ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体酵素
【課題】エイズウイルスのコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ５を分解して、その機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素、およびそれを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供する。
【解決手段】ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行ない、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、最終的に触媒三つ組残基構造を有するモノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖の可変領域がＣＣＲ５の抗体酵素として機能するということを見出した。
【解決手段】ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行ない、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、最終的に触媒三つ組残基構造を有するモノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖の可変領域がＣＣＲ５の抗体酵素として機能するということを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ（acquired immunodeficiency syndrome）は、その原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス型（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）の感染によって免疫機能が低下し、それに伴って日和見感染症や悪性腫瘍、神経症状、痴呆などを合併した病態である。ＨＩＶに感染すると、急性期、無昇症候期、エイズ関連症候群を経てエイズへと進展する。ＨＩＶ関連の研究や治療法などの進歩によって、エイズは不治の病から治療可能な病気になりつつあるが、現段階では確実な抗ＨＩＶ薬剤はなく、薬物による治療法も確立できていないのが現状である。
【０００３】
ＨＩＶの感染機構に関する研究において、１９８４年にＨＩＶのレセプターとしてＣＤ４が同定された。ＨＩＶの感染は、ウイルス粒子表面のエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）が、ヒトの細胞表面に発現しているＣＤ４分子に結合することから始まる。
【０００４】
しかし、ＣＤ４のみではウイルスの外皮と宿主細胞の細胞膜との融合は起こらず、ＨＩＶの感染は成立しないため、ＣＤ４分子以外のヒト細胞膜成分が、ウイルス侵入のために補助因子として働く可能性が考えられ、コレセプター（セカンドレセプター）の存在が示唆されていた。そして、ＣＤ４の発見から１０年以上経過した後に、ＨＩＶのコレセプターの一つとして、ケモカインレセプターＣＣＲ５が発見された（非特許文献１参照）。
【０００５】
ＨＩＶ感染の第一のステップは、血液中や粘膜下に存在するヘルパーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞への吸着および侵入である。そして上記のＨＩＶの細胞内侵入は、ウイルスのエンベロープタンパク質と標的(宿主)細胞の膜タンパク質との多段階反応によって引き起こされる。上記ＨＩＶの標的細胞内への侵入の詳細は、以下に示すとおりである。まずＨＩＶ粒子表面のエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）が、標的細胞表面のＣＤ４へ結合する。このｇｐ１２０のＣＤ４ヘの結合によって、ｇｐ１２０に構造(コンフォメーション)変化が起こり、それまでマスクされた状態にあったｇｐ１２０のＶ３ループ領域が解放され、標的細胞表面上のコレセプター（ＣＣＲ５等）に結合する。この際、Ｖ３ループ領域とコレセプターとの相互作用には、コレセプターのアミノ末端領域（Ｎ末端領域）をはじめとする、いくつかの細胞外領域が関与していると考えられている。このＶ３ループ領域とコレセプターとの相互作用は、さらにＨＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通タンパク質ｇｐ４１の細胞外ドメインの構造変化を引き起こし、それによってｇｐ４１の疎水性の高いＮ末端部分が標的細胞膜表面の脂質二重層へ挿入され、これが引き金となって、ウイルス表面膜と標的細胞膜との間で膜融合が起こり、ウイルスが細胞内に侵入するものと考えられている（非特許文献２参照）。
【０００６】
その後の研究によって、標的細胞においてケモカインレセプターＣＣＲ５が正常でない場合は、ＨＩＶの感染および発症に抵抗性を示すことが報告されている（非特許文献３参照）。そのため、現在、多くの研究者や企業が、このコレセプターを標的とし、ＨＩＶの侵入を阻害する薬剤の開発に乗り出している。このようなＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発の現状に関しては、例えば以下に示す非特許文献４に記載されている。非特許文献４には、ケモカインレセプターＣＣＲ５を標的としてＨＩＶの感染を予防できる抗ＨＩＶ薬剤の候補として、ケモカインレセプターのアンタゴニストが報告されている。
【０００７】
しかしながら、これまで研究が進められている抗ＨＩＶ薬剤候補は上記のごとく、ケモカインレセプターＣＣＲ５のアンタゴニストであり、ケモカインレセプターＣＣＲ５を直接攻撃して、その機能を消失させることのできる有効な薬剤は全く提案されていなかった。そこで本発明者らは、ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解して、その機能を消失させることができ、ＨＩＶの感染予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素の開発を開始した。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ５の細胞外領域を構成するペプチド、ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ（配列番号１３）、または、ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳ（配列番号１４）を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から、ケモカインレセプターＣＣＲ５の細胞外領域を分解し得る抗体酵素を見出した（特許文献１参照）。
【非特許文献１】Samson,M., Libert,F.,Doranz,B,J.,et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene.(1996)Nature.382:722-725.
【非特許文献２】Lee,B.,Sharron,M.,Blanpain,C.,et al. Epitope Mapping or CCR5 Reveals Multiple Conformational States and Distinct but Overlapping Structures Involved in Chemokine and Coreceptor Function.(1999)J.Biol.Chem.274:9617-9626
【非特許文献３】「ケンモカインハンドブック」義江修 野見山尚行 宮坂昌之 監修（秀潤社）、２００年１１月２０日発行
【非特許文献４】村上務、山本直樹著：タンパク質 核酸 酵素、Vol.４３、677-685頁（1998年）、「新しい抗ＨＩＶ薬剤の開発−ＨＩＶのコレセプター（セカンドレセプター）に作用する薬剤」
【特許文献１】特開２００４−３１３１６６号公報（公開日：平成１６年（２００４）１１月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、既述のごとく、ＨＩＶの侵入に重要なステップである、Ｖ３ループ領域とコレセプターとの結合には、コレセプターのアミノ末端領域（Ｎ末端領域）をはじめとする、いくつかの細胞外領域が関与していると考えられており、特許文献１に記載された抗体酵素だけではＨＩＶの感染予防および阻止を十分に行なうことができない場合があると考えられた。
【０００９】
またＣＣＲ５分子のＮ末端領域が、ＨＩＶエンベロープタンパク質とＣＣＲ５との結合に重要であることも報告されている（非特許文献３参照）。
【００１０】
そこで本発明は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を標的とし、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素を提供することを目的とした。さらに本発明は、上記抗体酵素をコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、およびそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体酵素を得るべく鋭意検討を行なった。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解し得る抗体酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかる抗体酵素は、ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体または抗体断片であり、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、かつ、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解する活性を有することを特徴としている。
【００１３】
ここで、上記「抗体断片」とは、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のペプチドを抗原とする抗体を構成する各ペプチド鎖、さらにはこの各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片を意味する。また上記「抗体酵素」とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンである。なお、上記抗体酵素は、完全な抗体分子に限定されるものではなく、抗原に特異的に結合することができ、かつ酵素活性を有する抗体フラグメント（例えば、軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、など）でもよい。また、酵素活性は特に限定されるものではないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。
【００１４】
特に、上記抗体酵素の中でも、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれている。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（Super Catalytic Antibody [I] : Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88(3), 323-327 (1999)参照）。本発明にかかる抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のペプチドを抗原とする抗体であり、当該ＣＣＲ５を完全分解し得るものと推察されるため、「スーパー抗体酵素」に含まれる。
【００１５】
上記本発明にかかる抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域の抗体としての性質を色濃く残した状態で、その抗原であるケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を分解するという性質を持っている。そのため、上記抗体酵素は特異性が高く、ケモカインレセプターＣＣＲ５のみを特異的に分解することができる。このケモカインレセプターＣＣＲ５、特にそのＮ末端領域は、既述の通りＨＩＶの感染において重要な役割を果すため、それを消失させることができる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００１６】
また本発明にかかる抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端に対する抗体の可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成する重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合に、その活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、上記抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有することができる。
【００１７】
また、上記本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。ここで上記「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことを言う。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基との距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは、３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。
【００１８】
本発明にかかる抗体酵素として、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列おいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１９】
この配列番号１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体「５Ａ２」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この５Ａ２のＬ鎖の可変領域は、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２０】
また本発明にかかる抗体酵素の他の例として、配列番号５に示すアミノ酸配列、または、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２１】
この配列番号５に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体「６Ａ２」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この６Ａ２のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２２】
さらに本発明にかかる抗体酵素の他の例として、配列番号９に示すアミノ酸配列、または、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２３】
この配列番号９に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体「２Ｂ８」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この２Ｂ８のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２４】
上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１、５、９のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１、５、９のいずれかに示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２５】
本発明にかかる抗体酵素は、ＨＩＶの感染において重要な役割を果すケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解してその機能を消失させるため、ＨＩＶの感染を阻害する抗ＨＩＶ薬剤として使用することもできる。すなわち、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含むことを特徴とするものである。
【００２６】
上記本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶの感染を阻害することができる。また、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶ感染患者に対してエイズの発症を遅らせたり、病気の進行を阻止したりすることも可能である。すなわち、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶ感染患者に対する治療薬としても機能し得る。
【００２７】
なお上記本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、上記本発明にかかる抗体酵素のみを含み、それを静脈注射などによって直接投与して使用することもできるが、上記抗体酵素に加えて、薬理学的に許容される担体がさらに含まれるものであってもよい。このような抗ＨＩＶ薬剤の製造は、従来公知の製造方法によって行なうことができる。この抗ＨＩＶ薬剤は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のみを特異的に分解するため、抗ＨＩＶ効果が顕著であるというだけでなく、副作用が少ないということも期待できる。
【００２８】
また本発明には、上記本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入すれば、本発明にかかる抗体酵素をその宿主内で発現させることができる。
【００２９】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３０】
本発明にかかる遺伝子として、具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３１】
また本発明にかかる遺伝子の他の例として、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号６に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体の６Ａ２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３２】
さらに本発明にかかる遺伝子の他の例として、配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３３】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内で発現させることができ、当該抗体酵素の製造に利用することができる。また、上記形質転換体は、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内に蓄積しているため、当該形質転換体自身もＨＩＶ感染を予防する抗ＨＩＶ薬剤や、エイズ治療のための抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【発明の効果】
【００３４】
上記本発明にかかる抗体酵素は、ＨＩＶ感染において重要な役割を果すケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターを分解することが可能であるため、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００３５】
それゆえ、本発明は、ＨＩＶの感染の予防、およびエイズ治療に寄与することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３７】
（１）本発明にかかる抗体酵素、および遺伝子について
ここでは、本発明にかかる抗体酵素の一例として、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体「５Ａ２」、「６Ａ２」および「２Ｂ８」の抗体断片を例に挙げて説明する。なお、以下の説明において、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体５Ａ２」のことを「５Ａ２」と、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体６Ａ２」のことを「６Ａ２」と、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体２Ｂ８」のことを「２Ｂ２」と称する。
【００３８】
上記５Ａ２、６Ａ２および２Ｂ２の抗体断片は、より具体的には、５Ａ２の軽鎖の可変領域（以下「５Ａ２Ｌｖ」という）、６Ａ２の軽鎖の可変領域（以下「６Ａ２Ｌｖ」という）、および２Ｂ８の軽鎖の可変領域（以下「２Ｂ８Ｌｖ」という）である。
【００３９】
上記３つの抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲＬＬ：配列番号１５）を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として見出されたものである。
【００４０】
本発明にかかる抗体酵素５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、および２Ｂ８Ｌｖは、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解酵素として作用する。このことは、後述の実施例において示された結果からも明らかである。
【００４１】
ここで、ケモカインレセプターＣＣＲ５（以下、「ＣＣＲ５」という）について、簡単に説明する。
【００４２】
ＣＣＲ５は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであり、ＨＩＶエンベロープにコンフォメーション変化をもたらし、ウイルスと宿主細胞との膜融合を導くと考えられることから、ＨＩＶがヒトに感染する際の重要な要素である。欠損変異型ＣＣＲ５遺伝子を持つヒトは、ＨＩＶの感染・発症に抵抗性を示すということが知られている。
【００４３】
また、ＣＣＲ５は、ヒトからヒトへの感染に関与するＨＩＶのマクロファージ指向性株の感染においてコレセプターとして用いられる唯一のものである。このことから、ＣＣＲ５の機能を抑制させることがＨＩＶ感染の予防、エイズ進行の阻止につながると期待される。
【００４４】
上述の３つの抗体酵素は、このＣＣＲ５、特にＣＣＲ５のＮ末端領域と特的に結合し、ＣＣＲ５を分解し、ＣＣＲ５の機能を消失させることができる。欠損変異型ＣＣＲ５遺伝子を持つヒトには、明らかな免疫不全や組織病変はなく、健康上何ら問題は見られないことから、ＣＣＲ５の機能を消失させる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００４５】
ここで、ＣＣＲ５の「Ｎ末端領域」とは、ＣＣＲ５の細胞外領域の一つであって、ＨＩＶエンベロープタンパク質とＣＣＲ５との結合に重要であることが知られている。かかるＮ末端領域は、ＣＣＲ５のアミノ酸配列のＮ末端から３０位までの領域のことをいう。なおヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸、塩基配列情報は、公知のデータベース等から入手可能である。例えば、ヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８に示す。
【００４６】
次に、上記５Ａ２Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。５Ａ２Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（「Ｎ末端ペプチド」という）を免疫原とするモノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖の可変領域であり、配列番号１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４７】
図１には、軽鎖と重鎖からなる５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図１に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、第３９番目のヒスチジン（図１では「Ｈｉｓ３９」と記す）、第５７番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ５７」と記す）、第７５番目のアスパラギン酸（図１では「Ａｓｐ７５」と記す）、第９４番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ９４」と記す）、第９６番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ９６」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。また図２に示すように、第１番目のアスパラギン酸（図２では「Ａｓｐ１」と記す）、第９６番目のセリン（図２では「Ｓｅｒ９６」と記す）、および第９８番目のヒスチジン（図２では「Ｈｉｓ９８」と記す）も触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４８】
また、本発明にかかる抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記５Ａ２Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側に５Ａ２のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４９】
なお、５Ａ２の重鎖の可変領域（以下「５Ａ２Ｈｖ」という）は、配列番号３に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この５Ａ２Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この５Ａ２Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号４に示す。
【００５０】
次に、上記６Ａ２Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。６Ａ２Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖の可変領域であり、配列番号５に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５１】
図３には、軽鎖と重鎖からなる６Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図３に示すように、配列番号５に示すアミノ酸配列において、第７番目のセリン（図３では「Ｓｅｒ７」と記す）、第７０番目のアスパラギン酸（図３では「Ａｓｐ７０」と記す）、第８５番目のアスパラギン酸（図３では「Ａｓｐ８５」と記す）、および第８番目のヒスチジン（図３では「Ｈｉｓ８」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００５２】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記６Ａ２Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列のＣ末端側に６Ａ２のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５３】
なお、６Ａ２の重鎖の可変領域（以下「６Ａ２Ｈｖ」という）は、配列番号７に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この６Ａ２Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この６Ａ２Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号８に示す。
【００５４】
次に、上記２Ｂ８Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。２Ｂ８Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖の可変領域であり、配列番号９に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５５】
図４には、軽鎖と重鎖からなる２Ｂ８の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図４に示すように、配列番号９に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図４では「Ａｓｐ１」と記す）、第２８番目のセリン（図４では「Ｓｅｒ２８」と記す）、第３１番目のアスパラギン酸（図４では「Ａｓｐ３１」と記す）、第９８番目のヒスチジン（図４では「Ｈｉｓ９８」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００５６】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記２Ｂ８Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列のＣ末端側に２Ｂ８のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５７】
なお、２Ｂ８の重鎖の可変領域（以下「２Ｂ８Ｈｖ」という）は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この２Ｂ８Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この２Ｂ８Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１２に示す。
【００５８】
本発明にかかる遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるもの、配列番号６に示す塩基配列からなるもの、または配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ａ２Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子は、６Ａ２Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子は、２Ｂ８Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つである。なお上記遺伝子は、配列番号２、６、または１０に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、本発明にかかる抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。
【００５９】
（２）本発明にかかる抗体酵素の取得方法について
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（Ｎ末端ペプチド）を免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。例えば、本発明にかかる抗体酵素が、５Ａ２の軽鎖全長や、６Ａ２の軽鎖全長、または２Ｂ８の軽鎖全長などのように、ＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体の軽鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を取得し、その軽鎖を分離して取得すればよい。また、本発明にかかる抗体酵素が、ＣＣＲ５の抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。また、ファージディスプレイ法で得られる抗体であって良い。なおモノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)参照）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)参照）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)参照）等により行なうことが可能である。
【００６０】
ところで、上記３つの抗体酵素（５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、および２Ｂ８Ｌｖ）を取得する際には、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するペプチドが免疫原として用いられているが、本発明にかかる抗体酵素を取得する方法はこれに限定されるものではなく、配列番号１５と異なるアミノ酸配列を有するペプチドが免疫原として用いられてもよい。すなわち、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチドであれば、いずれのアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。またそのペプチドのアミノ酸残基数については、免疫原性を有する数であれば特に限定されるものではないが、例えば、５アミノ酸以上４０アミノ酸以下であることが好ましく、７アミノ酸以上３５アミノ酸以下であることが最も好ましい。上記の観点から、本発明にかかる抗体酵素を取得する際に免疫原として用いるペプチドは、例えば、配列番号１８に示されるヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸配列の第１位から第３５位のアミノ酸配列の内、少なくとも１０アミノ酸以上連続する領域を含むペプチドを挙げることができる。また、上記免疫原として用いられるペプチドには、免疫応答を向上させるために２〜３のアミノ酸を付加してもよいし、通常低分子ペプチドの免疫応答を向上するために用いられる「他のタンパク質」を結合させてもよい。上記「他のタンパク質」は特に限定されるものではないが、例えば、Human IgG、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）等を挙げることができる。なお、上記免疫原として用いられるペプチドは、従来公知のアミノ酸合成器を用いて取得してもよいし、遺伝子工学的手法を用いて取得してもよい。
【００６１】
また、上述の５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、２Ｂ８Ｌｖなどのように、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子配列が明らかとなっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術などを用いて取得することができる。この場合、上記抗体酵素をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で発現したペプチドを精製するという方法などを採用することができる。なお、宿主において目的のタンパク質を大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく取得できるために、好ましい。
【００６２】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００６３】
また、本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、モノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行ない、該当する領域を増幅させることで本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２、６、または１０に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１、５、または９に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が発現産物としてそれぞれ得られる。
【００６４】
（３）本発明にかかる抗体酵素の利用方法について
これまでに、ＣＣＲ５の働きを抑制する作用をもつ抗ＨＩＶ薬剤は開発されてきたが、本発明にかかる抗体酵素は、これらの抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ＣＣＲ５を直接攻撃してそのコレセプターとしての機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００６５】
上記抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ５のＮ末端領域を酵素的に完全に分解してそのコレセプターとしての機能を消失させるという、新しい作用機構でＨＩＶの感染を阻害したり、エイズの発症を抑制したりすることができる。そして、このような抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ５を特異的に分解するため、顕著な抗ＨＩＶ効果を期待できるととともに、副作用も少ないものと考えられる。また、上記抗体酵素の反応機構から考えると、現在使用されている他の抗ＨＩＶ薬剤と併用することによって、エイズに対する治療効果がより向上することが期待できる。
【００６６】
上記本発明にかかる抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、本発明にかかる抗体酵素のみによって構成してもよいが、薬理学的に許容される担体などと混合して構成してもよい。医薬組成物の製造法として公知の手段に従って、上記抗ＨＩＶ薬剤を製造することができる。
【００６７】
ここで、薬理学的に許容される担体には、製剤素材として使用可能な各種有機または無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。
【００６８】
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００６９】
また、上記結合剤としては、例えばα化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００７０】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００７１】
上記溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
【００７２】
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００７３】
上記懸濁剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。
【００７４】
上記等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００７５】
上記無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００７６】
上記防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００７７】
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００７８】
上記抗ＨＩＶ薬剤における抗体酵素の含量は、特に限定されるものではなく、投与方法に応じて適宜最適量を検討の上、採用すればよい。
【００７９】
上記抗ＨＩＶ薬剤は、製剤技術分野において慣用の方法により製造することができる。抗ＨＩＶ薬剤の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等の非経口剤が挙げられ、これらは毒性も低く、それぞれ経口的または非経口的に投与できる。
【００８０】
本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによっても異なる。したがって、上記投与量は、最適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。
【００８１】
さらに、本発明にかかる抗体酵素は、それをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、本発明にかかる形質転換体は、上記抗体酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、遺伝子が対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。この形質転換体は、自身の体内で上記抗体酵素を発現させることができる。
【００８２】
本発明にかかる形質転換体としてより具体的には、配列番号２、６、または１０に示される塩基配列からなる遺伝子が、宿主細胞に導入されたものを挙げることができる。上記宿主細胞としては、大腸菌、酵母、バキュロウイルスなど、通常使用しているもの適宜用いることができる。
【００８３】
上記形質転換体は、自身の体内でＣＣＲ５を特異的に認識して完全に分解し、その機能を消失させることができるため、抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。また、上記抗体酵素を大量発現できるような形質転換体であれば、ＨＩＶの感染の予防や、エイズの症状の治療を効率よく行なうことができると考えられ、より有効な抗ＨＩＶ薬剤を得ることができる可能性がある。
【００８４】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８５】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
（１.モノクローナル抗体の作製法）
＜免疫＞
ＣＣＲ５のＮ末端領域ペプチド（以下「ＮＣ５ペプチド」；ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲＬＬ；配列番号１５）とＫＬＨ（Pierce, USA）とのconjugateの作製を以下の通りに行なった。ＮＣ５ペプチドは、Peptide & Protein Research Cons. Devon, UK.から購入された。
【００８７】
ＫＬＨ（１０ｍｇ/ｍｌ）に対して架橋試薬ＭＢＳ（m-maleimido-benzoyl-N-hydrosuccinimide、入手先：Peerce,IL,USA）を０．６３ｍｇを撹拌しながら添加し、そのまま１時間反応させた。カラム（Sephadex G-25、Parmacia社製）により未反応のＭＢＳを除去した後、ＮＣ５ペプチド(２ｍｇ)とＫＬＨ（２ｍｇ）とを５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）中で反応させた。この時、ＫＬＨはＮＣ５ペプチドのアミノ酸配列中のシステインと反応し、conjigateとなる。これを免疫用抗原として用い、Balb/cマウス（雌 ６週齢）に以下のようにして免疫を行なった。
【００８８】
上記conjugateをクリーンベンチ内でＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant；三菱ヤトロン社、コードRM606-1）と混合し、マウスフットパッドに１００μｌずつ、計３回免疫した。
【００８９】
抗体価の上昇の確認は、マウス眼窩静脈叢より採血を行ない、通常のＥＬＩＳＡ法でＮＣ５ペプチドに対する抗体価の測定をすることにより行なった。ＥＬＩＳＡ法は以下のようにした。ＮＣ５ペプチドをＰＢＳにて５μｇ／ｍｌになるように調製した。上記ＮＣ５ペプチドを９６穴ウェルプレートに５０μｌ注入した。上記ウェルプレートを４℃、一晩で静置後、０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（「ＰＢＳ−Ｔ」）でプレートを３回洗浄した。ウェルプレートの全ウェルに２％ゼラチンを含むＰＢＳを１５０μｌずつ加えた。上記ウェルプレートを室温で１時間静置して、ブロッキングを行なった。採取した血清をＰＢＳで１／１００希釈し、１／１００から４倍連続希釈を７回繰り返し、１サンプルにつき抗血清希釈液を８種類用意した。また陰性対照として、未免疫マウスの血清も同様にして試験に用いた。ブロッキング後の各ウェルに、連続希釈した血清を５０μｌずつ加え、室温で１時間、静置した（一次反応）。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで1/1000希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（ＩＣＮ社 コード６７４２９）を各ウェルに５０μｌずつ加えた。室温で１時間、静置を行なった（二次反応）。ウェルプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢ基質（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine、入手先：ＫＰＬ,Gaithersburg, MD, USA）を各ウェルに１００μｌずつ加え、３０分間静置後にプレートリーダー（波長４５０ｎｍ）で吸光度を測定した。
【００９０】
＜細胞融合＞
抗体価が上昇したマウスから脾臓を摘出し、マウスリンパ節細胞（１×１０８個）とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１；２×１０7個）との細胞融合を行なった。上記細胞融合の方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、和光純薬工業株式会社 コード162-09115）を使って行なう通常の方法で行なった。その後、ＨＡＴ選択、スクリーニング、およびクローニングを繰り返し、表１に示す８個の抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞を確立した。
【００９１】
確立したモノクローナル抗体のアイソタイプの決定を、アイソタイピングキット（Iso StripTMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Roche 1493027)）を用いて行なった。その方法は、添付のマニュアルに準じて行なった。その結果を表１に示した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
＜ＮＣ５ペプチド以外のペプチドおよびタンパク質との交差反応性試験＞
上記で得られた抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞のうちの５クローン（５Ａ２株、６Ａ２株、２Ｂ８株、３Ｆ４株、および４Ｈ６株）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。ペプチドおよびタンパク質には、ＮＣ５ペプチド、Keyhole Lympet Hemocyanine（図１５および図１６では「ＫＬＨ」と表記する）、ヒト血清アルブミン（図１５および図１６では「ＨＳＡ」と表記する）、ウシ血清アルブミン（図１５および図１６では「ＢＳＡ」と表記する）、ヒト-γ-グロブリン（図１５および図１６では「Human-γ-globlin」と表記する）、ヒトヘモグロビン（図１５および図１６では「Human-hemoglobin」と表記する）、TP41-1 peptide（ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ：21mer：配列番号１６、図１５および図１６では「TP41-1」と表記する）、RT-1 peptide（ＫＬＬＲＧＴＫＡＬＴＦＶＩＰＬＴＥＥＡＥ：配列番号１７、図１５および図１６では「RT-1」と表記する、）を用いた。なお上記RT-1 peptideは、エイズウイルスの逆転写酵素の部分ペプチドである。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ法は以下のようにして行なった。上記ペプチドおよびタンパク質がそれぞれＰＢＳで５μｇ／ｍｌとなるようにサンプルを調製し、９６穴のウェルプレートに２００μｌずつ入れ、コーティングを行なった。またペプチドおよびタンパク質をコートせずにＥＬＩＳＡ法を行なった場合を陰性対照とした（図１５および図１６では「（−）」と表記する）。細胞の培養上清はＰＢＳ−Ｔで１／２希釈し、一次反応に用いた。２次抗体として、AP-F(ab’)2 Rabbit anti Mouse IgGAM(H+L)、（入手先：Zymed 61-6322 Lot.11167841R）を５００倍希釈して用いた。その他の操作は、既述のＥＬＩＳＡ法に準じて行なった。
【００９５】
その結果を図１５および１６に示す。図１５には、５Ａ２株（同図中「５Ａ２」で示す）、６Ａ２株（同図中「６Ａ２」で示す）、および陰性対照として各モノクローナル抗体の培養に用いた培養前の培地（同図中「陰性対照（培地）」で示す）について、交差反応性試験を行なった結果を示した。また図１６には、２Ｂ８株（同図中「２Ｂ８」で示す）、３Ｆ４株（同図中「３Ｆ４」で示す）、および４Ｈ６株（同図中「４Ｈ６」で示す）について交差反応性試験を行なった結果を示した。上記の交差反応性試験の結果、ＮＣ５ペプチド以外の基質に対して非特異的な結合が若干観察されたが、抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞によって産生されるいずれのモノクローナル抗体もＮＣ５ペプチドに対して高い特異性を有しているということがわかった。
【００９６】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞の培養＞
抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｉ−２５１０）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５．５％の条件で、１〜５×１０７cellsが得られるまで培養された。上記培養によって得られた細胞を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離して、当該細胞を回収した。培養培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳで上記細胞を懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離を行なった。上清をアスピレーターにて吸引除去後、再度１０ｍｌのＰＢＳで懸濁した後、血球計算盤を使用して細胞数をカウントした。
【００９７】
カウント後、１〜５×１０７cells分の細胞懸濁液を取り、１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離を再度行ない、上清を除去した。さらに、ペーパータオル上で逆さにし、完全にＰＢＳを除去した。この時アスピレートが不十分であれば、再度遠心分離を行ない、マイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【００９８】
＜ｍＲＮＡの抽出と精製＞
ｍＲＮＡの抽出は、QuickPrepTM mRNA purirfcation Kit（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製）を用い、上記キットの推奨プロトコールに準じて行なった。以下にその方法を示す。
【００９９】
ｍＲＮＡの抽出は、予め３７℃のインキュベーターに３０分間ほど静置して結晶を完全に溶解させた１．５ｍｌのExtraction bufferを、上記にて回収した細胞（ペレット）に添加し、２１Ｇの注射針に数回通すことによって、細胞を破砕した。その細胞破砕溶液に、３ｍｌのElution bufferを加え、更に細胞を破砕した。得られた細胞破砕溶液を、RNease freeの１．５ｍｌ容マイクロチューブ４本に分注し、室温（２５℃）、１８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行なって、oligo(dT)-cellulose spin columnに供するサンプルを調製した。
【０１００】
ｍＲＮＡの単離は、まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌ容 遠心チューブにセットし、１,３００ｒｐｍで２分間（樹脂が乾燥しすぎないように１分４５秒で遠心分離機を止めた）遠心分離を行なって、カラム内の保存液の除去を行なった。その後、下キャップをカラムに取り付けた。除タンパクおよび除ＤＮＡ処理を行なったサンプル（上清）４ｍｌをカラムに添加し、上キャップをカラムに取り付け、樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間、転倒混和を行なうことによって、樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップをカラムに装着したまま、１,４００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離を行なった後、上キャップをはずし、上清をRNase freeのマイクロピペットを使用して除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、２分間ほど緩やかに混和した後、上キャップをカラムに装着し、１,４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なって上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返した。
【０１０１】
次に３ｍｌのLow-salt bufferをカラムに添加して約１〜２分間 穏やかに懸濁後、上キャップを装着し１５ｍｌ容 遠心チューブに入れ、１,４００ｒｐｍで２分間 遠心分離を行なって上清を除去した。その後、下キャップも取り外し、３ｍｌのLow-salt bufferを樹脂表面が平らになるように壁面に添わせながら添加した後、１５ｍｌ容 遠心チューブにカラムを設置し１,３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。
【０１０２】
次に新しい１５ｍｌ容 遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌ容マイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、１５ｍｌ容 遠心チューブに重ねて入れることによって溶出用チューブを作製した。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱した０．２５ｍｌのElution bufferを添加し、１,３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。この操作を２回繰り返し、溶出液をｍＲＮＡ画分として回収した。回収したｍＲＮＡ画分を氷上に静置した。１０μｌのｍＲＮＡ画分に対して、７０μｌ Elution bufferを加えて８倍希釈し、Elution Bufferを吸光度ブランクとしてＡ２６０（ＲＮＡ）、Ａ２８０（タンパク質）を測定した。なお吸光度の測定には、塩酸：メタノール＝1：1の溶液に１時間ほど浸漬することによってRNease freeにした後、ＤＥＰＣ処理水（Dietyl Pyrocarbonate 処理水）で洗浄したセルを使用した。またＲＮＡ濃度は、Ａ２６０×希釈率４０μｇ／ｍｌで算出した。
【０１０３】
また、回収したｍＲＮＡ画分に１／１０量の３Ｍ 酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２．５倍量の９５%エタノールを加えて混合した。上記混合液を−３０℃に約４０分間置き、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行なった後、−８０℃で保存した。
【０１０４】
なお、２４０℃で２時間乾熱滅菌がなされたガラスおよび金属類、並びにRNase and DNase freeのプラスチック類を、上記ｍＲＮＡの調製において使用した。
【０１０５】
＜ｍＲＮＡからのFirst strand cDNAの合成＞
−１３０℃でエタノール沈殿の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、マイクロピペットで上清を除去した。その後、１ｍｌ冷７５％エタノール（当該冷７５％エタノールは予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃に保存したもの）を、マイクロチューブに対してペレットの無い方から穏やかに添加してリンスを行なった。次に上記マイクロチューブを、４℃、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行ない、ＲＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し、１時間静置してＲＮＡを溶解した。溶解後、確認の為にｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し、吸光度を測定した。
【０１０６】
ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （インビトロジェン社製）を用い、当該キットのプロトコールに準じて行なった。以下に方法を示す。キットを−８０℃より取り出し、各試薬を氷上で溶解し、よく混合した。RNase freeの０．２ｍｌ容マイクロチューブに、ｍＲＮＡ２μｇ相当のｍＲＮＡ溶液を添加した。上記マイクロチューブにpd(T)12〜18primer（０．５μｇ／ｍｌ）を２ｍｌ添加し、１７μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水でメスアップした。上記溶液を混合後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行なった。その後、氷上にマイクロチューブを置き、０．２５Ｍ ＤＴＴを１μｌ、Rnase inhibitor を１μｌ、および５×Reaction buffer ５μｌをマイクロチューブへ添加し、よく混合した。さらに、AMV-RT １μｌをマイクロチューブへ添加し緩やかに混合した後、４１℃で６０分間伸長反応を行なった。６０分間経過後、氷上にマイクロチューブを置くことで伸長反応を停止し、その後マイクロチューブは−３０℃に保存された。
【０１０７】
＜ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅＞
Mouse Ig primer Kit（Novagen社製）、およびNovaTaqTMHot Start DNA Polymerase Kit(Novagen社製)を使用し、上記にて得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子の可変領域の増幅を行なった。
【０１０８】
まず抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Master mix（３７．２５μｌ 滅菌超純水、０．５μｌ 3’-Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌ １０ｍＭ dNTPs（最終濃度 ０．２ｍＭ）、５μｌ １０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、および０．２５μｌ NovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）を混合した溶液を準備し、陽性対照、陰性対照、およびプライマーの本数分準備したＰＣＲチューブに当該溶液を４７μｌずつ分注した。上記ＰＣＲチューブに、１ｍｌ 5’-Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、および２ｍｌ ｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、上記陽性対照として Mouse Ig primer Kitに付属にものを使用し、陰性対照として滅菌超純水を使用した。
【０１０９】
上記ＰＣＲチューブ内の溶液をよく混合し、Biometra社 T-GRADIENT、TaKaRa社 PCR Thermal cycler PERSONALを使用してＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応条件として、軽鎖は９５℃ ７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃ １５秒間、伸長反応を７４℃ １５秒間とし、アニーリングは７０℃→６６℃→６２℃→５８℃→５４℃→５０℃と６段階で４℃ずつ下げるStep Down法を採用し１５秒間行なった。上記の熱変性、伸長反応、およびアニーリングのステップを、アニーリング温度が５４℃になるまでは、３サイクルずつ行ない、アニーリング温度が５０℃の反応を１０サイクル行なった。一方、重鎖は９５℃ １０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃ １分間、アニーリング温度５０℃ ２分間、伸長反応を７２℃ ２分の３ステップを４０サイクル行なった後、７２℃の伸長反応を１０分間行なった。上記ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動により、各抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【０１１０】
＜TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社製）によるクローニング＞
以下のようにして、クローニングを行なった。
【０１１１】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物２μｌ、Salt Solution １μｌ、およびSterile Water ２μｌを、氷上にてＰＣＲチューブに分注し、混合した。さらに上記ＰＣＲチューブに、TOPO vector １μｌを添加して緩やかに混合後、当該ＰＣＲチューブ内の溶液を３０分間、室温でライゲーション反応させた。３０分後、直ちにＰＣＲチューブを氷上に置き、反応を停止させた。
【０１１２】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（インビトロジェン社製）を取り出して、氷上で溶解した。上記One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliに、氷上に置いていたライゲーション反応液２μｌを加え、氷上で３０分間インキュベーションを行ない、Competent cell間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間ヒートショックを与えてＤＮＡを取り込ませた後、氷上に戻し２分間静置した。あらかじめ室温に戻しておいた２５０μｌのSOC mediumをクリーンベンチ内で上記ＤＮＡ溶液に対して加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【０１１３】
この間に、予め準備しておいたAmpicillin/LB plate １枚に対して、１００μｌの１００ｍＭ IPTG stockと、２０μｌのX-Gal ５０ｍｇ／ｍｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。感想終了後、Ampicillin/IPTG/X-Gal/LB plateに、大腸菌液（５０μｌまたは１００μl）を塗り広げ、３７℃で一晩培養を行なった。
【０１１４】
形質転換後の青／白判定により、ＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー程度選択し、偽陽性を除くため、更に画線培養を行なった。画線培養では、形質転換と同様にAmpicillin/IPTG/X-Gal/LB plateを使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養を行なった。
【０１１５】
各コロニーにＤＮＡ断片が挿入されていることを確認の後、プラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
【０１１６】
形質転換体の培養液から０．７５ｍｌの培養液を取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合して−８０℃にストックし、残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌ容 マイクロチューブ６本に移し、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行なって集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。上記マイクロチューブにSolution I（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加え、ボルテックスミキサーにかけてよく懸濁した。
【０１１７】
次に上記マイクロチューブにSolution II（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、当該マイクロチューブを氷中に５分間置き、Solution III（３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ＭＣＨ３ＣＯＯＨ）を１５０μｌ加えて緩やかに混合した後、当該マイクロチューブを氷上に５分間置いた。
【０１１８】
そして、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り（この時採取量を把握しておく）、新しい１．５ｍｌ容 マイクロチューブに移し、等量のフェノール・クロロホルムを加えて混合した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。さらに上記作業を繰り返して合計２回のフェノール・クロロホルム処理を行なった後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移し、２倍等量の冷エタノール １ｍｌを加えて上下に振って混合した後、−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５，０００回転で１０分間遠心分離を行なった後、上清を除去した。そして７０％冷エタノールを１ｍｌ加えてペレットをリンスし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、上清を除去した後、１５分間真空乾燥を行なった。
【０１１９】
真空乾燥終了後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）４５μｌでペレットを溶解し、RNase A溶液（５ｍｇ／ｍｌ Rnase A、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５μｌをマイクロチューブへ加えた（終濃度：５０μg／ｍｌ）。マイクロチューブ２本分の溶液を、１本のマイクロチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【０１２０】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）をマイクロチューブへ添加し、当該マイクロチューブを氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。上記マイクロチューブへ、７０％エタノール １ｍｌを加えてリンスし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった。上記遠心分離の上清を除去した後、真空乾燥を行なった。真空乾燥後、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水を添加してサンプルを溶解してプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推定した。
【０１２１】
＜塩基配列の決定＞
Thermo SequenaseTMCyTM5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて、塩基配列の決定を行なった。Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、およびＴ（チミン）の４種類の塩基用に、ＰＣＲチューブを用意し、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分、１μｌずつ分注した。
【０１２２】
次に、ＤＮＡ／プライマーミックスの調製を行なった。前項で調製された１．５μｇのＤＮＡ、３．５μｌのReaction Buffer、１μｌのTOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）(Invitrrogen)、および２μｌのThermo Sequenase（１０Ｕ／μｌ）を混合し、さらに滅菌超純水を添加して全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記のＰＣＲチューブに７μｌずつ分注し、すみやかにBiometora社 サーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行ない、４℃で冷却し反応を停止させた。
【０１２３】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加し、よく混合した。１０分間氷上で静置した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、ペーパータオル上でデカンテーションにより上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、その後、マイクロピペットを使用し、上清を丁寧に除去した。そして、遮光してペレットを乾燥させ、６μｌのLoading Dyeに溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行ない、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μlずつローディングし、解析を行なった。得られた塩基配列は、ＤＮＡＳＩＳソフトウェアを使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【０１２４】
＜抗体可変領域の立体構造予測＞
上記にて決定した塩基配列から推測した抗体可変領域のアミノ酸配列をもとに、ソフトウェアAbM (Oxford Molecular社製、 Oxford、UK)を用いて、目的抗体のＣＤＲ領域のループ構造およびＦＲ領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、ソウトウェアInsightII/Discover3 (Molecular Simulatoin社製、USA)により分子間力計算を行ない、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１２５】
さらに、ソフトウェア PPC Protein AdviSer（富士通九州システムエンジニアリング）を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼの活性部位を構成する触媒三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２、および２Ｂ８の３種類の抗体軽鎖（Ｌ鎖）はいずれも触媒三つ組み残基構造を有していた（図１〜３参照）。なお図の見方については、「発明を実施するための最良の形態」の項で既に述べたとおりである。
【０１２６】
発明者らによるこれまでの多くの研究（Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005).）から、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２、および２Ｂ８は、抗体酵素である可能性が示唆された。そこで、上記３つの抗ＮＣ５モノクローナル抗体について、重鎖（Ｈ鎖）軽鎖（Ｌ鎖）の抗原分解能の有無について検討することとした。
【０１２７】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体の大量取得と精製＞
上記３つの抗ＮＣ５モノクローナル抗体の大量調製は、あらかじめプリスタン（2,6,10,14-tetramethylpentadecane）が投与されたBalb/cマウスに、各抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞 ０．５×１０６個投与し、当該マウスから腹水を採取することによって行なった。上記のようにして取得した各抗ＮＣ５モノクローナル抗体を以下の方法で精製し、目的の実験に用いた。
【０１２８】
（１）塩析
腹水約８ｍｌを同量のＰＢＳで希釈後、濾過してフィブリンを除去した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１２９】
（２）カラム精製
透析終了後、抗体の精製を行った。操作はMAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）の説明に従い、４℃で行なった。使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１３０】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。不溶物が認められる時には濾紙で濾過して取り除いた。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution buffer、並びにサンプル（上記腹水の濾液）を脱気した。
【０１３１】
キットに含まれるアフィゲルプロテインＡ（BIO-RAD社 商品名）を充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１３２】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが安定したら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡ（BIO-RAD社製）に結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）はＰＢＳに対して２回透析された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD社製）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）で凍結保存した。
【０１３３】
＜抗ＮＣ５抗体重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の分離精製＞
（１）限界ろ過
上記精製した抗体溶液（タンパク質５ｍｇ分）を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２回透析した。透析終了後の抗体溶液をセントリプレップ−１０（ミリポア社製）を用い、４℃、２,８００ｒｐｍで遠心し、約１ｍｌになるまで限外ろ過濃縮を行なった。上記抗体溶液に対して、５ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び限外ろ過濃縮を行なった。上記操作を再度行なった後、５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、当該抗体溶液を褐色瓶に入れた。上記抗体溶液は、以下の実験に使用するまで低温下で保存された。
【０１３４】
（２）重鎖・軽鎖抗体の分離
５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）、１Ｍ Tris solution、および抗体溶液２．７ｍｌをそれぞれ脱気した。2-ME(メルカプトエタノール)と５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）とを抗体溶液に加え、ピペッティングによって溶液を軽く混合しつつ、１Ｍ Tris solutionでｐＨ８．０に調整した後、反応容器内に窒素を封入した。インキュベーター内で、１５℃、３時間スターラーで撹拌しながら還元反応を行なった。脱気後の０．６Ｍ ヨードアセトアミド ６００μｌを抗体溶液に対して加え、混合した。上記抗体溶液のｐＨを、１Ｍ Tris solutionでｐＨ８．０に調整した。１５℃で１５分間撹拌しながらアルキル化反応を行なった。ディスクフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を使用し、抗体溶液の除粒子を行なった。上記抗体溶液を、セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌになるまで、限外ろ過濃縮を行なった。
【０１３５】
＜サイズ排除ＨＰＬＣによる抗ＮＣ５モノクローナル抗体重鎖および軽鎖の精製＞
重鎖および軽鎖の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー(JASCO,PU-2080 Plus)、カラム(Waters,Protein-PakTM300SW,7.5 × 300 mm Column)を使用して行なわれた。移動相に用いる６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ６．５）、流速０．１５ｍｌ/分でカラムの平衡化を行なった(120 分間程度)。抗体溶液のサンプルを２〜３回に分けてカラムへインジェクションした。クロマトグラムを参照しながら、重鎖および軽鎖をそれぞれ分取した。取得した重鎖および軽鎖のサンプルそれぞれをＰＢＳに対して透析し、重鎖および軽鎖をRefoldingした。重鎖および軽鎖のサンプルのバッファーを１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。重鎖および軽鎖のサンプルについてＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD社製）で重鎖および軽鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して当該サンプルを４℃で保存した。
【０１３６】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討＞
天然型抗体酵素の特徴は、その抗体自身が標的となるタンパクを特異的に完全分解することである。しかし、ペプチド基質を用いて抗体酵素の分解活性を検討する場合には、非特異的に反応するということが知られている。そこで、これまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性の検討によく用いられてきたペプチドTP41-1 peptide(ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ：21mer：配列番号１６)を使用して該抗体が該ペプチド分解能を有するか検討した。なお、マウスの免疫に用いた抗原ペプチドは水に難溶性であったため、ペプチダーゼ活性の検討の基質として用いることはできなかった。
【０１３７】
（１）実験方法
まずクリーンベンチ内で、２４０μＭのTP41-1 peptide 溶液（１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）を調製し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行なった。試験管内でTP41-1 peptide 溶液と１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）とを１:１となるように混合したものをコントロール溶液とした。上記のようにして調製した各反応溶液は以下の通りである。
反応液(1)０．８μＭ 軽鎖＋TP41-1 peptide溶液 ・・・６００μｌ作製
反応液(2)０．４μＭ 重鎖＋TP41-1 peptide溶液 ・・・６００μｌ作製
反応液(3)コントロール溶液 ・・・５００μｌ作製
反応は、２５℃で行なわれた。
【０１３８】
また反応の分析はＨＰＬＣ（puresil C18、Waters社）を使用した。ＨＰＬＣの測定条件として、カラムオーブンは４０℃、溶離液は０．０８％ ＴＦＡ、１３％アセトニトリル、超純水を使用した。各反応液をクリーンベンチ内で３０μｌ回収し、当該反応液を０．４５μｍのフィルターに通し、さらに１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離後のものをサンプルとして、ＨＰＬＣに供した(サンプルのインジェクション量２０μl)。
【０１３９】
（２）結果
上記試験の結果を示すべく、反応基質（TP41-1 peptide）の経時変化を図５〜８に示した。図５は抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の結果を示し、図６は抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の結果を示し、図７は抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の結果を示し、図８は抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の結果を示している。また各図において、丸のシンボルは上記反応液(1)の結果を示し、四角のシンボルは上記反応液(2)の結果を示し、三角のシンボルは上記反応液(3)の結果を示している。
【０１４０】
図５によれば、反応液(1)の場合に、約２５時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約９６時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１１に示す。
【０１４１】
また図６によれば、反応液(1)の場合に、約５０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約１２０時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１２に示す。
【０１４２】
したがって、図５および６の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖は、TP41-1 peptideを再現性良く分解することができるということが分かった。
【０１４３】
また、図７によれば、反応液(1)の場合に、約２０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約７０時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。また反応液(2)の場合において、TP41-1 peptideの分解が若干確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１３に示す。
【０１４４】
したがって、図７の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖は、TP41-1 peptideを分解することができるということが分かった。
【０１４５】
また、図８によれば、反応液(1)の場合に、約５０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約１４２時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１４に示す。
【０１４６】
したがって、図８の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖は、TP41-1 peptideを分解することができるということが分かった。
【０１４７】
上記の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２および２Ｂ８の軽鎖は、いずれもペプチダーゼ活性を有するものであるということが分かった。
【０１４８】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体における動力学的解析＞
（１）方法
抗ＮＣ５モノクローナル抗体の動力学的パラメーターを求めるにあたり、当該抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖は、２相性の曲線を描きながら基質（TP41-1 peptide）を分解するため、分解初速度を求めるのは困難である。そこで、一度完全に基質（TP41-1 peptide）を分解した反応液に再びペプチドを添加して反応させることによって、誘導期が存在しない条件で動力学的パラメーターの解析を行なった。
【０１４９】
分解初速度を用いて、各種動力学的パラメーターを求めた。分解初速度は、当該抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖の濃度を０．４μＭ一定としつつ、基質濃度を変化させることによって算出した。算出された分解初速度をMichaelis-Menten式に当てはめ、以下に示す動力学的パラメーターを算出した。
【０１５０】
（２）結果
図１７には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果（抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖）を示す。図１７（ａ）は、基質（TP41-1 peptide）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１７（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１５１】
上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出された抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖の動力学的パラメーターは、以下の通りであった。
Ｋｍ＝１．７×１０−６（Ｍ）
ｋcat＝１．４×１０−１（ｍｉｎ-1）
ｋcat/Ｋｍ＝８．５×１０４（Ｍ−１ｍｉｎ−1）
また図１８には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果（抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖）を示す。図１８（ａ）は、基質（TP41-1 peptide）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１８（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１５２】
上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出された抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖の動力学的パラメーターは、以下の通りであった。
Ｋｍ＝１．１×１０−５（Ｍ）
ｋcat＝６．１×１０−１（ｍｉｎ-1）
ｋcat/Ｋｍ＝５．７×１０４（Ｍ−１ｍｉｎ−1）
以上の結果より、上記抗体軽鎖によるペプチド基質の分解反応は酵素反応であるということが分かった。
【０１５３】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖とＣＣＲ５との反応性＞
（１）方法
抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖と反応基質(TP41-1 peptide)とをあらかじめ反応させた後、MOLT-4/CCR5破砕液（「MOLT-4/CCR5」については「MASANORI BABA,HIROSHI MIYAKE,MIKA OKAMOTO,YUJI IIZAWA,and KENJI OKONOGI”Establishment of a CCR5-Expressing T-Lymphoblastoid Cell Line Highly Susceptible to R5 HIV Type 1”AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES Volume 16,Number 10,2000,pp.9350941」参照）を上記反応液に対して、体積比で反応液：破砕液＝４：１となるように添加した。上記反応液を２５℃のインキュベーターに入れ、反応を開始した。反応開始後０、６、１２、２４、および４８時間後の反応液を採取した。
【０１５４】
全サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％Running Gel、３％ Stacking Gel）に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっている間に、ウエスタンブロッティングで用いる冷水とろ紙２枚、Immobilion-P（ミリポア社製、Cat.no IPVH0010 Lot.no K4DN9499W）１枚、ブロッティングバッファー（２５ｍＭ Tris、１９２ｍＭ Glycine、０．１％ ＳＤＳ）を用意しておき、Immobilion-Pとろ紙とはゲル大に切り取っておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了１５分前に、Immobilion-Pをメタノールに２０秒間浸漬した後、ブロッティングバッファーに１０分間以上浸漬した。パッド、ろ紙も同様にブロッティングバッファーに浸漬しておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルをブロッティングバッファーに５分間浸漬しておいた。ブロッティング装置のマイナス側電極板の上にパッド２枚、ろ紙、Immobilion-P、ゲル、ろ紙、パッド２枚、プラス電極板の順で重ね、泳動槽の中に入れた。陽極板と陰極板の間にブロッティングバッファーをパッドが浸るまで注入し、外側に冷水を泳動槽の上端から１ｃｍ位の所まで入れた。ブロッティング装置に対して通電（１８０ｍＡ、３０Ｖ）し、９０分間ブロッティングを行なった。
【０１５５】
ブロッティング終了後、Immobilion-Pを３％ skim milk/TBS-Tで、１時間ブロッキングを行なった。RABBIT ANTI HUMAN CCR5（SEROTEC社製、 Catalog Number AHP568 Lot.220501）が最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加された３％ skim milk/TBS-Tへ、Immobilion-Pを浸漬し、１時間反応させた（一次反応）。一次反応終了後のImmobilion-P をTBS-Tで軽く洗浄後、３％ skim milk/TBS-Tで５分間×３回洗浄を行なった。
【０１５６】
３％ skim milk/TBS-Tで１０００倍希釈したalkaline phosphatase conjugated goat affinity purified F(ab’)2 fragment to Rabbit IgG(whole molecule)（Cappel社製、Catalog Number 59306 Lot.00852）溶液に、洗浄後のImmobilion-Pを浸漬し、１時間反応させた（二次反応）。二次反応終了後のImmobilion-P をTBS-Tで軽く洗浄後、３％ skim milk/TBS-Tで５分間×３回洗浄を行なった。陽性バンドをBCIP/NBTで検出を行なった（検出時間２０分間）。検出された陽性バンドの濃さを、NIH Image（米国 ＮＩＨより入手）で数値化し、グラフ化した。
【０１５７】
（２）結果
図９にウェスタンブロットの結果を示した。同図中、上部に「MOLT-4/CCR5」を付したものは、比較として抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合の結果であり、「５Ａ２」を付したものは、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果であり、「２Ｂ８」を付したものは、抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果である。また同図中、上部に「０」、「６」、「１２」、「２４」、「４８」を付したものは、「反応開始０時間後の反応液」、「反応開始６時間後の反応液」、「反応開始１２時間後の反応液」、「反応開始２４時間後の反応液」、「反応開始４８時間後の反応液」をそれぞれ示している。なお、同図中「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【０１５８】
また図１０は、図９におけるバンドの濃さをNIH Imageで数値化し、グラフ化したものであり、反応基質であるMOLT-4/CCR5濃度（相対値）の経時変化を示している。図１０中、四角のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果を示し、ひし形のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果を示し、丸のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果であり、三角のシンボルは比較として抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合の結果である。
【０１５９】
図９および図１０の結果から、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合と、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合とを比較すると、後者の場合にMOLT-4/CCR5の減少が確認された。特に抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合に、MOLT-4/CCR5の顕著な減少が確認された。
【０１６０】
以上の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖は、ケモカインレセプターＣＣＲ５を切断する抗体酵素であるということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
エイズウイルスがヒトに感染する場合には、ウイルス側に存在するｇｐ１２０やｇｐ４１や、ヒトの細胞側に存在するＣＤ４およびケモカインレセプターＣＣＲ５が重要な役割を果すこと、および、ケモカインレセプターＣＣＲ５が正常でない場合は、エイズウイルスの感染が成立しないことが知られている。
【０１６２】
本発明にかかる抗体酵素は、上述のようにＣＣＲ５に対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、ＨＩＶの感染の予防やエイズの治療のための抗ＨＩＶ薬剤として有用である。本発明の抗体酵素は、ＣＣＲ５の働きを抑制するという従来の抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる新しい作用機構でＣＣＲ５を破壊するものであるため、現在有効な治療法が見出されていないエイズの治療に有効利用できることが期待される。またエイズに関する研究用ツールとしても利用可能である。
【０１６３】
したがって、本発明は、医療、医薬品産業、試薬産業、等に利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図２】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図３】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図４】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図５】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図６】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図７】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図８】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図９】抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖とＣＣＲ５との反応性を検討するために行なった、ウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１０】抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖とＣＣＲ５との反応性を検討した結果を示す折れ線グラフである。
【図１１】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１２】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１３】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果示すチャート図である。
【図１４】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１５】抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（５Ａ２および６Ａ２）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた結果を示す棒グラフである。
【図１６】抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（２Ｂ８、３Ｆ４、および４Ｈ６）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた結果を示す棒グラフである。
【図１７】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖による基質（TP41-1 peptide）酵素分解実験における速度論的解析結果を示し、図１７（ａ）は、基質濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１７（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【図１８】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖による基質（TP41-1 peptide）酵素分解実験における速度論的解析結果を示し、図１８（ａ）は、基質濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１８（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ（acquired immunodeficiency syndrome）は、その原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス型（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）の感染によって免疫機能が低下し、それに伴って日和見感染症や悪性腫瘍、神経症状、痴呆などを合併した病態である。ＨＩＶに感染すると、急性期、無昇症候期、エイズ関連症候群を経てエイズへと進展する。ＨＩＶ関連の研究や治療法などの進歩によって、エイズは不治の病から治療可能な病気になりつつあるが、現段階では確実な抗ＨＩＶ薬剤はなく、薬物による治療法も確立できていないのが現状である。
【０００３】
ＨＩＶの感染機構に関する研究において、１９８４年にＨＩＶのレセプターとしてＣＤ４が同定された。ＨＩＶの感染は、ウイルス粒子表面のエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）が、ヒトの細胞表面に発現しているＣＤ４分子に結合することから始まる。
【０００４】
しかし、ＣＤ４のみではウイルスの外皮と宿主細胞の細胞膜との融合は起こらず、ＨＩＶの感染は成立しないため、ＣＤ４分子以外のヒト細胞膜成分が、ウイルス侵入のために補助因子として働く可能性が考えられ、コレセプター（セカンドレセプター）の存在が示唆されていた。そして、ＣＤ４の発見から１０年以上経過した後に、ＨＩＶのコレセプターの一つとして、ケモカインレセプターＣＣＲ５が発見された（非特許文献１参照）。
【０００５】
ＨＩＶ感染の第一のステップは、血液中や粘膜下に存在するヘルパーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞への吸着および侵入である。そして上記のＨＩＶの細胞内侵入は、ウイルスのエンベロープタンパク質と標的(宿主)細胞の膜タンパク質との多段階反応によって引き起こされる。上記ＨＩＶの標的細胞内への侵入の詳細は、以下に示すとおりである。まずＨＩＶ粒子表面のエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）が、標的細胞表面のＣＤ４へ結合する。このｇｐ１２０のＣＤ４ヘの結合によって、ｇｐ１２０に構造(コンフォメーション)変化が起こり、それまでマスクされた状態にあったｇｐ１２０のＶ３ループ領域が解放され、標的細胞表面上のコレセプター（ＣＣＲ５等）に結合する。この際、Ｖ３ループ領域とコレセプターとの相互作用には、コレセプターのアミノ末端領域（Ｎ末端領域）をはじめとする、いくつかの細胞外領域が関与していると考えられている。このＶ３ループ領域とコレセプターとの相互作用は、さらにＨＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通タンパク質ｇｐ４１の細胞外ドメインの構造変化を引き起こし、それによってｇｐ４１の疎水性の高いＮ末端部分が標的細胞膜表面の脂質二重層へ挿入され、これが引き金となって、ウイルス表面膜と標的細胞膜との間で膜融合が起こり、ウイルスが細胞内に侵入するものと考えられている（非特許文献２参照）。
【０００６】
その後の研究によって、標的細胞においてケモカインレセプターＣＣＲ５が正常でない場合は、ＨＩＶの感染および発症に抵抗性を示すことが報告されている（非特許文献３参照）。そのため、現在、多くの研究者や企業が、このコレセプターを標的とし、ＨＩＶの侵入を阻害する薬剤の開発に乗り出している。このようなＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発の現状に関しては、例えば以下に示す非特許文献４に記載されている。非特許文献４には、ケモカインレセプターＣＣＲ５を標的としてＨＩＶの感染を予防できる抗ＨＩＶ薬剤の候補として、ケモカインレセプターのアンタゴニストが報告されている。
【０００７】
しかしながら、これまで研究が進められている抗ＨＩＶ薬剤候補は上記のごとく、ケモカインレセプターＣＣＲ５のアンタゴニストであり、ケモカインレセプターＣＣＲ５を直接攻撃して、その機能を消失させることのできる有効な薬剤は全く提案されていなかった。そこで本発明者らは、ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解して、その機能を消失させることができ、ＨＩＶの感染予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素の開発を開始した。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ５の細胞外領域を構成するペプチド、ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ（配列番号１３）、または、ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳ（配列番号１４）を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から、ケモカインレセプターＣＣＲ５の細胞外領域を分解し得る抗体酵素を見出した（特許文献１参照）。
【非特許文献１】Samson,M., Libert,F.,Doranz,B,J.,et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene.(1996)Nature.382:722-725.
【非特許文献２】Lee,B.,Sharron,M.,Blanpain,C.,et al. Epitope Mapping or CCR5 Reveals Multiple Conformational States and Distinct but Overlapping Structures Involved in Chemokine and Coreceptor Function.(1999)J.Biol.Chem.274:9617-9626
【非特許文献３】「ケンモカインハンドブック」義江修 野見山尚行 宮坂昌之 監修（秀潤社）、２００年１１月２０日発行
【非特許文献４】村上務、山本直樹著：タンパク質 核酸 酵素、Vol.４３、677-685頁（1998年）、「新しい抗ＨＩＶ薬剤の開発−ＨＩＶのコレセプター（セカンドレセプター）に作用する薬剤」
【特許文献１】特開２００４−３１３１６６号公報（公開日：平成１６年（２００４）１１月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、既述のごとく、ＨＩＶの侵入に重要なステップである、Ｖ３ループ領域とコレセプターとの結合には、コレセプターのアミノ末端領域（Ｎ末端領域）をはじめとする、いくつかの細胞外領域が関与していると考えられており、特許文献１に記載された抗体酵素だけではＨＩＶの感染予防および阻止を十分に行なうことができない場合があると考えられた。
【０００９】
またＣＣＲ５分子のＮ末端領域が、ＨＩＶエンベロープタンパク質とＣＣＲ５との結合に重要であることも報告されている（非特許文献３参照）。
【００１０】
そこで本発明は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を標的とし、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素を提供することを目的とした。さらに本発明は、上記抗体酵素をコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、およびそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体酵素を得るべく鋭意検討を行なった。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解し得る抗体酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかる抗体酵素は、ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体または抗体断片であり、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、かつ、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解する活性を有することを特徴としている。
【００１３】
ここで、上記「抗体断片」とは、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のペプチドを抗原とする抗体を構成する各ペプチド鎖、さらにはこの各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片を意味する。また上記「抗体酵素」とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンである。なお、上記抗体酵素は、完全な抗体分子に限定されるものではなく、抗原に特異的に結合することができ、かつ酵素活性を有する抗体フラグメント（例えば、軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、など）でもよい。また、酵素活性は特に限定されるものではないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。
【００１４】
特に、上記抗体酵素の中でも、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれている。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（Super Catalytic Antibody [I] : Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88(3), 323-327 (1999)参照）。本発明にかかる抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のペプチドを抗原とする抗体であり、当該ＣＣＲ５を完全分解し得るものと推察されるため、「スーパー抗体酵素」に含まれる。
【００１５】
上記本発明にかかる抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域の抗体としての性質を色濃く残した状態で、その抗原であるケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を分解するという性質を持っている。そのため、上記抗体酵素は特異性が高く、ケモカインレセプターＣＣＲ５のみを特異的に分解することができる。このケモカインレセプターＣＣＲ５、特にそのＮ末端領域は、既述の通りＨＩＶの感染において重要な役割を果すため、それを消失させることができる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００１６】
また本発明にかかる抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端に対する抗体の可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成する重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合に、その活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、上記抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有することができる。
【００１７】
また、上記本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。ここで上記「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことを言う。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基との距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは、３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。
【００１８】
本発明にかかる抗体酵素として、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列おいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１９】
この配列番号１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体「５Ａ２」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この５Ａ２のＬ鎖の可変領域は、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２０】
また本発明にかかる抗体酵素の他の例として、配列番号５に示すアミノ酸配列、または、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２１】
この配列番号５に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体「６Ａ２」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この６Ａ２のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２２】
さらに本発明にかかる抗体酵素の他の例として、配列番号９に示すアミノ酸配列、または、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２３】
この配列番号９に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体「２Ｂ８」の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。この２Ｂ８のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解活性を有するものである。
【００２４】
上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１、５、９のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１、５、９のいずれかに示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２５】
本発明にかかる抗体酵素は、ＨＩＶの感染において重要な役割を果すケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解してその機能を消失させるため、ＨＩＶの感染を阻害する抗ＨＩＶ薬剤として使用することもできる。すなわち、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含むことを特徴とするものである。
【００２６】
上記本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶの感染を阻害することができる。また、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶ感染患者に対してエイズの発症を遅らせたり、病気の進行を阻止したりすることも可能である。すなわち、本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、ＨＩＶ感染患者に対する治療薬としても機能し得る。
【００２７】
なお上記本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤は、上記本発明にかかる抗体酵素のみを含み、それを静脈注射などによって直接投与して使用することもできるが、上記抗体酵素に加えて、薬理学的に許容される担体がさらに含まれるものであってもよい。このような抗ＨＩＶ薬剤の製造は、従来公知の製造方法によって行なうことができる。この抗ＨＩＶ薬剤は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域のみを特異的に分解するため、抗ＨＩＶ効果が顕著であるというだけでなく、副作用が少ないということも期待できる。
【００２８】
また本発明には、上記本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入すれば、本発明にかかる抗体酵素をその宿主内で発現させることができる。
【００２９】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３０】
本発明にかかる遺伝子として、具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３１】
また本発明にかかる遺伝子の他の例として、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号６に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体の６Ａ２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３２】
さらに本発明にかかる遺伝子の他の例として、配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のモノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３３】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内で発現させることができ、当該抗体酵素の製造に利用することができる。また、上記形質転換体は、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内に蓄積しているため、当該形質転換体自身もＨＩＶ感染を予防する抗ＨＩＶ薬剤や、エイズ治療のための抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【発明の効果】
【００３４】
上記本発明にかかる抗体酵素は、ＨＩＶ感染において重要な役割を果すケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターを分解することが可能であるため、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００３５】
それゆえ、本発明は、ＨＩＶの感染の予防、およびエイズ治療に寄与することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３７】
（１）本発明にかかる抗体酵素、および遺伝子について
ここでは、本発明にかかる抗体酵素の一例として、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体「５Ａ２」、「６Ａ２」および「２Ｂ８」の抗体断片を例に挙げて説明する。なお、以下の説明において、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体５Ａ２」のことを「５Ａ２」と、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体６Ａ２」のことを「６Ａ２」と、「ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体２Ｂ８」のことを「２Ｂ２」と称する。
【００３８】
上記５Ａ２、６Ａ２および２Ｂ２の抗体断片は、より具体的には、５Ａ２の軽鎖の可変領域（以下「５Ａ２Ｌｖ」という）、６Ａ２の軽鎖の可変領域（以下「６Ａ２Ｌｖ」という）、および２Ｂ８の軽鎖の可変領域（以下「２Ｂ８Ｌｖ」という）である。
【００３９】
上記３つの抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲＬＬ：配列番号１５）を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として見出されたものである。
【００４０】
本発明にかかる抗体酵素５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、および２Ｂ８Ｌｖは、ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、当該ケモカインレセプターＣＣＲ５の分解酵素として作用する。このことは、後述の実施例において示された結果からも明らかである。
【００４１】
ここで、ケモカインレセプターＣＣＲ５（以下、「ＣＣＲ５」という）について、簡単に説明する。
【００４２】
ＣＣＲ５は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであり、ＨＩＶエンベロープにコンフォメーション変化をもたらし、ウイルスと宿主細胞との膜融合を導くと考えられることから、ＨＩＶがヒトに感染する際の重要な要素である。欠損変異型ＣＣＲ５遺伝子を持つヒトは、ＨＩＶの感染・発症に抵抗性を示すということが知られている。
【００４３】
また、ＣＣＲ５は、ヒトからヒトへの感染に関与するＨＩＶのマクロファージ指向性株の感染においてコレセプターとして用いられる唯一のものである。このことから、ＣＣＲ５の機能を抑制させることがＨＩＶ感染の予防、エイズ進行の阻止につながると期待される。
【００４４】
上述の３つの抗体酵素は、このＣＣＲ５、特にＣＣＲ５のＮ末端領域と特的に結合し、ＣＣＲ５を分解し、ＣＣＲ５の機能を消失させることができる。欠損変異型ＣＣＲ５遺伝子を持つヒトには、明らかな免疫不全や組織病変はなく、健康上何ら問題は見られないことから、ＣＣＲ５の機能を消失させる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００４５】
ここで、ＣＣＲ５の「Ｎ末端領域」とは、ＣＣＲ５の細胞外領域の一つであって、ＨＩＶエンベロープタンパク質とＣＣＲ５との結合に重要であることが知られている。かかるＮ末端領域は、ＣＣＲ５のアミノ酸配列のＮ末端から３０位までの領域のことをいう。なおヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸、塩基配列情報は、公知のデータベース等から入手可能である。例えば、ヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８に示す。
【００４６】
次に、上記５Ａ２Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。５Ａ２Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（「Ｎ末端ペプチド」という）を免疫原とするモノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖の可変領域であり、配列番号１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４７】
図１には、軽鎖と重鎖からなる５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図１に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、第３９番目のヒスチジン（図１では「Ｈｉｓ３９」と記す）、第５７番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ５７」と記す）、第７５番目のアスパラギン酸（図１では「Ａｓｐ７５」と記す）、第９４番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ９４」と記す）、第９６番目のセリン（図１では「Ｓｅｒ９６」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。また図２に示すように、第１番目のアスパラギン酸（図２では「Ａｓｐ１」と記す）、第９６番目のセリン（図２では「Ｓｅｒ９６」と記す）、および第９８番目のヒスチジン（図２では「Ｈｉｓ９８」と記す）も触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４８】
また、本発明にかかる抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記５Ａ２Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側に５Ａ２のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４９】
なお、５Ａ２の重鎖の可変領域（以下「５Ａ２Ｈｖ」という）は、配列番号３に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この５Ａ２Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この５Ａ２Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号４に示す。
【００５０】
次に、上記６Ａ２Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。６Ａ２Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖の可変領域であり、配列番号５に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５１】
図３には、軽鎖と重鎖からなる６Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図３に示すように、配列番号５に示すアミノ酸配列において、第７番目のセリン（図３では「Ｓｅｒ７」と記す）、第７０番目のアスパラギン酸（図３では「Ａｓｐ７０」と記す）、第８５番目のアスパラギン酸（図３では「Ａｓｐ８５」と記す）、および第８番目のヒスチジン（図３では「Ｈｉｓ８」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００５２】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記６Ａ２Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列のＣ末端側に６Ａ２のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５３】
なお、６Ａ２の重鎖の可変領域（以下「６Ａ２Ｈｖ」という）は、配列番号７に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この６Ａ２Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この６Ａ２Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号８に示す。
【００５４】
次に、上記２Ｂ８Ｌｖの構造について、以下に詳細に説明する。２Ｂ８Ｌｖは、ＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖の可変領域であり、配列番号９に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５５】
図４には、軽鎖と重鎖からなる２Ｂ８の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図４に示すように、配列番号９に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図４では「Ａｓｐ１」と記す）、第２８番目のセリン（図４では「Ｓｅｒ２８」と記す）、第３１番目のアスパラギン酸（図４では「Ａｓｐ３１」と記す）、第９８番目のヒスチジン（図４では「Ｈｉｓ９８」と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００５６】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、すなわち、上記２Ｂ８Ｌｖの変異体であり、ＣＣＲ５のＮ末端領域の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列のＣ末端側に２Ｂ８のＬ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。なお上記「１または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５７】
なお、２Ｂ８の重鎖の可変領域（以下「２Ｂ８Ｈｖ」という）は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、この２Ｂ８Ｈｖには、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、この２Ｂ８Ｈｖをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１２に示す。
【００５８】
本発明にかかる遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるもの、配列番号６に示す塩基配列からなるもの、または配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ａ２Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子は、６Ａ２Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子は、２Ｂ８Ｌｖをコードする遺伝子の塩基配列の一つである。なお上記遺伝子は、配列番号２、６、または１０に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、本発明にかかる抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。
【００５９】
（２）本発明にかかる抗体酵素の取得方法について
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するペプチド（Ｎ末端ペプチド）を免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。例えば、本発明にかかる抗体酵素が、５Ａ２の軽鎖全長や、６Ａ２の軽鎖全長、または２Ｂ８の軽鎖全長などのように、ＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体の軽鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するＣＣＲ５のＮ末端ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を取得し、その軽鎖を分離して取得すればよい。また、本発明にかかる抗体酵素が、ＣＣＲ５の抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。また、ファージディスプレイ法で得られる抗体であって良い。なおモノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)参照）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)参照）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)参照）等により行なうことが可能である。
【００６０】
ところで、上記３つの抗体酵素（５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、および２Ｂ８Ｌｖ）を取得する際には、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するペプチドが免疫原として用いられているが、本発明にかかる抗体酵素を取得する方法はこれに限定されるものではなく、配列番号１５と異なるアミノ酸配列を有するペプチドが免疫原として用いられてもよい。すなわち、ＣＣＲ５のＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチドであれば、いずれのアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。またそのペプチドのアミノ酸残基数については、免疫原性を有する数であれば特に限定されるものではないが、例えば、５アミノ酸以上４０アミノ酸以下であることが好ましく、７アミノ酸以上３５アミノ酸以下であることが最も好ましい。上記の観点から、本発明にかかる抗体酵素を取得する際に免疫原として用いるペプチドは、例えば、配列番号１８に示されるヒト由来ＣＣＲ５のアミノ酸配列の第１位から第３５位のアミノ酸配列の内、少なくとも１０アミノ酸以上連続する領域を含むペプチドを挙げることができる。また、上記免疫原として用いられるペプチドには、免疫応答を向上させるために２〜３のアミノ酸を付加してもよいし、通常低分子ペプチドの免疫応答を向上するために用いられる「他のタンパク質」を結合させてもよい。上記「他のタンパク質」は特に限定されるものではないが、例えば、Human IgG、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）等を挙げることができる。なお、上記免疫原として用いられるペプチドは、従来公知のアミノ酸合成器を用いて取得してもよいし、遺伝子工学的手法を用いて取得してもよい。
【００６１】
また、上述の５Ａ２Ｌｖ、６Ａ２Ｌｖ、２Ｂ８Ｌｖなどのように、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子配列が明らかとなっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術などを用いて取得することができる。この場合、上記抗体酵素をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で発現したペプチドを精製するという方法などを採用することができる。なお、宿主において目的のタンパク質を大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく取得できるために、好ましい。
【００６２】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００６３】
また、本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、モノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行ない、該当する領域を増幅させることで本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２、６、または１０に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１、５、または９に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が発現産物としてそれぞれ得られる。
【００６４】
（３）本発明にかかる抗体酵素の利用方法について
これまでに、ＣＣＲ５の働きを抑制する作用をもつ抗ＨＩＶ薬剤は開発されてきたが、本発明にかかる抗体酵素は、これらの抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ＣＣＲ５を直接攻撃してそのコレセプターとしての機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００６５】
上記抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ５のＮ末端領域を酵素的に完全に分解してそのコレセプターとしての機能を消失させるという、新しい作用機構でＨＩＶの感染を阻害したり、エイズの発症を抑制したりすることができる。そして、このような抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ５を特異的に分解するため、顕著な抗ＨＩＶ効果を期待できるととともに、副作用も少ないものと考えられる。また、上記抗体酵素の反応機構から考えると、現在使用されている他の抗ＨＩＶ薬剤と併用することによって、エイズに対する治療効果がより向上することが期待できる。
【００６６】
上記本発明にかかる抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、本発明にかかる抗体酵素のみによって構成してもよいが、薬理学的に許容される担体などと混合して構成してもよい。医薬組成物の製造法として公知の手段に従って、上記抗ＨＩＶ薬剤を製造することができる。
【００６７】
ここで、薬理学的に許容される担体には、製剤素材として使用可能な各種有機または無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。
【００６８】
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００６９】
また、上記結合剤としては、例えばα化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００７０】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００７１】
上記溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
【００７２】
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００７３】
上記懸濁剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。
【００７４】
上記等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００７５】
上記無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００７６】
上記防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００７７】
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００７８】
上記抗ＨＩＶ薬剤における抗体酵素の含量は、特に限定されるものではなく、投与方法に応じて適宜最適量を検討の上、採用すればよい。
【００７９】
上記抗ＨＩＶ薬剤は、製剤技術分野において慣用の方法により製造することができる。抗ＨＩＶ薬剤の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等の非経口剤が挙げられ、これらは毒性も低く、それぞれ経口的または非経口的に投与できる。
【００８０】
本発明にかかる抗ＨＩＶ薬剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによっても異なる。したがって、上記投与量は、最適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。
【００８１】
さらに、本発明にかかる抗体酵素は、それをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、本発明にかかる形質転換体は、上記抗体酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、遺伝子が対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。この形質転換体は、自身の体内で上記抗体酵素を発現させることができる。
【００８２】
本発明にかかる形質転換体としてより具体的には、配列番号２、６、または１０に示される塩基配列からなる遺伝子が、宿主細胞に導入されたものを挙げることができる。上記宿主細胞としては、大腸菌、酵母、バキュロウイルスなど、通常使用しているもの適宜用いることができる。
【００８３】
上記形質転換体は、自身の体内でＣＣＲ５を特異的に認識して完全に分解し、その機能を消失させることができるため、抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。また、上記抗体酵素を大量発現できるような形質転換体であれば、ＨＩＶの感染の予防や、エイズの症状の治療を効率よく行なうことができると考えられ、より有効な抗ＨＩＶ薬剤を得ることができる可能性がある。
【００８４】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８５】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
（１.モノクローナル抗体の作製法）
＜免疫＞
ＣＣＲ５のＮ末端領域ペプチド（以下「ＮＣ５ペプチド」；ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲＬＬ；配列番号１５）とＫＬＨ（Pierce, USA）とのconjugateの作製を以下の通りに行なった。ＮＣ５ペプチドは、Peptide & Protein Research Cons. Devon, UK.から購入された。
【００８７】
ＫＬＨ（１０ｍｇ/ｍｌ）に対して架橋試薬ＭＢＳ（m-maleimido-benzoyl-N-hydrosuccinimide、入手先：Peerce,IL,USA）を０．６３ｍｇを撹拌しながら添加し、そのまま１時間反応させた。カラム（Sephadex G-25、Parmacia社製）により未反応のＭＢＳを除去した後、ＮＣ５ペプチド(２ｍｇ)とＫＬＨ（２ｍｇ）とを５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）中で反応させた。この時、ＫＬＨはＮＣ５ペプチドのアミノ酸配列中のシステインと反応し、conjigateとなる。これを免疫用抗原として用い、Balb/cマウス（雌 ６週齢）に以下のようにして免疫を行なった。
【００８８】
上記conjugateをクリーンベンチ内でＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant；三菱ヤトロン社、コードRM606-1）と混合し、マウスフットパッドに１００μｌずつ、計３回免疫した。
【００８９】
抗体価の上昇の確認は、マウス眼窩静脈叢より採血を行ない、通常のＥＬＩＳＡ法でＮＣ５ペプチドに対する抗体価の測定をすることにより行なった。ＥＬＩＳＡ法は以下のようにした。ＮＣ５ペプチドをＰＢＳにて５μｇ／ｍｌになるように調製した。上記ＮＣ５ペプチドを９６穴ウェルプレートに５０μｌ注入した。上記ウェルプレートを４℃、一晩で静置後、０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（「ＰＢＳ−Ｔ」）でプレートを３回洗浄した。ウェルプレートの全ウェルに２％ゼラチンを含むＰＢＳを１５０μｌずつ加えた。上記ウェルプレートを室温で１時間静置して、ブロッキングを行なった。採取した血清をＰＢＳで１／１００希釈し、１／１００から４倍連続希釈を７回繰り返し、１サンプルにつき抗血清希釈液を８種類用意した。また陰性対照として、未免疫マウスの血清も同様にして試験に用いた。ブロッキング後の各ウェルに、連続希釈した血清を５０μｌずつ加え、室温で１時間、静置した（一次反応）。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで1/1000希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（ＩＣＮ社 コード６７４２９）を各ウェルに５０μｌずつ加えた。室温で１時間、静置を行なった（二次反応）。ウェルプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢ基質（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine、入手先：ＫＰＬ,Gaithersburg, MD, USA）を各ウェルに１００μｌずつ加え、３０分間静置後にプレートリーダー（波長４５０ｎｍ）で吸光度を測定した。
【００９０】
＜細胞融合＞
抗体価が上昇したマウスから脾臓を摘出し、マウスリンパ節細胞（１×１０８個）とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１；２×１０7個）との細胞融合を行なった。上記細胞融合の方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、和光純薬工業株式会社 コード162-09115）を使って行なう通常の方法で行なった。その後、ＨＡＴ選択、スクリーニング、およびクローニングを繰り返し、表１に示す８個の抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞を確立した。
【００９１】
確立したモノクローナル抗体のアイソタイプの決定を、アイソタイピングキット（Iso StripTMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Roche 1493027)）を用いて行なった。その方法は、添付のマニュアルに準じて行なった。その結果を表１に示した。
【００９２】
【表１】
【００９３】
＜ＮＣ５ペプチド以外のペプチドおよびタンパク質との交差反応性試験＞
上記で得られた抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞のうちの５クローン（５Ａ２株、６Ａ２株、２Ｂ８株、３Ｆ４株、および４Ｈ６株）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。ペプチドおよびタンパク質には、ＮＣ５ペプチド、Keyhole Lympet Hemocyanine（図１５および図１６では「ＫＬＨ」と表記する）、ヒト血清アルブミン（図１５および図１６では「ＨＳＡ」と表記する）、ウシ血清アルブミン（図１５および図１６では「ＢＳＡ」と表記する）、ヒト-γ-グロブリン（図１５および図１６では「Human-γ-globlin」と表記する）、ヒトヘモグロビン（図１５および図１６では「Human-hemoglobin」と表記する）、TP41-1 peptide（ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ：21mer：配列番号１６、図１５および図１６では「TP41-1」と表記する）、RT-1 peptide（ＫＬＬＲＧＴＫＡＬＴＦＶＩＰＬＴＥＥＡＥ：配列番号１７、図１５および図１６では「RT-1」と表記する、）を用いた。なお上記RT-1 peptideは、エイズウイルスの逆転写酵素の部分ペプチドである。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ法は以下のようにして行なった。上記ペプチドおよびタンパク質がそれぞれＰＢＳで５μｇ／ｍｌとなるようにサンプルを調製し、９６穴のウェルプレートに２００μｌずつ入れ、コーティングを行なった。またペプチドおよびタンパク質をコートせずにＥＬＩＳＡ法を行なった場合を陰性対照とした（図１５および図１６では「（−）」と表記する）。細胞の培養上清はＰＢＳ−Ｔで１／２希釈し、一次反応に用いた。２次抗体として、AP-F(ab’)2 Rabbit anti Mouse IgGAM(H+L)、（入手先：Zymed 61-6322 Lot.11167841R）を５００倍希釈して用いた。その他の操作は、既述のＥＬＩＳＡ法に準じて行なった。
【００９５】
その結果を図１５および１６に示す。図１５には、５Ａ２株（同図中「５Ａ２」で示す）、６Ａ２株（同図中「６Ａ２」で示す）、および陰性対照として各モノクローナル抗体の培養に用いた培養前の培地（同図中「陰性対照（培地）」で示す）について、交差反応性試験を行なった結果を示した。また図１６には、２Ｂ８株（同図中「２Ｂ８」で示す）、３Ｆ４株（同図中「３Ｆ４」で示す）、および４Ｈ６株（同図中「４Ｈ６」で示す）について交差反応性試験を行なった結果を示した。上記の交差反応性試験の結果、ＮＣ５ペプチド以外の基質に対して非特異的な結合が若干観察されたが、抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞によって産生されるいずれのモノクローナル抗体もＮＣ５ペプチドに対して高い特異性を有しているということがわかった。
【００９６】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞の培養＞
抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｉ−２５１０）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５．５％の条件で、１〜５×１０７cellsが得られるまで培養された。上記培養によって得られた細胞を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離して、当該細胞を回収した。培養培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳで上記細胞を懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離を行なった。上清をアスピレーターにて吸引除去後、再度１０ｍｌのＰＢＳで懸濁した後、血球計算盤を使用して細胞数をカウントした。
【００９７】
カウント後、１〜５×１０７cells分の細胞懸濁液を取り、１，４００ｒｐｍで６分間、遠心分離を再度行ない、上清を除去した。さらに、ペーパータオル上で逆さにし、完全にＰＢＳを除去した。この時アスピレートが不十分であれば、再度遠心分離を行ない、マイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【００９８】
＜ｍＲＮＡの抽出と精製＞
ｍＲＮＡの抽出は、QuickPrepTM mRNA purirfcation Kit（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製）を用い、上記キットの推奨プロトコールに準じて行なった。以下にその方法を示す。
【００９９】
ｍＲＮＡの抽出は、予め３７℃のインキュベーターに３０分間ほど静置して結晶を完全に溶解させた１．５ｍｌのExtraction bufferを、上記にて回収した細胞（ペレット）に添加し、２１Ｇの注射針に数回通すことによって、細胞を破砕した。その細胞破砕溶液に、３ｍｌのElution bufferを加え、更に細胞を破砕した。得られた細胞破砕溶液を、RNease freeの１．５ｍｌ容マイクロチューブ４本に分注し、室温（２５℃）、１８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行なって、oligo(dT)-cellulose spin columnに供するサンプルを調製した。
【０１００】
ｍＲＮＡの単離は、まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌ容 遠心チューブにセットし、１,３００ｒｐｍで２分間（樹脂が乾燥しすぎないように１分４５秒で遠心分離機を止めた）遠心分離を行なって、カラム内の保存液の除去を行なった。その後、下キャップをカラムに取り付けた。除タンパクおよび除ＤＮＡ処理を行なったサンプル（上清）４ｍｌをカラムに添加し、上キャップをカラムに取り付け、樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間、転倒混和を行なうことによって、樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップをカラムに装着したまま、１,４００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離を行なった後、上キャップをはずし、上清をRNase freeのマイクロピペットを使用して除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、２分間ほど緩やかに混和した後、上キャップをカラムに装着し、１,４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なって上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返した。
【０１０１】
次に３ｍｌのLow-salt bufferをカラムに添加して約１〜２分間 穏やかに懸濁後、上キャップを装着し１５ｍｌ容 遠心チューブに入れ、１,４００ｒｐｍで２分間 遠心分離を行なって上清を除去した。その後、下キャップも取り外し、３ｍｌのLow-salt bufferを樹脂表面が平らになるように壁面に添わせながら添加した後、１５ｍｌ容 遠心チューブにカラムを設置し１,３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。
【０１０２】
次に新しい１５ｍｌ容 遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌ容マイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、１５ｍｌ容 遠心チューブに重ねて入れることによって溶出用チューブを作製した。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱した０．２５ｍｌのElution bufferを添加し、１,３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。この操作を２回繰り返し、溶出液をｍＲＮＡ画分として回収した。回収したｍＲＮＡ画分を氷上に静置した。１０μｌのｍＲＮＡ画分に対して、７０μｌ Elution bufferを加えて８倍希釈し、Elution Bufferを吸光度ブランクとしてＡ２６０（ＲＮＡ）、Ａ２８０（タンパク質）を測定した。なお吸光度の測定には、塩酸：メタノール＝1：1の溶液に１時間ほど浸漬することによってRNease freeにした後、ＤＥＰＣ処理水（Dietyl Pyrocarbonate 処理水）で洗浄したセルを使用した。またＲＮＡ濃度は、Ａ２６０×希釈率４０μｇ／ｍｌで算出した。
【０１０３】
また、回収したｍＲＮＡ画分に１／１０量の３Ｍ 酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２．５倍量の９５%エタノールを加えて混合した。上記混合液を−３０℃に約４０分間置き、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行なった後、−８０℃で保存した。
【０１０４】
なお、２４０℃で２時間乾熱滅菌がなされたガラスおよび金属類、並びにRNase and DNase freeのプラスチック類を、上記ｍＲＮＡの調製において使用した。
【０１０５】
＜ｍＲＮＡからのFirst strand cDNAの合成＞
−１３０℃でエタノール沈殿の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、マイクロピペットで上清を除去した。その後、１ｍｌ冷７５％エタノール（当該冷７５％エタノールは予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃に保存したもの）を、マイクロチューブに対してペレットの無い方から穏やかに添加してリンスを行なった。次に上記マイクロチューブを、４℃、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行ない、ＲＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し、１時間静置してＲＮＡを溶解した。溶解後、確認の為にｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し、吸光度を測定した。
【０１０６】
ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （インビトロジェン社製）を用い、当該キットのプロトコールに準じて行なった。以下に方法を示す。キットを−８０℃より取り出し、各試薬を氷上で溶解し、よく混合した。RNase freeの０．２ｍｌ容マイクロチューブに、ｍＲＮＡ２μｇ相当のｍＲＮＡ溶液を添加した。上記マイクロチューブにpd(T)12〜18primer（０．５μｇ／ｍｌ）を２ｍｌ添加し、１７μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水でメスアップした。上記溶液を混合後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行なった。その後、氷上にマイクロチューブを置き、０．２５Ｍ ＤＴＴを１μｌ、Rnase inhibitor を１μｌ、および５×Reaction buffer ５μｌをマイクロチューブへ添加し、よく混合した。さらに、AMV-RT １μｌをマイクロチューブへ添加し緩やかに混合した後、４１℃で６０分間伸長反応を行なった。６０分間経過後、氷上にマイクロチューブを置くことで伸長反応を停止し、その後マイクロチューブは−３０℃に保存された。
【０１０７】
＜ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅＞
Mouse Ig primer Kit（Novagen社製）、およびNovaTaqTMHot Start DNA Polymerase Kit(Novagen社製)を使用し、上記にて得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子の可変領域の増幅を行なった。
【０１０８】
まず抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Master mix（３７．２５μｌ 滅菌超純水、０．５μｌ 3’-Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌ １０ｍＭ dNTPs（最終濃度 ０．２ｍＭ）、５μｌ １０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、および０．２５μｌ NovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）を混合した溶液を準備し、陽性対照、陰性対照、およびプライマーの本数分準備したＰＣＲチューブに当該溶液を４７μｌずつ分注した。上記ＰＣＲチューブに、１ｍｌ 5’-Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、および２ｍｌ ｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、上記陽性対照として Mouse Ig primer Kitに付属にものを使用し、陰性対照として滅菌超純水を使用した。
【０１０９】
上記ＰＣＲチューブ内の溶液をよく混合し、Biometra社 T-GRADIENT、TaKaRa社 PCR Thermal cycler PERSONALを使用してＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応条件として、軽鎖は９５℃ ７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃ １５秒間、伸長反応を７４℃ １５秒間とし、アニーリングは７０℃→６６℃→６２℃→５８℃→５４℃→５０℃と６段階で４℃ずつ下げるStep Down法を採用し１５秒間行なった。上記の熱変性、伸長反応、およびアニーリングのステップを、アニーリング温度が５４℃になるまでは、３サイクルずつ行ない、アニーリング温度が５０℃の反応を１０サイクル行なった。一方、重鎖は９５℃ １０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃ １分間、アニーリング温度５０℃ ２分間、伸長反応を７２℃ ２分の３ステップを４０サイクル行なった後、７２℃の伸長反応を１０分間行なった。上記ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動により、各抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【０１１０】
＜TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社製）によるクローニング＞
以下のようにして、クローニングを行なった。
【０１１１】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物２μｌ、Salt Solution １μｌ、およびSterile Water ２μｌを、氷上にてＰＣＲチューブに分注し、混合した。さらに上記ＰＣＲチューブに、TOPO vector １μｌを添加して緩やかに混合後、当該ＰＣＲチューブ内の溶液を３０分間、室温でライゲーション反応させた。３０分後、直ちにＰＣＲチューブを氷上に置き、反応を停止させた。
【０１１２】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（インビトロジェン社製）を取り出して、氷上で溶解した。上記One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliに、氷上に置いていたライゲーション反応液２μｌを加え、氷上で３０分間インキュベーションを行ない、Competent cell間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間ヒートショックを与えてＤＮＡを取り込ませた後、氷上に戻し２分間静置した。あらかじめ室温に戻しておいた２５０μｌのSOC mediumをクリーンベンチ内で上記ＤＮＡ溶液に対して加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【０１１３】
この間に、予め準備しておいたAmpicillin/LB plate １枚に対して、１００μｌの１００ｍＭ IPTG stockと、２０μｌのX-Gal ５０ｍｇ／ｍｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。感想終了後、Ampicillin/IPTG/X-Gal/LB plateに、大腸菌液（５０μｌまたは１００μl）を塗り広げ、３７℃で一晩培養を行なった。
【０１１４】
形質転換後の青／白判定により、ＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー程度選択し、偽陽性を除くため、更に画線培養を行なった。画線培養では、形質転換と同様にAmpicillin/IPTG/X-Gal/LB plateを使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養を行なった。
【０１１５】
各コロニーにＤＮＡ断片が挿入されていることを確認の後、プラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
【０１１６】
形質転換体の培養液から０．７５ｍｌの培養液を取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合して−８０℃にストックし、残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌ容 マイクロチューブ６本に移し、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行なって集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。上記マイクロチューブにSolution I（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加え、ボルテックスミキサーにかけてよく懸濁した。
【０１１７】
次に上記マイクロチューブにSolution II（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、当該マイクロチューブを氷中に５分間置き、Solution III（３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ＭＣＨ３ＣＯＯＨ）を１５０μｌ加えて緩やかに混合した後、当該マイクロチューブを氷上に５分間置いた。
【０１１８】
そして、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り（この時採取量を把握しておく）、新しい１．５ｍｌ容 マイクロチューブに移し、等量のフェノール・クロロホルムを加えて混合した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行なった。さらに上記作業を繰り返して合計２回のフェノール・クロロホルム処理を行なった後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移し、２倍等量の冷エタノール １ｍｌを加えて上下に振って混合した後、−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５，０００回転で１０分間遠心分離を行なった後、上清を除去した。そして７０％冷エタノールを１ｍｌ加えてペレットをリンスし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、上清を除去した後、１５分間真空乾燥を行なった。
【０１１９】
真空乾燥終了後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）４５μｌでペレットを溶解し、RNase A溶液（５ｍｇ／ｍｌ Rnase A、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５μｌをマイクロチューブへ加えた（終濃度：５０μg／ｍｌ）。マイクロチューブ２本分の溶液を、１本のマイクロチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【０１２０】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）をマイクロチューブへ添加し、当該マイクロチューブを氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。上記マイクロチューブへ、７０％エタノール １ｍｌを加えてリンスし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった。上記遠心分離の上清を除去した後、真空乾燥を行なった。真空乾燥後、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水を添加してサンプルを溶解してプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推定した。
【０１２１】
＜塩基配列の決定＞
Thermo SequenaseTMCyTM5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて、塩基配列の決定を行なった。Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、およびＴ（チミン）の４種類の塩基用に、ＰＣＲチューブを用意し、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分、１μｌずつ分注した。
【０１２２】
次に、ＤＮＡ／プライマーミックスの調製を行なった。前項で調製された１．５μｇのＤＮＡ、３．５μｌのReaction Buffer、１μｌのTOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）(Invitrrogen)、および２μｌのThermo Sequenase（１０Ｕ／μｌ）を混合し、さらに滅菌超純水を添加して全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記のＰＣＲチューブに７μｌずつ分注し、すみやかにBiometora社 サーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行ない、４℃で冷却し反応を停止させた。
【０１２３】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加し、よく混合した。１０分間氷上で静置した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、ペーパータオル上でデカンテーションにより上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、その後、マイクロピペットを使用し、上清を丁寧に除去した。そして、遮光してペレットを乾燥させ、６μｌのLoading Dyeに溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行ない、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μlずつローディングし、解析を行なった。得られた塩基配列は、ＤＮＡＳＩＳソフトウェアを使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【０１２４】
＜抗体可変領域の立体構造予測＞
上記にて決定した塩基配列から推測した抗体可変領域のアミノ酸配列をもとに、ソフトウェアAbM (Oxford Molecular社製、 Oxford、UK)を用いて、目的抗体のＣＤＲ領域のループ構造およびＦＲ領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、ソウトウェアInsightII/Discover3 (Molecular Simulatoin社製、USA)により分子間力計算を行ない、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１２５】
さらに、ソフトウェア PPC Protein AdviSer（富士通九州システムエンジニアリング）を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼの活性部位を構成する触媒三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２、および２Ｂ８の３種類の抗体軽鎖（Ｌ鎖）はいずれも触媒三つ組み残基構造を有していた（図１〜３参照）。なお図の見方については、「発明を実施するための最良の形態」の項で既に述べたとおりである。
【０１２６】
発明者らによるこれまでの多くの研究（Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005).）から、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２、および２Ｂ８は、抗体酵素である可能性が示唆された。そこで、上記３つの抗ＮＣ５モノクローナル抗体について、重鎖（Ｈ鎖）軽鎖（Ｌ鎖）の抗原分解能の有無について検討することとした。
【０１２７】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体の大量取得と精製＞
上記３つの抗ＮＣ５モノクローナル抗体の大量調製は、あらかじめプリスタン（2,6,10,14-tetramethylpentadecane）が投与されたBalb/cマウスに、各抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞 ０．５×１０６個投与し、当該マウスから腹水を採取することによって行なった。上記のようにして取得した各抗ＮＣ５モノクローナル抗体を以下の方法で精製し、目的の実験に用いた。
【０１２８】
（１）塩析
腹水約８ｍｌを同量のＰＢＳで希釈後、濾過してフィブリンを除去した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１２９】
（２）カラム精製
透析終了後、抗体の精製を行った。操作はMAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）の説明に従い、４℃で行なった。使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１３０】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。不溶物が認められる時には濾紙で濾過して取り除いた。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution buffer、並びにサンプル（上記腹水の濾液）を脱気した。
【０１３１】
キットに含まれるアフィゲルプロテインＡ（BIO-RAD社 商品名）を充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１３２】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが安定したら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡ（BIO-RAD社製）に結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）はＰＢＳに対して２回透析された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD社製）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）で凍結保存した。
【０１３３】
＜抗ＮＣ５抗体重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の分離精製＞
（１）限界ろ過
上記精製した抗体溶液（タンパク質５ｍｇ分）を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２回透析した。透析終了後の抗体溶液をセントリプレップ−１０（ミリポア社製）を用い、４℃、２,８００ｒｐｍで遠心し、約１ｍｌになるまで限外ろ過濃縮を行なった。上記抗体溶液に対して、５ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び限外ろ過濃縮を行なった。上記操作を再度行なった後、５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、当該抗体溶液を褐色瓶に入れた。上記抗体溶液は、以下の実験に使用するまで低温下で保存された。
【０１３４】
（２）重鎖・軽鎖抗体の分離
５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）、１Ｍ Tris solution、および抗体溶液２．７ｍｌをそれぞれ脱気した。2-ME(メルカプトエタノール)と５０ｍＭ Tris-HCl＋０．１５Ｍ NaCl buffer（ｐＨ８．０）とを抗体溶液に加え、ピペッティングによって溶液を軽く混合しつつ、１Ｍ Tris solutionでｐＨ８．０に調整した後、反応容器内に窒素を封入した。インキュベーター内で、１５℃、３時間スターラーで撹拌しながら還元反応を行なった。脱気後の０．６Ｍ ヨードアセトアミド ６００μｌを抗体溶液に対して加え、混合した。上記抗体溶液のｐＨを、１Ｍ Tris solutionでｐＨ８．０に調整した。１５℃で１５分間撹拌しながらアルキル化反応を行なった。ディスクフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を使用し、抗体溶液の除粒子を行なった。上記抗体溶液を、セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌになるまで、限外ろ過濃縮を行なった。
【０１３５】
＜サイズ排除ＨＰＬＣによる抗ＮＣ５モノクローナル抗体重鎖および軽鎖の精製＞
重鎖および軽鎖の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー(JASCO,PU-2080 Plus)、カラム(Waters,Protein-PakTM300SW,7.5 × 300 mm Column)を使用して行なわれた。移動相に用いる６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ６．５）、流速０．１５ｍｌ/分でカラムの平衡化を行なった(120 分間程度)。抗体溶液のサンプルを２〜３回に分けてカラムへインジェクションした。クロマトグラムを参照しながら、重鎖および軽鎖をそれぞれ分取した。取得した重鎖および軽鎖のサンプルそれぞれをＰＢＳに対して透析し、重鎖および軽鎖をRefoldingした。重鎖および軽鎖のサンプルのバッファーを１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。重鎖および軽鎖のサンプルについてＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD社製）で重鎖および軽鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して当該サンプルを４℃で保存した。
【０１３６】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討＞
天然型抗体酵素の特徴は、その抗体自身が標的となるタンパクを特異的に完全分解することである。しかし、ペプチド基質を用いて抗体酵素の分解活性を検討する場合には、非特異的に反応するということが知られている。そこで、これまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性の検討によく用いられてきたペプチドTP41-1 peptide(ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ：21mer：配列番号１６)を使用して該抗体が該ペプチド分解能を有するか検討した。なお、マウスの免疫に用いた抗原ペプチドは水に難溶性であったため、ペプチダーゼ活性の検討の基質として用いることはできなかった。
【０１３７】
（１）実験方法
まずクリーンベンチ内で、２４０μＭのTP41-1 peptide 溶液（１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）を調製し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行なった。試験管内でTP41-1 peptide 溶液と１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）とを１:１となるように混合したものをコントロール溶液とした。上記のようにして調製した各反応溶液は以下の通りである。
反応液(1)０．８μＭ 軽鎖＋TP41-1 peptide溶液 ・・・６００μｌ作製
反応液(2)０．４μＭ 重鎖＋TP41-1 peptide溶液 ・・・６００μｌ作製
反応液(3)コントロール溶液 ・・・５００μｌ作製
反応は、２５℃で行なわれた。
【０１３８】
また反応の分析はＨＰＬＣ（puresil C18、Waters社）を使用した。ＨＰＬＣの測定条件として、カラムオーブンは４０℃、溶離液は０．０８％ ＴＦＡ、１３％アセトニトリル、超純水を使用した。各反応液をクリーンベンチ内で３０μｌ回収し、当該反応液を０．４５μｍのフィルターに通し、さらに１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離後のものをサンプルとして、ＨＰＬＣに供した(サンプルのインジェクション量２０μl)。
【０１３９】
（２）結果
上記試験の結果を示すべく、反応基質（TP41-1 peptide）の経時変化を図５〜８に示した。図５は抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の結果を示し、図６は抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の結果を示し、図７は抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の結果を示し、図８は抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の結果を示している。また各図において、丸のシンボルは上記反応液(1)の結果を示し、四角のシンボルは上記反応液(2)の結果を示し、三角のシンボルは上記反応液(3)の結果を示している。
【０１４０】
図５によれば、反応液(1)の場合に、約２５時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約９６時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１１に示す。
【０１４１】
また図６によれば、反応液(1)の場合に、約５０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約１２０時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１２に示す。
【０１４２】
したがって、図５および６の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖は、TP41-1 peptideを再現性良く分解することができるということが分かった。
【０１４３】
また、図７によれば、反応液(1)の場合に、約２０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約７０時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。また反応液(2)の場合において、TP41-1 peptideの分解が若干確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１３に示す。
【０１４４】
したがって、図７の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖は、TP41-1 peptideを分解することができるということが分かった。
【０１４５】
また、図８によれば、反応液(1)の場合に、約５０時間の誘導期を経た後にTP41-1 peptideの分解が確認され、約１４２時間後にTP41-1 peptideの完全分解が確認された。反応液(3)（コントロール溶液）の結果と反応液(1)の結果とを比較すると、明らかにTP41-1 peptideが分解しているということが分かる。この時、ＨＰＬＣによりTP41-1 peptideの分解反応を追跡した結果を図１４に示す。
【０１４６】
したがって、図８の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖は、TP41-1 peptideを分解することができるということが分かった。
【０１４７】
上記の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２、６Ａ２および２Ｂ８の軽鎖は、いずれもペプチダーゼ活性を有するものであるということが分かった。
【０１４８】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体における動力学的解析＞
（１）方法
抗ＮＣ５モノクローナル抗体の動力学的パラメーターを求めるにあたり、当該抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖は、２相性の曲線を描きながら基質（TP41-1 peptide）を分解するため、分解初速度を求めるのは困難である。そこで、一度完全に基質（TP41-1 peptide）を分解した反応液に再びペプチドを添加して反応させることによって、誘導期が存在しない条件で動力学的パラメーターの解析を行なった。
【０１４９】
分解初速度を用いて、各種動力学的パラメーターを求めた。分解初速度は、当該抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖の濃度を０．４μＭ一定としつつ、基質濃度を変化させることによって算出した。算出された分解初速度をMichaelis-Menten式に当てはめ、以下に示す動力学的パラメーターを算出した。
【０１５０】
（２）結果
図１７には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果（抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖）を示す。図１７（ａ）は、基質（TP41-1 peptide）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１７（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１５１】
上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出された抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖の動力学的パラメーターは、以下の通りであった。
Ｋｍ＝１．７×１０−６（Ｍ）
ｋcat＝１．４×１０−１（ｍｉｎ-1）
ｋcat/Ｋｍ＝８．５×１０４（Ｍ−１ｍｉｎ−1）
また図１８には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果（抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖）を示す。図１８（ａ）は、基質（TP41-1 peptide）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１８（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１５２】
上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出された抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖の動力学的パラメーターは、以下の通りであった。
Ｋｍ＝１．１×１０−５（Ｍ）
ｋcat＝６．１×１０−１（ｍｉｎ-1）
ｋcat/Ｋｍ＝５．７×１０４（Ｍ−１ｍｉｎ−1）
以上の結果より、上記抗体軽鎖によるペプチド基質の分解反応は酵素反応であるということが分かった。
【０１５３】
＜抗ＮＣ５モノクローナル抗体の軽鎖とＣＣＲ５との反応性＞
（１）方法
抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖と反応基質(TP41-1 peptide)とをあらかじめ反応させた後、MOLT-4/CCR5破砕液（「MOLT-4/CCR5」については「MASANORI BABA,HIROSHI MIYAKE,MIKA OKAMOTO,YUJI IIZAWA,and KENJI OKONOGI”Establishment of a CCR5-Expressing T-Lymphoblastoid Cell Line Highly Susceptible to R5 HIV Type 1”AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES Volume 16,Number 10,2000,pp.9350941」参照）を上記反応液に対して、体積比で反応液：破砕液＝４：１となるように添加した。上記反応液を２５℃のインキュベーターに入れ、反応を開始した。反応開始後０、６、１２、２４、および４８時間後の反応液を採取した。
【０１５４】
全サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％Running Gel、３％ Stacking Gel）に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっている間に、ウエスタンブロッティングで用いる冷水とろ紙２枚、Immobilion-P（ミリポア社製、Cat.no IPVH0010 Lot.no K4DN9499W）１枚、ブロッティングバッファー（２５ｍＭ Tris、１９２ｍＭ Glycine、０．１％ ＳＤＳ）を用意しておき、Immobilion-Pとろ紙とはゲル大に切り取っておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了１５分前に、Immobilion-Pをメタノールに２０秒間浸漬した後、ブロッティングバッファーに１０分間以上浸漬した。パッド、ろ紙も同様にブロッティングバッファーに浸漬しておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルをブロッティングバッファーに５分間浸漬しておいた。ブロッティング装置のマイナス側電極板の上にパッド２枚、ろ紙、Immobilion-P、ゲル、ろ紙、パッド２枚、プラス電極板の順で重ね、泳動槽の中に入れた。陽極板と陰極板の間にブロッティングバッファーをパッドが浸るまで注入し、外側に冷水を泳動槽の上端から１ｃｍ位の所まで入れた。ブロッティング装置に対して通電（１８０ｍＡ、３０Ｖ）し、９０分間ブロッティングを行なった。
【０１５５】
ブロッティング終了後、Immobilion-Pを３％ skim milk/TBS-Tで、１時間ブロッキングを行なった。RABBIT ANTI HUMAN CCR5（SEROTEC社製、 Catalog Number AHP568 Lot.220501）が最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加された３％ skim milk/TBS-Tへ、Immobilion-Pを浸漬し、１時間反応させた（一次反応）。一次反応終了後のImmobilion-P をTBS-Tで軽く洗浄後、３％ skim milk/TBS-Tで５分間×３回洗浄を行なった。
【０１５６】
３％ skim milk/TBS-Tで１０００倍希釈したalkaline phosphatase conjugated goat affinity purified F(ab’)2 fragment to Rabbit IgG(whole molecule)（Cappel社製、Catalog Number 59306 Lot.00852）溶液に、洗浄後のImmobilion-Pを浸漬し、１時間反応させた（二次反応）。二次反応終了後のImmobilion-P をTBS-Tで軽く洗浄後、３％ skim milk/TBS-Tで５分間×３回洗浄を行なった。陽性バンドをBCIP/NBTで検出を行なった（検出時間２０分間）。検出された陽性バンドの濃さを、NIH Image（米国 ＮＩＨより入手）で数値化し、グラフ化した。
【０１５７】
（２）結果
図９にウェスタンブロットの結果を示した。同図中、上部に「MOLT-4/CCR5」を付したものは、比較として抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合の結果であり、「５Ａ２」を付したものは、抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果であり、「２Ｂ８」を付したものは、抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果である。また同図中、上部に「０」、「６」、「１２」、「２４」、「４８」を付したものは、「反応開始０時間後の反応液」、「反応開始６時間後の反応液」、「反応開始１２時間後の反応液」、「反応開始２４時間後の反応液」、「反応開始４８時間後の反応液」をそれぞれ示している。なお、同図中「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【０１５８】
また図１０は、図９におけるバンドの濃さをNIH Imageで数値化し、グラフ化したものであり、反応基質であるMOLT-4/CCR5濃度（相対値）の経時変化を示している。図１０中、四角のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果を示し、ひし形のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果を示し、丸のシンボルは抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果であり、三角のシンボルは比較として抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合の結果である。
【０１５９】
図９および図１０の結果から、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合と、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合とを比較すると、後者の場合にMOLT-4/CCR5の減少が確認された。特に抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合に、MOLT-4/CCR5の顕著な減少が確認された。
【０１６０】
以上の結果より、抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖は、ケモカインレセプターＣＣＲ５を切断する抗体酵素であるということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
エイズウイルスがヒトに感染する場合には、ウイルス側に存在するｇｐ１２０やｇｐ４１や、ヒトの細胞側に存在するＣＤ４およびケモカインレセプターＣＣＲ５が重要な役割を果すこと、および、ケモカインレセプターＣＣＲ５が正常でない場合は、エイズウイルスの感染が成立しないことが知られている。
【０１６２】
本発明にかかる抗体酵素は、上述のようにＣＣＲ５に対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、ＨＩＶの感染の予防やエイズの治療のための抗ＨＩＶ薬剤として有用である。本発明の抗体酵素は、ＣＣＲ５の働きを抑制するという従来の抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる新しい作用機構でＣＣＲ５を破壊するものであるため、現在有効な治療法が見出されていないエイズの治療に有効利用できることが期待される。またエイズに関する研究用ツールとしても利用可能である。
【０１６３】
したがって、本発明は、医療、医薬品産業、試薬産業、等に利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図２】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図３】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図４】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図５】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図６】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図７】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図８】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示す折れ線グラフである。
【図９】抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖とＣＣＲ５との反応性を検討するために行なった、ウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１０】抗ＮＣ５モノクローナル抗体（５Ａ２、６Ａ２、２Ｂ８）の軽鎖とＣＣＲ５との反応性を検討した結果を示す折れ線グラフである。
【図１１】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.１）の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１２】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２（Lot.２）の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１３】抗ＮＣ５モノクローナル抗体６Ａ２の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果示すチャート図である。
【図１４】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった際のTP41-1 peptideの分解反応をＨＰＬＣにより追跡した結果を示すチャート図である。
【図１５】抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（５Ａ２および６Ａ２）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた結果を示す棒グラフである。
【図１６】抗ＮＣ５モノクローナル抗体産生細胞（２Ｂ８、３Ｆ４、および４Ｈ６）の培養上清を用いて、ＮＣ５ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた結果を示す棒グラフである。
【図１７】抗ＮＣ５モノクローナル抗体５Ａ２の軽鎖による基質（TP41-1 peptide）酵素分解実験における速度論的解析結果を示し、図１７（ａ）は、基質濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１７（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【図１８】抗ＮＣ５モノクローナル抗体２Ｂ８の軽鎖による基質（TP41-1 peptide）酵素分解実験における速度論的解析結果を示し、図１８（ａ）は、基質濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１８（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体または抗体断片であり、
当該ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、かつ、
当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解する活性を有することを特徴とする抗体酵素。
【請求項２】
上記抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体の可変領域を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素。
【請求項３】
上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１または２に記載の抗体酵素。
【請求項４】
上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列、または
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項５】
上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列、または、
配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項６】
上記抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列、または、
配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか１項に記載の抗体酵素をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号２に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号６に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項１０】
配列番号１０に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項７ないし１０の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１】
ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体または抗体断片であり、
当該ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域と特異的に結合し、かつ、
当該ケモカインレセプターＣＣＲ５を分解する活性を有することを特徴とする抗体酵素。
【請求項２】
上記抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ５のＮ末端領域に対する抗体の可変領域を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素。
【請求項３】
上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１または２に記載の抗体酵素。
【請求項４】
上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列、または
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項５】
上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列、または、
配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項６】
上記抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列、または、
配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか１項に記載の抗体酵素をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号２に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号６に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項１０】
配列番号１０に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項７ないし１０の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００７−２０２４４３（Ｐ２００７−２０２４４３Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３６３８（Ｐ２００６−２３６３８）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]