ガラクトースを炭素源として通常は利用し得ないが、ガラクトースを唯一の炭素源として利用するように本発明における方法に従い遺伝的に操作されている下等真核細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を記載する。該細胞は、ルロアール経路を構成する酵素の幾つかを発現するように遺伝的に操作される。特に、該細胞は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび場合によってはガラクトースパーミアーゼを発現するように遺伝的に操作される。また、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、ルロアール経路を構成する酵素を通常は欠く細胞において、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の収率を改善するための方法を提供する。該方法は、ガラクトキナーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−Ｃ４−エピメラーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸分子で該細胞を形質転換することを含む。記載されている方法および宿主細胞は、組換え細胞の製造のための選択方法として、ガラクトースを同化する能力の存在または欠如を可能にする。該方法および宿主細胞は、ガラクトース末端Ｎ−グリカンまたはガラクトース含有Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンなどを製造するのに特に有用であることが本明細書に示されている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性を発現するように遺伝的に操作されており、唯一の炭素エネルギー源としてガラクトースを利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項２】
該宿主細胞が、ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生しうるように更に遺伝的に操作されている、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性が、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項４】
該宿主細胞が、Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項５】
該宿主細胞が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項６】
該Ｎ−グリカンが、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるガラクトース末端Ｎ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項７】
該Ｎ−グリカンがガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項８】
該Ｎ−グリカンが、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるシアル酸化Ｎ−グリカンである、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項９】
該組換え糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ａ）（ｉ）ガラクトース残基を含むハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を宿主細胞が産生することを可能にするグリコシル化経路、
（ｉｉ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性、ならびに
（ｉｉｉ）組換え糖タンパク質
を発現するように遺伝的に操作されている組換え宿主細胞を準備し、
ｂ）ガラクトースを含有する培地内で該宿主細胞を培養して、ガラクトース残基を有する１以上のＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生させることを含む、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主における、ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを有する組換え糖タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
該ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性が、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインとＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの触媒ドメインとを含む融合タンパク質において得られる、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
該Ｎ−グリカンのＧ０：Ｇ１／Ｇ２比が２：１未満である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
該組換え糖タンパク質が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１４】
該Ｎ−グリカンが、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるガラクトース末端Ｎ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１５】
該Ｎ−グリカンがガラクトース末端ハイブリッドＮ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１６】
該Ｎ−グリカンが、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択されるシアル酸化Ｎ−グリカンである、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１７】
該組換え糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１８】
異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の製造方法であって、
（ａ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性およびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される１つ又は２つの酵素活性を発現するように遺伝的に操作されている宿主細胞を準備し、
（ｂ）該異種タンパク質、および工程（ａ）の宿主細胞において発現されない、工程（ａ）における群からの酵素をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、
（ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地内で該宿主細胞を培養して、異種タンパク質を発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を得ることを含む、製造方法。
【請求項１９】
該宿主細胞を、ガラクトースパーミアーゼを発現するように更に遺伝的に操作する、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
該宿主細胞を、ガラクトースを含む１以上のＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾する、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２１】
ａ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、
ｂ）ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性および場合によってはガラクトースパーミアーゼ活性をコードする１以上の核酸分子で該宿主細胞を形質転換し、
ｃ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で該形質転換宿主細胞を培養し、
ｄ）ガラクトースを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖しうる宿主細胞を選択することを含む、ガラクトースを唯一の炭素源として利用しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を製造し選択する方法。
【請求項２２】
Ｇ０：Ｇ１／Ｇ２グリコフォームの比が２：１未満である組換え糖タンパク質を医薬上許容される担体中に含む組成物。
【請求項２３】
該糖タンパク質が、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３受容体抗体、抗ＣＤ４１ ７Ｅ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体および抗ＣＤ２０抗体ならびにそれらの変異体からなる群から選択される抗体である、請求項２２記載の糖タンパク質組成物。
【請求項２４】
該糖タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項２２記載の糖タンパク質組成物。
【請求項２５】
該Ｆｃ融合タンパク質がエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である、請求項２４記載の糖タンパク質組成物。
【請求項２６】
組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＤＸ４７７の遺伝子型と同じ遺伝子型を有する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１３−３】

【図１３−４】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【公表番号】特表２０１２−５１８４１９（Ｐ２０１２−５１８４１９Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５１３０８（Ｐ２０１１−５５１３０８）
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２５１６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９９１５３
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】