新規な光学活性カルボン酸の製造法
下記一般式（Ｉ）
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する（式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す。
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する（式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られる培養液を用いて、４−ハロクロトン酸誘導体の炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元して、医薬、農薬等の中間体原料として有用な化合物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する方法に関する。本発明はまた、該４−ハロ酪酸誘導体の製造方法を利用した、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性４−ハロ酪酸誘導体は医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である。例えば、（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸（２Ｒ−メチル−４，４，４−トリフルオロブタン酸）は、ロイコトリエン拮抗剤として有用な（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンの合成中間体であることが知られている（欧州特許出願公開第４８９５４８号明細書）。光学活性４−ハロ酪酸誘導体を得る方法としては、光学活性ホスフィン化合物とルテニウム化合物からなる錯体触媒を用いて４−ハロクロトン酸誘導体を還元する方法が知られていた（欧州特許出願公開第６７３９１１号明細書）。しかし、かかる反応は高圧下で行う必要があり、用いる触媒も高価であった。
【０００３】
エノエートレダクターゼは、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合を還元する反応を触媒する酵素であるが、例えば、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）などの微生物でその存在が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．８，ｐ５７７９−５７８７，２００１）。エノエートレダクターゼ活性を有する微生物を利用した各種エノエートの不斉還元が報告されているが（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２０，８１７，１９９８）、エノエートのうち、４位の炭素がハロゲン化された４−ハロクロトン酸誘導体に関しては、エノエートレダクターゼを用いた不斉還元の報告例は無かった。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、光学活性４−ハロ酪酸誘導体をより高い光学純度で安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを課題とする。本発明はまた、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、原料となる４−ハロクロトン酸誘導体の不斉還元反応を触媒することを見出した。さらに、該タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を作製し、該細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、原料となる４−ハロクロトン酸誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を得ることができることを見出した。さらに、この方法によって得られる（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を用いることにより、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを効率よく製造できることを見出した。以上によって、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）下記一般式（Ｉ）
【化１】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法（式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す）。
（２）エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、（１）の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（３）エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、（１）の製造方法。
（４）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（５）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（６）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（７）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒがメチル基であり、Ｘ、Ａ１およびＡ２がそれぞれフッ素原子であることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかの製造方法。
（９）（８）の方法により一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸を一般式（ＩＩ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸に変換する工程、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＩＩ）で表される化合物を反応させて、一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程を含む、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法．
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
＜１＞光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法
本発明においては、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【化４】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に作用させることにより、該化合物の炭素・炭素二重結合を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【化５】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する。
【０００８】
上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）において、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す。
【０００９】
ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。また、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
【００１０】
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、前記不斉還元反応に悪影響を与えない基であれば特に限定されないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。また、置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００１１】
Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示すが、これらのハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。Ｘ、Ａ１、Ａ２の全てがフッ素原子であることが特に好ましい。
【００１２】
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のＲとしては、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基である。
【００１３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、例えば一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸等が挙げられる。上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、下記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるアルデヒド（Ｘ、Ａ１、Ａ２は前記と同様の置換基を示す）を第４版実験化学講座（１９巻、ｐ６２、１９９２年）記載の方法により所望の安定化イリドとＷｉｔｔｉｇ反応を行い、得られた不飽和エステルを加水分解することにより容易に合成することができる。
【００１４】
【化６】
【００１５】
また、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物として、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、一般式（ＩＶ）の（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸等が挙げられる。
【化７】
【００１６】
エノエートレダクターゼは一般に、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいう（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２０，ｐ８１７，１９９８）が、本発明においては、４−ハロクロトン酸誘導体の炭素・炭素二重結合を不斉還元して光学活性な４−ハロ酪酸誘導体を生成する活性を有することのできるタンパク質をいう。ここで、生成する４−ハロ酪酸誘導体の光学純度は、６０％ｅ．ｅ．以上であることが好ましく、９０％ｅ．ｅ．以上であることがより好ましく、９８％ｅ．ｅ．以上であることがさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．であることが特に好ましい。このような活性は、４−ハロクロトン酸誘導体を基質として含有し、さらにＮＡＤＨを補酵素として含有する反応系において、ＮＡＤＨの減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明の製造方法において用いることのできるエノエートレダクターゼは上記活性を有する限り特に制限されないが、例えば、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはそれぞれ、ムーレラ サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼである。
【００１８】
また、本発明においては、これらのホモログであって、前記の酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００１９】
また、前記ホモログは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％、特に好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７１０８６）と５９％の相同性を示し、配列番号４の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７１０８６）と４９％の相同性を示した。また、配列番号２と配列番号４の配列は互いに５０％の相同性を示した。本明細書において、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．はＧｅｎＢａｎｋのものを示す。
【００２０】
本発明の製造法に用いるエノエートレダクターゼは、エノエートレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物からエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、エノエートレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌やムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からエノエートレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．９７，ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００２１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌としては、例えばクロストリジウム アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有しており、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌としては、例えばムーレラサーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有している。前者はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）に記載されており、該ＡＴＣＣから入手できる。また、後者はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）に記載されており、該ＤＳＭＺから入手可能である。
【００２２】
本発明の製造方法においては、４−ハロクロトン酸誘導体をエノエートレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、エノエートレダクターゼを含む細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、４−ハロクロトン酸誘導体に反応させて、光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造してもよい。エノエートレダクターゼを含む細胞としては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００２３】
この場合、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。このようなＤＮＡは配列番号１または配列番号３の塩基配列に基いて設計したプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００２４】
ここで、ホモログとは、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及び素の相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２５】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００２６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、エノエートレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ．１２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００２８】
なおエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００２９】
当業者であれば、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１０，ｐ６４８７（１９８２），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｖｏｌ．１００，ｐ４４８（１９８３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３０】
また、配列番号２または４のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３２】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、エノエートレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換した細胞を培養することにより、エノエートレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００３５】
このとき、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．ｖｏｌ．４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ．８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３６】
本発明のエノエートレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３７】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３８】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００４０】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４１】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４２】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００４３】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４４】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４５】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４６】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュドモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４７】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．１９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５０】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５１】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００５２】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３１５，ｐ５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、反応基質である４−ハロクロトン酸誘導体にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を作用させてもよい。形質転換細胞は、反応液中でそのまま作用させてもよいが、該形質転換細胞の調製物、例えば、該形質転換細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、該形質転換細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを作用させてもよい。本発明の製造方法においてはさらに、前記細胞を培養して得られた培養液、すなわち、前記細胞を含む培養液を、直接用いてもよい。
【００５４】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨを添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋をＮＡＤＨへ再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
（ｉ）宿主微生物自体のＮＡＤ＋還元能を利用する方法、
（ｉｉ）ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または
（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子をエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００５５】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、２−プロパノール、ギ酸などを添加することが好ましい。
【００５６】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のエノエートレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である４−ハロクロトン酸誘導体に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００５７】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５８】
本発明の製造方法は、例えば、反応基質、本発明の形質転換細胞および／または該形質転換細胞調製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。
【００５９】
本発明製造法において反応基質となる一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。
【００６１】
本発明の方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行うことができる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。また、エノエートレダクターゼの酸素による失活を防ぐため、反応液中に亜硫酸ナトリウムを添加したり、反応液を窒素やアルゴンガス等でシールすることにより、酸素の除去を行うことも効果的である。
【００６２】
本発明の方法により生成する光学活性４−ハロ酪酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６３】
＜２＞（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造法
本発明の（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法は、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸に反応させて、一般式（ＩＶ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を生成させる工程（ａ）、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程（ｂ）、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＶＩ）で表される化合物を反応させて一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程（ｃ）を含む。
【００６４】
【化８】
【００６５】
工程（ａ）は上述した方法と同様にして行うことができる。工程（ｂ）はカルボン酸をアミンに変換する通常の方法を使用することができる。例えば、アンモニアと反応させてアミド化した後に還元する方法（下記反応式（ＩＸ））、ベンジルアミン等またはアンモニア等価体（例えば、ＨＮ（ＳｉＭｅ３）２等）と反応させた後に、反応物を還元し、さらに接触水素化分解等により脱保護する方法（下記反応式（Ｘ））などを使用することができる。
【００６６】
【化９】
【００６７】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られる式（Ｖ）の（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンを、式（ＶＩ）の化合物に反応させて、式（ＶＩＩ）の（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを得る。この工程は、通常のアミンとカルボン酸との反応と同様にして行うことができる。具体的には、例えば、欧州特許出願公開第４８９５４７号明細書（特に実施例５）や欧州特許出願公開第４８９５４８号明細書（特に実施例２）に開示されている方法と同様にして行うことができる。また、この工程で使用する一般式（ＶＩ）の化合物はいかなる製法によって得られるものでもよいが、例えば、上記特許公報に開示されているようにして、４−（５−メトキシカルボニル−１−メチルインドール−３−イルメチル）−３−メトキシ安息香酸（一般式ＸＩ）と２−メチルベンゼンスルホンアミド（一般式ＸＩＩ）と反応させ、生じた化合物を加水分解することによって得られる化合物を使用することができる。
【００６８】
【化１０】
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７０】
（１）ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）由来の２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７６０８２，配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ１６１３６，ＲＥＧＩＯＮ：４７．．２０５０，配列番号１）を元に、配列番号５および６のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）ＤＳＭ１９７４のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−１ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７１】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法によって形質転換した。
【００７２】
形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、得られたコロニーについてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＭｔＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。
【００７３】
（２）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
クロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来の２−ｅｎｏａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ８１３０２、配列番号４）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ００７８３４，ＲＥＧＩＯＮ：８５９．．２８５３、配列番号３）を元に、配列番号７および８に記載のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−１ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７４】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後、回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、得られたコロニーについてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＣａＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号３の塩基配列と一致した。
【００７５】
（３）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された大腸菌を用いた（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の合成
上記（１）、（２）で得られた形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で３０時間生育させた。得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌して菌体を得た後、下記に示す方法により、４，４，４−トリフルオロチグリン酸を基質として該菌体のエノエートレダクターゼ活性を確認した。
【００７６】
なお、基質である４，４，４−トリフルオロチグリン酸は以下のようにして合成した。すなわち、４，４，４−トリフルオロチグリン酸エチルエステル（３．６４ｇ、２０ｍｍｏｌ）に５０％含水メタノール（２０ｍＬ）及び８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（３ｍＬ）を加えた後、得られた混合物を約２時間攪拌した。反応混合物は溶媒を減圧留去し、濃塩酸を加えｐＨを２以下に調整した後、塩化メチレン抽出を行い、得られた有機層を減圧濃縮することにより透明油状物として４，４，４−トリフルオロチグリン酸（２．９ｇ、収率９４％）を得た。
【００７７】
前記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭグルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、２５ｍＭ ４，４，４−トリフルオロチグリン酸）を添加した後、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で２０時間反応させた。１０μＬの６Ｎ ＨＣｌを添加して反応を終了し、酢酸エチルで抽出し、２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸を定量した。定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。
【００７８】
ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ２２５（ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ １．５ｍｌ／ｍｉｎ、ｓｐｌｉｔ １／５０
カラム温度：１１０℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ（島津製作所）
【００７９】
この結果、ｐＵＣＭｔＥＲ１で形質転換した大腸菌を用いた場合の、（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の収量は６２５μｇであり、光学純度は６７．２％ｅ．ｅ．であった。また、ｐＵＣＣａＥＲ１で形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の収量は７５７μｇであり、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を高い光学純度で得ることが可能になった。また、ロイコトリエン拮抗剤として有用な（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを効率よく製造することが可能になった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られる培養液を用いて、４−ハロクロトン酸誘導体の炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元して、医薬、農薬等の中間体原料として有用な化合物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する方法に関する。本発明はまた、該４−ハロ酪酸誘導体の製造方法を利用した、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性４−ハロ酪酸誘導体は医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である。例えば、（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸（２Ｒ−メチル−４，４，４−トリフルオロブタン酸）は、ロイコトリエン拮抗剤として有用な（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンの合成中間体であることが知られている（欧州特許出願公開第４８９５４８号明細書）。光学活性４−ハロ酪酸誘導体を得る方法としては、光学活性ホスフィン化合物とルテニウム化合物からなる錯体触媒を用いて４−ハロクロトン酸誘導体を還元する方法が知られていた（欧州特許出願公開第６７３９１１号明細書）。しかし、かかる反応は高圧下で行う必要があり、用いる触媒も高価であった。
【０００３】
エノエートレダクターゼは、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合を還元する反応を触媒する酵素であるが、例えば、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）などの微生物でその存在が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．８，ｐ５７７９−５７８７，２００１）。エノエートレダクターゼ活性を有する微生物を利用した各種エノエートの不斉還元が報告されているが（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２０，８１７，１９９８）、エノエートのうち、４位の炭素がハロゲン化された４−ハロクロトン酸誘導体に関しては、エノエートレダクターゼを用いた不斉還元の報告例は無かった。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、光学活性４−ハロ酪酸誘導体をより高い光学純度で安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを課題とする。本発明はまた、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、原料となる４−ハロクロトン酸誘導体の不斉還元反応を触媒することを見出した。さらに、該タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を作製し、該細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、原料となる４−ハロクロトン酸誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を得ることができることを見出した。さらに、この方法によって得られる（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を用いることにより、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを効率よく製造できることを見出した。以上によって、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）下記一般式（Ｉ）
【化１】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法（式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す）。
（２）エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、（１）の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（３）エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、（１）の製造方法。
（４）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（５）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（６）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（７）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒがメチル基であり、Ｘ、Ａ１およびＡ２がそれぞれフッ素原子であることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかの製造方法。
（９）（８）の方法により一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸を一般式（ＩＩ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸に変換する工程、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＩＩ）で表される化合物を反応させて、一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程を含む、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法．
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
＜１＞光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法
本発明においては、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【化４】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に作用させることにより、該化合物の炭素・炭素二重結合を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【化５】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造する。
【０００８】
上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）において、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す。
【０００９】
ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。また、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
【００１０】
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、前記不斉還元反応に悪影響を与えない基であれば特に限定されないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。また、置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００１１】
Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示すが、これらのハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。Ｘ、Ａ１、Ａ２の全てがフッ素原子であることが特に好ましい。
【００１２】
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のＲとしては、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基である。
【００１３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、例えば一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸等が挙げられる。上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、下記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるアルデヒド（Ｘ、Ａ１、Ａ２は前記と同様の置換基を示す）を第４版実験化学講座（１９巻、ｐ６２、１９９２年）記載の方法により所望の安定化イリドとＷｉｔｔｉｇ反応を行い、得られた不飽和エステルを加水分解することにより容易に合成することができる。
【００１４】
【化６】
【００１５】
また、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物として、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、一般式（ＩＶ）の（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸等が挙げられる。
【化７】
【００１６】
エノエートレダクターゼは一般に、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいう（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２０，ｐ８１７，１９９８）が、本発明においては、４−ハロクロトン酸誘導体の炭素・炭素二重結合を不斉還元して光学活性な４−ハロ酪酸誘導体を生成する活性を有することのできるタンパク質をいう。ここで、生成する４−ハロ酪酸誘導体の光学純度は、６０％ｅ．ｅ．以上であることが好ましく、９０％ｅ．ｅ．以上であることがより好ましく、９８％ｅ．ｅ．以上であることがさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．であることが特に好ましい。このような活性は、４−ハロクロトン酸誘導体を基質として含有し、さらにＮＡＤＨを補酵素として含有する反応系において、ＮＡＤＨの減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明の製造方法において用いることのできるエノエートレダクターゼは上記活性を有する限り特に制限されないが、例えば、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはそれぞれ、ムーレラ サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼである。
【００１８】
また、本発明においては、これらのホモログであって、前記の酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００１９】
また、前記ホモログは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％、特に好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７１０８６）と５９％の相同性を示し、配列番号４の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７１０８６）と４９％の相同性を示した。また、配列番号２と配列番号４の配列は互いに５０％の相同性を示した。本明細書において、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．はＧｅｎＢａｎｋのものを示す。
【００２０】
本発明の製造法に用いるエノエートレダクターゼは、エノエートレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物からエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、エノエートレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌やムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からエノエートレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．９７，ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００２１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌としては、例えばクロストリジウム アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有しており、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌としては、例えばムーレラサーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有している。前者はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）に記載されており、該ＡＴＣＣから入手できる。また、後者はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）に記載されており、該ＤＳＭＺから入手可能である。
【００２２】
本発明の製造方法においては、４−ハロクロトン酸誘導体をエノエートレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、エノエートレダクターゼを含む細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、４−ハロクロトン酸誘導体に反応させて、光学活性４−ハロ酪酸誘導体を製造してもよい。エノエートレダクターゼを含む細胞としては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００２３】
この場合、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。このようなＤＮＡは配列番号１または配列番号３の塩基配列に基いて設計したプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００２４】
ここで、ホモログとは、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及び素の相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２５】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００２６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、エノエートレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ．１２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００２８】
なおエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００２９】
当業者であれば、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１０，ｐ６４８７（１９８２），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｖｏｌ．１００，ｐ４４８（１９８３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３０】
また、配列番号２または４のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３２】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、エノエートレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換した細胞を培養することにより、エノエートレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００３５】
このとき、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．ｖｏｌ．４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ．８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３６】
本発明のエノエートレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３７】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３８】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００４０】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４１】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４２】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００４３】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４４】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４５】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４６】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュドモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４７】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．１９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５０】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５１】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００５２】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３１５，ｐ５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、反応基質である４−ハロクロトン酸誘導体にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を作用させてもよい。形質転換細胞は、反応液中でそのまま作用させてもよいが、該形質転換細胞の調製物、例えば、該形質転換細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、該形質転換細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを作用させてもよい。本発明の製造方法においてはさらに、前記細胞を培養して得られた培養液、すなわち、前記細胞を含む培養液を、直接用いてもよい。
【００５４】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨを添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋をＮＡＤＨへ再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
（ｉ）宿主微生物自体のＮＡＤ＋還元能を利用する方法、
（ｉｉ）ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または
（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子をエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００５５】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、２−プロパノール、ギ酸などを添加することが好ましい。
【００５６】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のエノエートレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である４−ハロクロトン酸誘導体に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００５７】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５８】
本発明の製造方法は、例えば、反応基質、本発明の形質転換細胞および／または該形質転換細胞調製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。
【００５９】
本発明製造法において反応基質となる一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。
【００６１】
本発明の方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行うことができる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。また、エノエートレダクターゼの酸素による失活を防ぐため、反応液中に亜硫酸ナトリウムを添加したり、反応液を窒素やアルゴンガス等でシールすることにより、酸素の除去を行うことも効果的である。
【００６２】
本発明の方法により生成する光学活性４−ハロ酪酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６３】
＜２＞（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造法
本発明の（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法は、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸に反応させて、一般式（ＩＶ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を生成させる工程（ａ）、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程（ｂ）、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＶＩ）で表される化合物を反応させて一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程（ｃ）を含む。
【００６４】
【化８】
【００６５】
工程（ａ）は上述した方法と同様にして行うことができる。工程（ｂ）はカルボン酸をアミンに変換する通常の方法を使用することができる。例えば、アンモニアと反応させてアミド化した後に還元する方法（下記反応式（ＩＸ））、ベンジルアミン等またはアンモニア等価体（例えば、ＨＮ（ＳｉＭｅ３）２等）と反応させた後に、反応物を還元し、さらに接触水素化分解等により脱保護する方法（下記反応式（Ｘ））などを使用することができる。
【００６６】
【化９】
【００６７】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られる式（Ｖ）の（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンを、式（ＶＩ）の化合物に反応させて、式（ＶＩＩ）の（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを得る。この工程は、通常のアミンとカルボン酸との反応と同様にして行うことができる。具体的には、例えば、欧州特許出願公開第４８９５４７号明細書（特に実施例５）や欧州特許出願公開第４８９５４８号明細書（特に実施例２）に開示されている方法と同様にして行うことができる。また、この工程で使用する一般式（ＶＩ）の化合物はいかなる製法によって得られるものでもよいが、例えば、上記特許公報に開示されているようにして、４−（５−メトキシカルボニル−１−メチルインドール−３−イルメチル）−３−メトキシ安息香酸（一般式ＸＩ）と２−メチルベンゼンスルホンアミド（一般式ＸＩＩ）と反応させ、生じた化合物を加水分解することによって得られる化合物を使用することができる。
【００６８】
【化１０】
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７０】
（１）ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）由来の２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ７６０８２，配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ１６１３６，ＲＥＧＩＯＮ：４７．．２０５０，配列番号１）を元に、配列番号５および６のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ムーレラ サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）ＤＳＭ１９７４のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−１ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７１】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法によって形質転換した。
【００７２】
形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、得られたコロニーについてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＭｔＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。
【００７３】
（２）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
クロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来の２−ｅｎｏａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ８１３０２、配列番号４）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ００７８３４，ＲＥＧＩＯＮ：８５９．．２８５３、配列番号３）を元に、配列番号７および８に記載のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−１ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７４】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後、回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、得られたコロニーについてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＣａＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号３の塩基配列と一致した。
【００７５】
（３）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された大腸菌を用いた（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の合成
上記（１）、（２）で得られた形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で３０時間生育させた。得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌して菌体を得た後、下記に示す方法により、４，４，４−トリフルオロチグリン酸を基質として該菌体のエノエートレダクターゼ活性を確認した。
【００７６】
なお、基質である４，４，４−トリフルオロチグリン酸は以下のようにして合成した。すなわち、４，４，４−トリフルオロチグリン酸エチルエステル（３．６４ｇ、２０ｍｍｏｌ）に５０％含水メタノール（２０ｍＬ）及び８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（３ｍＬ）を加えた後、得られた混合物を約２時間攪拌した。反応混合物は溶媒を減圧留去し、濃塩酸を加えｐＨを２以下に調整した後、塩化メチレン抽出を行い、得られた有機層を減圧濃縮することにより透明油状物として４，４，４−トリフルオロチグリン酸（２．９ｇ、収率９４％）を得た。
【００７７】
前記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭグルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、２５ｍＭ ４，４，４−トリフルオロチグリン酸）を添加した後、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で２０時間反応させた。１０μＬの６Ｎ ＨＣｌを添加して反応を終了し、酢酸エチルで抽出し、２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸を定量した。定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。
【００７８】
ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ２２５（ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ １．５ｍｌ／ｍｉｎ、ｓｐｌｉｔ １／５０
カラム温度：１１０℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ（島津製作所）
【００７９】
この結果、ｐＵＣＭｔＥＲ１で形質転換した大腸菌を用いた場合の、（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の収量は６２５μｇであり、光学純度は６７．２％ｅ．ｅ．であった。また、ｐＵＣＣａＥＲ１で形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｒ）−２−メチル−４，４，４−トリフルオロ酪酸の収量は７５７μｇであり、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性４−ハロ酪酸誘導体を高い光学純度で得ることが可能になった。また、ロイコトリエン拮抗剤として有用な（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを効率よく製造することが可能になった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られる培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法（一般式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す）。
【請求項２】
エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒがメチル基であり、Ｘ、Ａ１およびＡ２がそれぞれフッ素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により、一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸を一般式（ＩＶ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸に変換する工程、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＶＩ）で表される化合物を反応させて一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程を含む、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法。
【化３】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
で表される４−ハロクロトン酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られる培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体の製造方法（一般式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒはハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を、Ｘはハロゲン原子を、Ａ１およびＡ２は水素原子またはハロゲン原子を示す）。
【請求項２】
エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される４−ハロクロトン酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性４−ハロ酪酸誘導体に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒがメチル基であり、Ｘ、Ａ１およびＡ２がそれぞれフッ素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により、一般式（ＩＩＩ）で表される４，４，４−トリフルオロチグリン酸を一般式（ＩＶ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸に変換する工程、前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチル酪酸を、一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに変換する工程、及び前記（Ｒ）−４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチルアミンに一般式（ＶＩ）で表される化合物を反応させて一般式（ＶＩＩ）で表される（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドを生成させる工程を含む、（Ｒ）−Ｎ−（４，４，４−トリフルオロ−２−メチルブチル）−３−［２−メトキシ−４−（ｏ−トリルスルホニルカルバモイル）ベンジル］−１−メチルインドール−５−カルボキサミドの製造方法。
【化３】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６４８
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１５６２（Ｐ２００５−５１１５６２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９９３２
【国際出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９９３２
【国際出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
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