ウエルプレートフォーマットのキャピラリーシークエンサー メガベース１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、データ解析ソフトであるＳＮＰプロファイラーを用いてタイピングを行った。
【０１０９】
検討した１４１例（上記ダイレクトシークエンス法で解析した２０例を含む）において、Ｈ１ハプロタイプのホモ接合体は９４例であった。また、Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体、Ｈ１／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体およびＨ２／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体はそれぞれ、４２例、４例および１例であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明によれば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプの特定ができ、その結果、該遺伝子のＨ２ハプロタイプと関連する易血栓性を検出することができる。さらに、本発明によれば、血栓性疾患、例えばアテローム性血栓症、具体的には心筋梗塞、脳卒中および末梢動脈疾患等の罹患危険率の判定および早期診断の実施が可能になる。本発明は、血栓性疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用であり、医薬分野において多大に寄与するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５０：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５１：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５２：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５３：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５４：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５４：（３０）：（３０）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５４：（６８）：（６８）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５５：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５５：（１）：（６）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５６：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の解析による、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に関する。また前記検出方法を利用する血栓性疾患罹患危険率の検査方法に関する。さらに、前記１塩基変異を有する遺伝子、並びに前記検出方法および前記検査方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ２Ｙ１２受容体は、アデノシン ５´ジホスフェート（以下、ＡＤＰと略称する）と結合することにより、血小板を活性化させる受容体である（非特許文献１および非特許文献２）。血小板活性化は止血に関わる重要な生理現象である一方、血栓形成にも関わり血管閉塞や虚血性ダメージを引き起こす。
【０００３】
ＡＤＰは血小板中の濃染顆粒に含まれており、血小板活性化に伴い細胞外に放出される。放出されたＡＤＰは周辺の血小板表面に存在する２種類のＡＤＰ受容体（Ｐ２Ｙ１受容体およびＰ２Ｙ１２受容体）に結合することにより血小板凝集を促進する。Ｐ２Ｙ１受容体は三量体Ｇ蛋白質であるＧｑと共役しており、細胞内カルシウム濃度の上昇を介して形態変化等の血小板凝集の初期反応に関与している。Ｐ２Ｙ１２受容体はＧ蛋白質であるＧｉと共役しており、低分子量Ｇ蛋白質のＲａｐ１ｂやセリンスレオニンキナーゼのＡｋｔの活性化を介して血小板凝集塊の成長や安定化に関与している。
【０００４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子は、第３染色体ｑ２４−ｑ２５遺伝子座に存在する遺伝子である。該遺伝子は２つのエキソンを含み、その全長は約３．１ｋｂであり、３４２アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。
【０００５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子にはＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている（特許文献１、非特許文献３および非特許文献４）。Ｈ１ハプロタイプは、アリル頻度が高く、正常遺伝子型であると考えられる。一方、Ｈ２ハプロタイプを有する個体ではＡＤＰ誘起血小板凝集能が亢進していること、およびＨ２ハプロタイプが末梢動脈障害発症の危険因子となることが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体で血小板凝集能が亢進するメカニズムについては明らかになっていない。恐らく、細胞表面のＰ２Ｙ１２受容体数が増加しているのではないかと推測されている。
【０００６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプには、４種類の１塩基変異が存在する（表１）。以下、これら１塩基変異を既知１塩基変異と称する。これら既知１塩基変異を同定することにより、Ｈ２ハプロタイプを特定できることが開示されている（特許文献１）。また、Ｈ２ハプロタイプと末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＰＡＤと略称することがある）との間に高い相関性が存在することが開示されている（特許文献１）。さらに、Ｈ２ハプロタイプの特定により、アテローム性血栓症の罹患危険率およびチエノピリジン抗血栓薬（例えばＰ２Ｙ１２受容体をターゲットとするクロピドグレルやチクロピジン等）に対する低感受性の検出を実施できると考えられることが開示されている（特許文献１）。
【０００７】
【表１】
【０００８】
表１において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体のゲノム塩基配列における位置として表した。
【０００９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースに開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００１０】
したがって、表１において、１塩基変異が存在する位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置として表した。
【００１１】
止血機構は、生体内で血管が損傷した場合、血管の機能、血小板機能、凝固・線溶系等の密接な相互作用のもとに働く生理的機構である。止血機構の異常は各種の出血性疾患や血栓性疾患等の原因になる。病的生理条件では、例えばアテローム斑の破裂により病的な血小板活性化が惹起され、その結果、動脈血栓が形成され、ひいては心筋梗塞、虚血性脳卒中、および末梢動脈疾患が引き起こされる可能性がある。
【００１２】
血栓性疾患は、血栓による血管の狭窄あるいは閉塞に起因する疾患であり、血栓症と塞栓症とに分類できる。血栓症は、血栓がその形成箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状であり、塞栓症は血栓がその形成箇所から剥がれて血流により移動し、他の箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状をいう。向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患として冠動脈疾患、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳梗塞、および深部静脈血栓症を例示できる。
【００１３】
冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＡＤと略称することがある）は、冠状動脈の閉塞による疾患として知られている。ＣＡＤは虚血性心疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、心筋への血液供給が著しく減少するため、心筋梗塞、狭心症あるいは不整脈等の症状が引き起こされる。
【００１４】
虚血性脳卒中は虚血性脳血管障害であり、脳梗塞や一過性脳虚血発作等が含まれる。脳梗塞は、脳卒中のなかに占める割合が高い。脳梗塞はその原因により２つ、すなわち脳血栓によるものと脳塞栓によるものとに大別される。脳血栓は脳の血管が動脈硬化等の変化により狭窄し、血流が悪くなって血栓を形成することに起因する。脳塞栓は心臓内や頚動脈において形成された血栓が血流により脳血管に運ばれた結果、脳血管の閉塞を起こすことに起因する。脳梗塞は心原性と非心原性に分類される。心原性脳梗塞では抗凝固薬、非心原性脳梗塞では抗血小板薬が特に有効であることが示されている。
【００１５】
末梢動脈の閉塞による疾患として末梢動脈疾患（ＰＡＤ）が知られている。ＰＡＤは、ほとんどの患者ではアテローム性動脈硬化が基礎にあり、ＣＡＤおよび心原性を除く脳梗塞と病態生理学的には極めて近いと考えられている。急性の虚血は近位の動脈硬化性プラークの破裂、先在するアテローム性動脈硬化による急性血栓症、心臓、大動脈または他の大型の脈管から飛来した塞栓、動脈瘤解離が原因である。慢性の虚血はアテローム斑が徐々に拡大することにより起こるとされている。この病態では、抗血小板薬が有効とされている。
【００１６】
静脈血栓症は全身の表在性や深部のどの静脈にも起こり得るが、下腿静脈、大腿静脈、骨盤内深在静脈等の深部静脈血栓症（Ｄｅｅｐ Ｖｅｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、以下ＤＶＴと略称することがある）は頻度も多く、致命的となり得る肺塞栓を生じる可能性があり臨床的に重要である。ＤＶＴでは、血管内皮細胞の傷害によりコラーゲンが露出し、組織トロンボブラスチンが放出され、ここにうっ血を伴うと血液凝固が亢進して血栓が形成すると考えられている。この病態では、抗凝固薬（ヘパリンやワーファリン等）や抗血小板薬（アスピリン等）が血栓の形成や拡大の防止に有効であることが知られている。
【００１７】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ２００４／０３５８２６号パンフレット。
【非特許文献１】ドーサム（Ｄｏｒｓａｍ，Ｒ．Ｔ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、第３号、ｐ．３４０−３４５。
【非特許文献２】クナプリ（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．）ら、「バイオケミカル ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９８年、第３３６巻、ｐ．５１３−５２３。
【非特許文献３】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．９８９−９９５。
【非特許文献４】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．２９７１−２９７３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
血栓形成に起因する血栓性疾患、例えば冠動脈疾患や脳卒中はヒトの死因において多くの割合を占める疾患である。冠動脈疾患や脳卒中は、これら疾患のリスクを高める因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正により、その発症の危険率を低下させることができる。これら疾患の発症リスクの回避、早期治療、治療法の選択および薬物の用量設定を可能にするため、当該疾患の早期診断が望まれる。
【００１９】
血栓形成における初期反応である血小板凝集に中心的役割を果たすヒトＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子には、Ｈ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている。Ｈ２ハプロタイプを有する個体では、血小板凝集能の亢進が認められている（非特許文献３および非特許文献４）。
【００２０】
本発明の課題は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定するのに有用な１塩基変異を見出し、さらに血栓性疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異が該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していることを明らかにした。そして、これら１塩基変異を、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に利用すること、並びに該疾患の早期診断および罹患危険率判定のための検査方法に利用することにより本発明を完成した。
【００２２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の検出は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のテンプレートとして、遺伝子変異およびハプロタイプが考慮されていないＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３遺伝子配列（第３染色体塩基配列であり、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列を含む）を用い、日本人のゲノム試料を母集団として実施した。このテンプレート配列を参照配列と呼称することがある。本明細書において、１塩基変異部位は、参照配列における塩基の位置として定義する。
【００２３】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ公開データベースに開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００２４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列ではＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたものと比較して１６１７８９ｂｐ下流にシフトしている。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域内の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における当該各塩基の位置と比較して、１６１７８９ｂｐ下流に位置する。
【００２５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位に相当する。一方、本領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位に相当する。
【００２６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位の塩基配列と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位の塩基配列は、完全に一致している。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版の改訂前後において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列は変化していない。
【００２７】
このように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８とＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９とでその位置が相違するのみであることから、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を該位置に相当するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したとき、位置を示す塩基番号は異なるが、それぞれの塩基番号により特定されるのは同じ１塩基変異である。
【００２８】
本明細書においては、特に定義しない限り、参照配列としてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列を用い、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示した。これら各塩基は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置の１６１７８９ｂｐ下流に位置する。すなわち、これら各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における塩基番号に１６１７８９を加算した塩基番号で表すことができる。
【００２９】
後述するヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置について、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置とを対比して、表２−１、表２−２、および表２−３に示す。
【００３０】
【表２−１】
【００３１】
【表２−２】
【００３２】
【表２−３】
【００３３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、上述のように、ヒト第３染色体塩基配列を開示しているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版により、その版におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置がシフトすることがあるため、異なることがある。また、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列におけるものとは異なることがある。
【００３４】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位は、次に示すように特定することができる。まず、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列であって該１塩基変異部位のヌクレオチドを含む部分塩基配列を指標として用い、該部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出し、さらに該部分塩基配列と参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列とを比較して、参照配列における該１塩基変異部位を特定することにより決定することができる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列において検索することは、自体公知の相同性検索法、例えばブラストサーチ（ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ）により実施できる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と、参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列は、完全に相同である必要はなく、参照配列中に複数の該部分塩基配列と相同な塩基配列が存在しない限りにおいて、１ないし数個の塩基が異なっていてもよい。
【００３５】
具体的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８１６７３位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８１６７３位は、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３６】
また、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８０１８８位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８０１８８位は、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５１に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３７】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３８】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８０８４位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８０８４位は、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５５に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００３９】
参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位の決定に有用な塩基配列情報、すなわちＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列情報と、該部分塩基配列情報におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３中、「＊」にて表示したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位は、表１に示すように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ２ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドの塩基はＡであるが、Ｈ１ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドは欠失している。このような場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位（目的の塩基の位置と称することがある）は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いるとき、該参照配列における位置を、次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。次いで、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列の第１０７番目から第１０８番目のヌクレオチド（ＡＡ）に相当する部位を指標にして、参照配列における目的の塩基の位置を特定できる。
【００４２】
すなわち、本発明は、
１．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
２．１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位または第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、前記１．の遺伝子変異の検出方法、
３．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
４．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
５．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
６．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
７．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７９３５０位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
８．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８１６７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
９．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８０１８８位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
１０．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７８０８４位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
１１．前記３．から１０．のいずれかの１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする前記１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、
１２．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１３．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１４．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
１５．配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、
１６．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１７．血栓性疾患がアテローム性血栓症である前記１６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１８．血栓性疾患が末梢動脈疾患である前記１６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
１９．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、
２０．前記１．、２．または１１．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法、
２１．前記１３．の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに前記１４．または１５．のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット、
２２．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
２３．１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位、第１５２５４１９７７位、第１５２５４１１３９位または第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、前記２２．の遺伝子変異の検出方法、
２４．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２５．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２６．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２７．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程、
２８．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
２９．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４３４６２位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３０．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１９７７位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３１．下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９８７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程、
３２．前記２４．から３１．のいずれかの１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする前記２２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法、
３３．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３４．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３５．ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）、
３６．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３７．血栓性疾患がアテローム性血栓症である前記３６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３８．血栓性疾患が末梢動脈疾患である前記３６．の血栓性疾患の罹患危険率検査方法、
３９．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、
４０．前記２２．、２３．または３２．の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法、
４１．前記３４．の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに前記１５．または３５．のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列における１塩基変異を解析することにより、該遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することができる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においては、血小板凝集能の亢進が認められる（非特許文献３）。また、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプが、末梢動脈障害発症の危険因子となること（非特許文献４）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）との間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されている。さらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定により、アテローム性血栓症の罹患危険率およびチエノピリジン抗血栓薬（例えばＰ２Ｙ１２受容体をターゲットとするクロピドグレルやチクロピジン等）に対する低感受性の検出を実施できると考えられている（特許文献１）。したがって、本発明によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することで、血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出が可能になる。本発明により血栓性疾患の罹患危険率が高いと判定された場合、発症する前にそれらの危険因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正を行なうことができる。また、本発明によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することで、チエノピリジン抗血栓薬や、Ｐ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬に対する低感受性の判定が可能になる。本発明によりチエノピリジン抗血栓薬やＰ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬に対して低感受性であると判定された場合は、これら薬剤の用量を増加するといった選択や、これら薬剤を用いる治療法以外の治療法の選択が可能になる。
【００４４】
このように本発明は、血栓性疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、ヒト血小板表面に存在するＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子のゲノム配列における１塩基変異を、血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法に利用することにより達成したものである。さらに、本発明において、該検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率の検査方法を提供することができる。
【００４６】
本発明において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異が該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していることを明らかにした。以下、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子とは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を意味する。
【００４７】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においては、血小板凝集能の亢進が認められることが報告されている（非特許文献３）。また、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプが、末梢動脈障害発症の危険因子となること（非特許文献４）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）との間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されている。ＰＡＤと同様に脳卒中や冠動脈疾患は動脈血栓を発症原因とする疾患であることから、脳卒中や冠動脈疾患とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの間に高い相関性が存在すると考える。一方、深部静脈血栓症は、脳卒中、冠動脈疾患およびＰＡＤとは異なり、静脈血栓を発症原因とする疾患である。深部静脈血栓症では抗血小板薬が血栓の形成や拡大の防止に有効であることから、血小板凝集能の亢進は、深部静脈血栓症の発症に関与する可能性がある。これらから、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに認められる１塩基変異は血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異であると考える。
【００４８】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、該遺伝子のＨ２ハプロタイプを特定することができ、さらに血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することができる。
【００４９】
以下においてＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【００５０】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は、第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位および第１５２３７８０８４位における１塩基変異である。これら１塩基変異が認められたＰ２Ｙ１２受容体遺伝子において、各位置の塩基はそれぞれ、シトシン（Ｃ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であった（実施例および表７参照）。これら各位置の塩基は、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子においては、それぞれグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。これら１塩基変異とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖を示唆する報告はない。
【００５１】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプは、表１に示した既知１塩基変異４種類の検出により特定できることが開示されている（特許文献１）。これら既知１塩基変異は、白色人種健常人由来のゲノム試料において見出されたものである。また、欧米人においてＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプのアリル頻度は、それぞれ８６．２％および１３．８％であることが報告されている（非特許文献３）。
【００５２】
しかしながら、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する５例を日本人健常人由来のゲノム試料において見出した。これらの例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（実施例および表７参照）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。
【００５３】
このように、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった（実施例および表８参照）。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する（例数＝５）。Ｈ２´ハプロタイプの存在は日本人のゲノムＤＮＡ試料を用いた解析で判明したが、既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。Ｈ２´ハプロタイプには、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の４種類すべてが認められた。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【００５４】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異について検討したゲノムＤＮＡ１４１例において、Ｈ１ハプロタイプのホモ接合体は９４例であった。また、Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体、Ｈ１／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体およびＨ２／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体はそれぞれ、４２例、４例および１例であった。
【００５５】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出によりＨ２ハプロタイプであると特定されるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子には、Ｈ２´ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が含まれる。上記のように、Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。したがって、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出により、血小板凝集能の亢進に起因する疾患、例えば血栓性疾患を惹き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を実施できる。
【００５６】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定は、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出により行うことができる。該遺伝子のＨ２ハプロタイプの特定は、表１に示した既知１塩基変異４種類の検出によっても行うことができるが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出をさらに行うことにより、特定の確度はより高くなる。既知４種類の１塩基変異（表１）のうちイントロン１に存在する１塩基変異は全てＨ２ハプロタイプと完全に連鎖するのに対し、エキソン２に存在する１塩基変異とＨ２ハプロタイプには完全な連鎖が認められない。したがって、エキソン２に存在する１塩基変異の検出のみではＨ２ハプロタイプの特定は難しい。また、イントロン１に存在する１塩基挿入を伴う１塩基変異の検出は、一般的に塩基の挿入による変異の検出の精度が低いことが知られていることから、その検出の精度が低いと考える。それに対し、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異はいずれも置換変異であり、Ｈ２ハプロタイプと完全に連鎖している。このことから、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、既報の１塩基変異（表１）の検出と比較して、より高い精度および確度でＨ２ハプロタイプを検出することができる。
【００５７】
また、従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型（Ｈ２´ハプロタイプ）を示す例が存在することが判明した。Ｈ２´ハプロタイプは、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の４種類すべてが認められた。したがって、表１に示した４種類の既知１塩基変異の全てを検出する方法においては、Ｈ２´ハプロタイプが検出されない。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出することや手段により、Ｈ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプの両方の検出ができる。
【００５８】
本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖する１塩基変異を検出することを手段とする。より具体的には、本検出方法は、（ｉ）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異が存在する位置における塩基を決定し、（ｉｉ）該塩基の種類とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無を特定し、（ｉｉｉ）それにより血小板凝集能の亢進に係る疾患、例えば血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することを手段とする。
【００５９】
塩基の決定は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列における次の位置に相当する塩基について行なう：好ましくは第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位および第１５２３７８０８４位である。塩基の決定はこれら位置の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上、より好ましくは３箇所以上、さらに好ましくは４箇所について行う。これら位置の１塩基変異に加え、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに連鎖することが報告されている既知１塩基変異をさらに検出することもできる。
【００６０】
決定された塩基の種類とＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無の特定は、該塩基の種類を本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、該変異はＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖すると判定できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異との比較に加え、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプに連鎖することが報告されている既知１塩基変異と比較して既知１塩基変異と同一の１塩基変異の有無を判定することにより、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプとの連鎖の有無を特定することもできる。
【００６１】
塩基の決定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により、所望の位置の塩基を含むＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。
【００６２】
塩基の決定は、具体的には以下のように実施できる。第１５２３８１６７３位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号１および配列番号２に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号１０および配列番号２８に記載の各ポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３８０１８８位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号３および配列番号４に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７９３５０位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号５および配列番号６に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号１８および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７８０８４位の塩基の決定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号７および配列番号８に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマーとして、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを例示できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域を増幅するためのＰＣＲに用いるプライマーは上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、該所望の領域を増幅し得るプライマーであればいずれも使用できる。また、シークエンス法に用いるプライマーも上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域の塩基配列を決定し得るプライマーであればいずれも使用できる。ＰＣＲおよびシークエンス法は、一般的に知られている方法に準じて実施することができる。
【００６３】
塩基の決定は、その他、公知の１塩基変異検出法を使用して実施できる。１塩基変異検出法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法等の遺伝子タイピング法が挙げられる。ＳＮｕＰｅ法による塩基の決定は、具体的には、第１５２３７９３５０位の塩基の決定を例に取ると、該塩基を含むＤＮＡ断片を配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、得られた増幅産物の標的位置の塩基の種類を配列番号４１に記載のポリヌクレオチドをタイピング用プライマーとして用いてＳＮｕＰｅ法でタイピングすることにより実施できる（実施例参照）。また、タイピング用プライマーとして、配列番号４３に記載のポリヌクレオチドを使用して同様に第１５２３７９３５０位の塩基の種類を決定することができる。第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位および第１５２３７８０８４位の塩基の決定も、同様に実施できる。これら位置の塩基のタイピングに用いるタイピング用プライマーは、該位置に隣接する上流または下流の塩基配列から適宜設計し取得できる。具体的には、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３８０１８８位の位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７８０８４位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６４】
また、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を検出し、さらに、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であることを検出することまたは手段により、Ｈ２´ハプロタイプの特定ができる。第１５２３７７５０７位の塩基の決定は、具体的には例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の標的位置の塩基の種類を遺伝子タイピング法により決定することにより実施できる（実施例参照）。遺伝子タイピング法として、ＳＮｕＰｅ法が挙げられる。タイピング用プライマーとして、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６５】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出や手段は、その他、自体公知の１塩基変異解析方法を適用して実施できる。１塩基変異解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）を例示できる。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法として、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等を例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）およびタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００６６】
本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の検出や手段はまた、対立遺伝子特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により実施できる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ塩基配列の差に基づく差異を有する２個以上の遺伝子をいう。
【００６７】
核酸プローブとしては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において本発明に係る１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中において１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００６８】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、本発明に係る１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。プローブとして具体的には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分塩基配列であって本発明に係る１塩基変異のいずれか１を有する塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示できる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等の標識体で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブとそれに対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであればいずれも使用できる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【００６９】
被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは組織等から調製した核酸試料のいずれであってもよい。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、好ましくはゲノムＤＮＡを用いる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【００７０】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率の検査方法を実施することができる。また、本遺伝子変異の検出方法を用いて、血小板凝集能の亢進に係る疾患の早期診断を実施できる。
【００７１】
血小板凝集能の亢進に係る疾患として、血栓性疾患が挙げられる。好ましくはアテローム性血栓症が挙げられる。より具体的には、動脈の閉塞に起因する冠状動脈疾患、脳卒中、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）等、また、静脈の閉塞に起因する静脈血栓症等を例示できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体においてＰＡＤとの間に高い相関性が存在すること（特許文献１）が報告されていることから、さらに好ましくはＰＡＤが挙げられる。
【００７２】
疾患の罹患危険率の検査方法は、具体的には、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子について、本発明に係る１塩基変異が認められた位置に相当する位置の塩基のうち少なくとも１の塩基を決定し、当該位置における塩基の種類をＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの塩基配列と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型はＨ２ハプロタイプであると判定でき、それにより血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率が高いと判定できる。対立遺伝子の双方の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであっても、一方の遺伝子型のみがＨ２ハプロタイプであっても血小板凝集能の亢進に係る疾患の罹患危険率が高いと判定することができる。
【００７３】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血小板凝集能の亢進に係る疾患の予防および／または治療剤に対する反応性の予測方法を実施することができる。Ｈ２ハプロタイプの特定により、チエノピリジン抗血栓薬（Ｐ２Ｙ１２受容体を標的とするクロピドグレル、チクロピジンおよびＣＳ−７４７等）や、その他のＰ２Ｙ１２受容体を競合的に阻害する抗血栓薬（以下、Ｐ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬と称する）に対する低感受性を検出できると考えられている（特許文献１）。また、Ｈ２ハプロタイプを有する個体では血小板凝集能が亢進していることが報告されており（非特許文献３）、この血小板凝集能の亢進には細胞表面のＰ２Ｙ１２受容体数の増加が関与していると推測されている。Ｐ２Ｙ１２受容体数の増加は、Ｐ２Ｙ１２受容体をターゲットとする抗血栓薬に対する低感受性の原因になり得ると考える。したがって、本発明によりＨ２ハプロタイプを特定することで、チエノピリジン抗血栓薬およびＰ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬に対する低感受性の判定が可能になる。
【００７４】
本発明に係る抗血栓薬に対する反応性の予測方法は、具体的には、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子について、本発明に係る１塩基変異が認められた位置に相当する位置の塩基のうち少なくとも１の塩基を決定し、当該位置における塩基の種類をＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプの塩基配列と比較することにより実施できる。本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異は下記４種類の１塩基変異である；（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシン（Ｃ）である；（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミン（Ｔ）である；（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシン（Ｃ）である。決定された塩基の種類をこれら４種類の１塩基変異と比較して、少なくとも１、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４が一致すると認められた場合、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型はＨ２ハプロタイプであると判定でき、それにより抗血栓薬に対する反応性が低いと判定できる。対立遺伝子の双方の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであっても、一方の遺伝子型のみがＨ２ハプロタイプであっても抗血栓薬に対する反応性が低いと判定することができる。
【００７５】
本発明に係る抗血栓薬に対する反応性の予測方法は、好ましくはチエノピリジン抗血栓薬（Ｐ２Ｙ１２受容体を標的とするクロピドグレル、チクロピジンおよびＣＳ−７４７等）や、その他のＰ２Ｙ１２受容体競合型抗血栓薬に対する反応性の予測に使用できる。
【００７６】
本発明に係る血小板凝集能の亢進に係る疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、さらに、血小板凝集能の亢進に係る疾患の予防および／または治療剤の選択方法、および該予防および／または治療剤の用量を決定する方法を実施できる。本遺伝子変異の検出方法により、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ２ハプロタイプであると判定された場合、抗血栓薬に対し低感受性であると判定できるため、抗血栓薬の用量を増加する等の調節を行うことができる。あるいは、低感受性であると考えられる抗血栓薬を選択せずに他の抗血栓薬を選択することができる。
【００７７】
本発明は、ゲノム塩基配列第１５２３８１６７３位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００７８】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３８０１８８位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３８０１８８位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００７９】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３７９３５０位がチミン（Ｔ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドの組合せ、または配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドの組み合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該該領域に含まれる標的位置の塩基のタイピングに用いるタイピング用プライマーとして配列番号４１に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３７９３５０位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００８０】
本発明はまた、ゲノム塩基配列第１５２３７８０８４位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドの組合せを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３７８０８４位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【００８１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体的な塩基配列に関わる情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得できる。
【００８２】
プローブやプライマーは、本発明に係る１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製することができる。
【００８３】
上記ポリヌクレオチド、上記プロ−ブおよび上記プライマーは、いずれも試薬として使用できる。また、これらの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、１塩基変異検出用の標識物質、緩衝液、並びに塩等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬および試薬キットは、本発明に係る検出方法および検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【００８４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。本実施例においてＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【実施例１】
【００８５】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の解析）
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン１上流３ｋｂの地点からエキソン２の５´側約１５０ｂｐについて（全長約５ｋｂ）、ゲノム配列の解析により変異の検出を行なった。試料は１４１例の日本人健常人から供与を受けたゲノムＤＮＡを用いた。
【００８６】
まず、２０例のゲノムＤＮＡを用い、ゲノムＤＮＡからＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシークエンス法を用いて決定することにより変異の検出を実施した。
【００８７】
標的領域の増幅はＰＣＲにより行なった。標的領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたゲノム塩基配列を参照配列として、該ゲノム塩基配列に含まれるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の４箇所に設定し、ＰＣＲ用プライマーは、該塩基配列に基づいて設計し作製した（表４）。ゲノムＤＮＡ試料２μｌを鋳型として、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）またはＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、２０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、各標的領域により異なる反応条件を用いた（表５）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
【表５】
【００９０】
ＰＣＲ反応条件Ａ
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ６２℃ ３０秒間
４） ７２℃ ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ １０分間
【００９１】
ＰＣＲ反応条件Ｂ
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ５８℃ ３０秒間
４） ７２℃ ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ １０分間
【００９２】
ＰＣＲ増幅産物をエキソサップ（Ｅｘｏ ＳＡＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製し、シークエンス反応の鋳型として用いた。シークエンス反応は表６に示したプライマーおよびダイナミックＥＴダイターミネーターキット（ＤｙＥｎａｍｉｃ ＥＴ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。反応産物はセファデックス−５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−５０）を用いてゲルろ過法により精製した。シークエンサーは、メガベース１０００（ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【００９３】
得られた配列データを用いて、フレッド／フラップ／ポリフレッド（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ）ソフトウエアにより各塩基の精度（クオリティー値）の算出、アセンブルおよび変異の検出を行った。標準塩基配列および塩基位置として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列および塩基位置を使用した。
【００９４】
【表６】
【００９５】
塩基配列解析の結果、表７に示す４種類の１塩基変異がＨ２ハプロタイプと完全に連鎖していることが明らかになった。表７に示す４種類の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、既知１塩基変異（表１）のうち、イントロン１に存在する３種類の１塩基変異が全て認められた。
【００９６】
【表７】
【００９７】
また、塩基配列解析の結果、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していると報告されている既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する例を見出した。すなわち、エキソン２に存在するこの１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと完全に連鎖していないと考える。この例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（表
７）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。
【００９８】
このことから、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【００９９】
Ｈ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプと連鎖するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を表８にまとめて示す。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
表８において、＃１、＃２、＃３および＃７に示した１塩基変異は、本発明においてＨ２ハプロタイプと完全に連鎖することを明らかにした１塩基変異である。＃４、＃５および＃６に示した１塩基変異は、既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）である。＃８に示した１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと連鎖すると報告されている１塩基変異である（特許文献１、非特許文献３および特許文献４）が、日本人においてはこの１塩基変異が認められない数例を見出した。既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。
【０１０２】
（第１５２３７９３５０位の塩基および第１５２３７７５０７位の塩基の解析）
次に、１２１例の健常人のゲノムＤＮＡを用い、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異、およびＨ２ハプロタイプとの連鎖が完全ではないと判明した第１５２３７７５０７位の１塩基変異について解析した。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異として、第１５２３７９３５０位の１塩基変異を解析した。第１５２３７９３５０位の１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプであることから、第１５２３７９３５０位の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖する他の１塩基変異（第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７８０８４位の１塩基変異等）も存在する。
【０１０３】
これら２種類の１塩基変異の検出は、各ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の検出を標的位置の塩基を含むＤＮＡ断片を用いて、ＳＮｕＰｅ反応により行った。ＰＣＲは、各ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲプライマーを用いて行った。ＰＣＲプライマーは、第１５２３７９３５０位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。また、第１５２３７７５０７位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。具体的には、各鋳型２μｌを使用し、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いて１０μｌの反応系でＰＣＲを行った。なおポジティブコントロールは１０ｎｇ／μｌに調製したヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を使用し、ネガティブコントロールには鋳型を加えずにＰＣＲを行った。
【０１０４】
ＰＣＲ反応条件は以下に示す。
１） ９４℃ ４分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ５４℃ ３０秒間
４） ７２℃ ４５秒間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５） ７２℃ ４分間
【０１０５】
ＰＣＲ増幅産物は４℃で冷却後、セファデックス Ｇ５０ ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製し、ＳＮｕＰｅ反応に使用した。
【０１０６】
ＳＮｕＰｅ反応は、各１塩基変異が存在する位置の直前に設計したＳＮｕＰｅプライマー、鋳型である精製ＰＣＲ増幅産物およびメガベース ＳＮｕＰｅ遺伝子タイピングキット（ＭｅｇａＢＡＣＥ ＳＮｕＰｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、キットの添付資料に記載の方法に従って実施した。第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位の塩基のタイピング用ＳＮｕＰｅプライマーとしてそれぞれ表９に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。なお、配列番号４２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子ゲノム塩基配列の第１５２３７７５３２位から第１５２３７７５０８位までの２５ヌクレオチドからなる塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチドであるが、第１５２３７７５１９位のヌクレオチドを含まない２４ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
タイピング解析は９６ウエルプレートフォーマットのキャピラリーシークエンサー メガベース１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、データ解析ソフトであるＳＮＰプロファイラーを用いてタイピングを行った。
【０１０９】
検討した１４１例（上記ダイレクトシークエンス法で解析した２０例を含む）において、Ｈ１ハプロタイプのホモ接合体は９４例であった。また、Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体、Ｈ１／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体およびＨ２／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体はそれぞれ、４２例、４例および１例であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明によれば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプの特定ができ、その結果、該遺伝子のＨ２ハプロタイプと関連する易血栓性を検出することができる。さらに、本発明によれば、血栓性疾患、例えばアテローム性血栓症、具体的には心筋梗塞、脳卒中および末梢動脈疾患等の罹患危険率の判定および早期診断の実施が可能になる。本発明は、血栓性疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用であり、医薬分野において多大に寄与するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５０：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５１：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５２：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５３：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５４：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５４：（３０）：（３０）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５４：（６８）：（６８）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５５：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５５：（１）：（６）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号５６：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項２】
１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位または第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、請求項１に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項３】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項４】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項５】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項６】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項７】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７９３５０位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項８】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８１６７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項９】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８０１８８位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１０】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７８０８４位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１１】
請求項３から１０のいずれか１項に記載の１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする請求項１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法。
【請求項１２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１５】
配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１７】
血栓性疾患がアテローム性血栓症である請求項１６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１８】
血栓性疾患が末梢動脈疾患である請求項１６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１９】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法。
【請求項２０】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット。
【請求項２２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項２３】
１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位、第１５２５４１９７７位、第１５２５４１１３９位または第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、請求項２２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項２４】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２５】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２６】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２７】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２８】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項２９】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４３４６２位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３０】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１９７７位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３１】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９８７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３２】
請求項２４から３１のいずれか１項に記載の１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする請求項２２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法。
【請求項３３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３６】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３７】
血栓性疾患がアテローム性血栓症である請求項３６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３８】
血栓性疾患が末梢動脈疾患である請求項３６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３９】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法。
【請求項４０】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法。
【請求項４１】
請求項３４に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに請求項１５または３５に記載のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット。
【請求項１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項２】
１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７９３５０位または第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、請求項１に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項３】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項４】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項５】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項６】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項７】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７９３５０位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７９３５０位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項８】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８１６７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８１６７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項９】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３８０１８８位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３８０１８８位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１０】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２３７８０８４位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２３７８０８４位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１１】
請求項３から１０のいずれか１項に記載の１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする請求項１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法。
【請求項１２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がチミンである；
（４）第１５２３７８０８４位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項１５】
配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１７】
血栓性疾患がアテローム性血栓症である請求項１６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１８】
血栓性疾患が末梢動脈疾患である請求項１６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１９】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法。
【請求項２０】
請求項１、２または１１に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット。
【請求項２２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出することを手段とする、血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項２３】
１塩基変異の検出を、（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位、第１５２５４１９７７位、第１５２５４１１３９位または第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、（ｉｉ）得られたＰＣＲ産物の配列をシーケンス法で決定すること、または、得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定することにより行う、請求項２２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項２４】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２５】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２６】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２７】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号３９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシーケンス法により決定する工程。
【請求項２８】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１１３９位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項２９】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４３４６２位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４３４６２位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４３４６２位に相当する位置の塩基を、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３０】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５４１９７７位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５４１９７７位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１９７７位に相当する位置の塩基を、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３１】
下記工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、第１５２５３９８７３位の塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２５３９８７３位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９８７３位に相当する位置の塩基を、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項３２】
請求項２４から３１のいずれか１項に記載の１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする請求項２２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法。
【請求項３３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；および
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれる１つまたは２つ以上の１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的な核酸プローブ：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において下記（１）から（４）より選ばれるいずれか１の１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個の塩基からなるポリヌクレオチド：
（１）第１５２５４３４６２位の塩基がシトシンである；
（２）第１５２５４１９７７位の塩基がシトシンである；
（３）第１５２５４１１３９位の塩基がチミンである；
（４）第１５２５３９８７３位の塩基がシトシンである
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列における位置として定義する）。
【請求項３６】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３７】
血栓性疾患がアテローム性血栓症である請求項３６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３８】
血栓性疾患が末梢動脈疾患である請求項３６に記載の血栓性疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項３９】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤を選択する方法。
【請求項４０】
請求項２２、２３または３２に記載の血栓性疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血栓性疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法。
【請求項４１】
請求項３４に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに請求項１５または３５に記載のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を含む試薬キット。
【公開番号】特開２００６−１８０８７６（Ｐ２００６−１８０８７６Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４９３０２（Ｐ２００５−３４９３０２）
【出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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