多糖シンターゼ（Ｈ）
本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より詳細には、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼに関する。本発明は、とりわけ、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルに影響を及ぼす方法、ならびに（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本発明は、オーストラリア仮特許出願2007907071の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より具体的には、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼに関する。
【背景技術】
【０００３】
穀類の各種組織は、穀粒成長中、休眠中および発芽後において、多様な機能を有する。
【０００４】
例えば、果皮膜および種皮の組織は、発育中および休眠中に種を保護することに係わる。しかし、穀粒が成熟し、穀粒のこれらの外側組織が死んだ後、組織内残留物は、ほぼ全体が細胞壁残留物から構成される。種皮とアリューロン表面との間にある核組織は、穀粒成長のために栄養素の伝達に関与するが、成熟と同時にこの組織もまた、細胞壁断片を残すのみで崩壊する。成熟した穀粒のデンプン質の胚乳の薄い有壁細胞は死ぬが、デンプンと貯蔵タンパク質が充満する。対照的に、厚い有壁かつ有核のアリューロン細胞は、穀粒の成熟時点でも生きており、タンパク体および脂肪滴が充満している。デンプン質胚乳の接触面には胚盤があり、胚乳を発育させるための栄養素を運ぶ役割をすると共に、発芽中に胚乳の貯蔵物の消化産物を成長する胚に輸送する。
【０００５】
穀粒中の各組織の異なる構造と機能は、少なくとも１つには、これらの細胞種それぞれの細胞壁組成によって決まる。
【０００６】
非セルロース多糖類は、穀類組織の細胞壁における主要な成分であり、例えば（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン、ヘテロキシラン（主にアラビノキシラン）、グルコマンナン、キシログルカン、ペクチン多糖類およびカロースなどを含む。これら非セルロース多糖類は、通常、穀粒全重量の１０％未満を構成するにすぎないが、穀粒品質の重要な決定因子である。
【０００７】
個々の非セルロース多糖類とその他の壁構成成分との正確な物理的関係は述べられてこなかったが、壁中で、セルロースの微小線維は非セルロース多糖類およびタンパク質のマトリックス相に組み込まれいる。壁の完全性は、主にマトリックス相と微小線維構成素との間の広範な非共有結合相互作用、特に水素結合によって維持される。いくつかの穀粒組織の壁中に、ヘテロキシラン、リグニンおよびタンパク質の間に共有結合が存在する。各成分間の共有結合の範囲は、壁の種類および遺伝子型によっても異なる。
【０００８】
非セルロース多糖類、特にヘテロキシランおよび（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、アリューロンおよびデンプン質胚乳の壁、また恐らくは、胚盤においても、比較的高い割合を占める。これらの組織において、セルロース含量はそれに応じて低くなる。該してセルロース含有量が低い壁は、リグニンを全く含まないという事実の他、穀粒の中央部の壁の構造的な硬さに関する限定的な要件、および穀粒の発芽後に壁成分を急速に脱重合するための要件に関係すると考えられている。
【０００９】
対照的に、果皮膜の細胞壁は、胚および胚乳のための保護膜を提供し、発芽中に動員されないものであるが、同細胞壁中のセルロースおよびリグニンの含有量は非常に高く、非セルロース多糖類の濃度は、それに応じて低い。
【００１０】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、混合結合もしくは穀類β−グルカンとも呼ばれ、非セルロース多糖類であるが、穀類および牧草が属する単子葉植物イネ科（Poaceae）の植物、および同類のイネ目（Poales）の近縁ファミリーに天然に存在する。
【００１１】
これらの非セルロース多糖類は、ほとんどの穀粒のデンプン質胚乳およびアリューロン細胞壁において重要な構成物質であり、細胞壁の最高で７０重量％から９０％重量までを占めることがよくある。
【００１２】
オオムギ、オートムギおよびライムギは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの豊富な供与源であるが、これらに比べ、コムギ、イネおよびトウモロコシは、この多糖類濃度が低い。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、穀類および牧草の栄養組織にある細胞壁の比較的微量な成分である。栄養組織において比較的微量な成分として現れるが、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、例えば、動物による栄養組織の消化率の観点から、またバイオエタノール生産用に作物残滓を使用する観点からもなお重要である。
【００１３】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、酒造および飼料製造業者を含む大規模食品加工活動において重要である。さらには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンなど、穀類の非デンプン質多糖類は、ヒトの栄養素として潜在的に有用な効果があることから、近年新たな関心を引き寄せている。
【００１４】
しかしながら、このような関心の高さにもかかわらず、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン生合成をはじめとして、穀類中の非セルロース多糖類生合成を制御する遺伝子および酵素の知識には大きな隔たりがある。
【００１５】
穀粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、遺伝子型および環境の両者により影響を受けると考えられている。例えば、穀類中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの濃度は、遺伝子型、穂の穀粒の位置、ならびに植え付け場所、成長中の気候条件および土壌窒素などの環境条件に左右される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの調節を促し、これによって穀粒または栄養組織の品質を変えられるので、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の同定は望ましいと言える。そこで、細胞内の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの調節を可能にし、それに伴う穀類または栄養組織品質の変化を可能にするため、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の特定は、是非とも必要である。
【００１７】
本明細書における従来技術の参照は、従来技術がいかなる国においても共通する一般知識の一部を形成することの同意と、またはいかなる形態の示唆と解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのファミリーをコードするヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列が提供される。本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼはＣｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされることが明らかにされた。
【００１９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列の同定の結果として、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する、ならびに／あるいは細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提供する。
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することによって調節する。従って、第２の態様において、本発明は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞においてＣｓｌＨ核酸を発現させる、過剰発現させる又は導入することにより、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増大させることを包含する。あるいは、別の実施形態において、本発明は、細胞におけるＣｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダウンにより細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をダウンレギュレートする方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、組換え発現系における（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成を促進する。例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制御下にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換え技術によって生成することもでき、続いてこの細胞はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを発現し、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを生成する。したがって、第３の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップおよびその単離されたＣｓｌＨ核酸を細胞に発現させるステップを含む方法を提供する。
【００２４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを提供する。
【００２５】
第５の態様において、本発明は、
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
を含む細胞を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。
【００２７】
さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀粒を提供する。したがって、第７の態様において、本発明は、そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸分子を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒を提供する。
【００２９】
第８の態様において、本発明は、以下：
本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
【００３０】
上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定および単離に基づく。
【００３１】
したがって、第９の態様において、本発明は、単離されたＣｓｌＨ核酸分子、又はその相補体、逆相補体若しくは断片を提供する。
【００３２】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【００３３】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様に記載の単離された核酸分子または本発明の第１０の態様に記載の遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
【００３４】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【００３５】
上記の通り、本発明は同様に、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミノ酸配列を提供する。
【００３６】
したがって、第１３の態様において、本発明は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド又はその断片を規定するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００３７】
第１４の態様において、本発明は、上記に定義の単離されたＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【００３８】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの、その変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を示唆するが、 その他任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を示唆するものではないと理解されよう。
【００３９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書において配列識別子番号（配列番号）により示される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号２）などに数値的に対応する。配列識別子の概要を表１に示す。配列のリストは、本明細書の最後に示されている。
【表１】
【００４０】
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ａ）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）における機能獲得実験に使用した、ＨｖＣｓｌＨ１：：ｐＧＢＷ１５構築体のＴ−ＤＮＡの概略を示す図である。Ｇａｔｅｗａｙクローニング後、３×ＨＡタグを、全長ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦのＮＨ２末端に結合した。（Ｂ）は、ノーザンブロット分析により決定された、成熟ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ１植物の葉における転写産物レベルの図である。上のパネル、Ｘ線フィルム撮影；下のパネル、対応する、臭化エチジウム染色したゲル。観察された２．５ｋｂの転写産物のサイズは、タグ付加ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡの予想されたサイズに一致する。（Ｃ）ウェスタンブロット分析により決定された、３週齢のプールされたＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ２系統における３×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質レベルの図である。３０マイクログラムの混合ミクロソーム膜タンパク質を各レーンに添加し、抗ＨＡ抗体でブロットをプロービングした。ＢおよびＣ；番号はトランスジェニック系統を指し、Ｃｏｌ−０は、野生型の非形質転換系統を指す。Ｃｏｌ−０、８および１４系統は同じブロット由来であり、他の系統はすべて異なるブロット由来である。
【図２】β−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた、ＨｖＣｓｌＨ１発現系の細胞壁におけるβ−グルカンの検出を示す透過型電子顕微鏡写真を示す（Meikle et al., Plant J 5:1-9, 1994）。（Ａ〜Ｃ）８、１６、１１系統；（Ｄ）野生型Ｃｏｌ−０対照；（Ｅ）６系統。ＡおよびＤは維管束の細胞；ＢおよびＣは葉肉細胞；Ｅは上皮細胞を示す。スケールバー＝０．５μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｅ）、１μｍ（Ｄ）。
【図３】１４５日齢のシロイヌナズナ系統１６−１ロゼット葉組織から調製されたアルコール不溶性画分（ＡＩＲ）の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣプロファイルを示す図である（青色線）。１６−１を予め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色線）。オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対照試料として使用した（黄緑色線）。Ｇ４Ｇ３ＧＲ（３−Ｏ−β−セロビオシルＤ−グルコース、ＤＰ３）およびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ（３−Ｏ−β−セロトリオシルＤ−グルコース、ＤＰ４）のピークを示す。
【図４】シロイヌナズナトランスジェニック系統１１の高圧凍結葉の切片における、金標識抗ＨＡ抗体による３×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質の検出を示す透過型電子顕微鏡写真を示す。（ＡおよびＢ）葉肉細胞。Ｇ、ゴルジ体、ｃｗ、細胞壁、ｖ、液胞、ｅｒ、小胞体。スケールバー＝０．５μｍ（Ａ）、０．２μｍ（Ｂ）。矢印は、ゴルジ関連小胞の標識を示す。
【図５】ＱＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ分析により決定された、オオムギにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発現を示す図である。（Ａ）さまざまなオオムギ組織中のＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベル（コピー／マイクロリットルｃＤＮＡ）の図である。正規化のための対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンおよびα−チューブリンとした。（Ｂ）受粉後０〜２４日の成長中の胚乳における、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベルの図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、α−チューブリンおよび伸長因子１ａとした。（Ｃ）１０日齢の第１葉中のＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベルの図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンおよびＨＳＰ７０とした。ＱＰＣＲプロットのエラーバーは、標準偏差を示す。（Ｄ〜Ｆ）１８Ｓ ＲＮＡ（陽性対照、Ｄ）、ＨｖＣｓｌＨ１（Ｆ）および陰性対照（Ｅ）のためのプローブを使用する、７日齢の第１葉の成熟域のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ画像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図６】ＨｖＣｓｌＨ１の構造的特徴を示す図である。（Ａ）ＨｖＣｓｌＨ１のエクソン−イントロン構造である。黒いバーがエクソンを示し、細い黒線がイントロンと５’および３’ＵＴＲを示す。四角形の上の数字はエクソンのサイズを示し、線の下の数字はイントロンのサイズを示す。イタリック体の数字は、５’および３’のＵＴＲのサイズを指し、下線のある太字は、開始コドンの上流の公知の配列の長さを指す。数字は塩基対で表されている。太い黒いバーは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/）により予測される、６つのコンセンサス膜貫通ドメインを示す。（Ｂ）ＨｖＣｓｌＨ１のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性プロット（Kyte and Doolittle, J Mol Biol 157: 105-132, 1982）の図である。＋１．６のカットオフを用いた１９個のアミノ酸ウィンドウを使用した。６つの予測膜貫通ドメインを黒いバーで示す。数字はアミノ酸を示す。（Ｃ）ＨｖＣｓｌＨ１の予測膜トポロジーの図である。ＮＨ２、アミノ末端；ＣＯＯＨ、カルボキシ末端；ｌｕｍｅｎ、ＥＲの内部、ゴルジ体または小胞体；ｃｙｔ、細胞質、ｍｅｍ、膜、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ、ＣＡＺｙ ＧＴ２ファミリーの特徴的モチーフ。ＨｖＣｓｌＨ１におけるＱＸＸＲＷモチーフの配列は、ＱＦＫＲＷである。
【図７】全長のオオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）のＣＳＬＨ配列の系統樹を示す図である。ＣＳＬＢファミリーは、ＣＳＬファミリーの中でＣＳＬＨファミリーと最も密接に関係しているので、シロイヌナズナ（A. thaliana）およびポプラ（Populus trichocarpa）のＣＳＬＢタンパク質配列もまた含まれる。アライメントはＣｌｕｓｔａｌＸを使用して作成し、近隣結合を用いる固有距離アルゴリズムを使用した。各分岐群を支持するブートストラップ反復の数（総数１，０００から）を、その分岐群の節間の下に示す。アクセッション番号は、ＨｖＣｓｌＨ１（ＦＪ４５９５８１）、ＯｓＣＳＬＨ１（Ｏｓ１０ｇ２００９０、ＡＣ１１９１４８）、ＯｓＣＳＬＨ２（Ｏｓ０４ｇ３５０２０、ＡＬ６０６６３２）、ＯｓＣＳＬＨ３（Ｏｓ０４ｇ３５０３０、ＡＬ６０６６３２）、ＰｔＣＳＬＢ１（http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html; ＩＤ ｎｏ．５７２９８２）、ＰｔＣＳＬＢ２（ＩＤ ｎｏ．６８４２１４）、ＡｔＣＳＬＢ１（Ａｔ２Ｇ３２６１０、ＮＭ＿１２８８２０）、ＡｔＣＳＬＢ２（Ａｔ２Ｇ３２６２０、ＮＭ＿１２８８２１）、ＡｔＣＳＬＢ３（Ａｔ２Ｇ３２５３０、ＮＭ＿１７９８５９）、ＡｔＣＳＬＢ４（Ａｔ２Ｇ３２５４０、ＮＭ＿１２８８１３）、ＡｔＣＳＬＢ５（Ａｔ４Ｇ１５２９０、ＮＭ＿１１７６１７、ＡｔＣＳＬＢ６（Ａｔ４Ｇ１５３２０、ＮＭ＿１１７６２０）である。
【図８】ＨｖＣｓｌＨ１が位置する、２Ｈ染色体の短腕の部分的ゲノムマップを示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１および４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子のクラスターを、セントロメア（黒丸により表示）に近接するＳｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘのビンマップ上の６９．２〜７１．５Ｍｂに相当する区間にマッピングした。ＨｖＣｓｌＨ１はビン８に配置され、ｗｇ９９６マーカーと同時分離する。Ｓｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘの参照マップにおいて、ｗｇ９９６はａｂｃ１６２と同時分離し、ａｂｃ４６８の２．３ｃＭ南であり、４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子と同時分離するマーカーである（Burton et al., Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）。鍵となるマーカーを、染色体の上部からのそれらの距離をセンチモルガン（ｃＭ）で左に示し、Ｈａｎらの麦芽β−グルカンＱＴＬ分析（Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995）におけるＬＯＤ（塩基１０に対する対数オッズ）スコアを右に示す。
【図９】（Ａ）シロイヌナズナ系統１６−２由来の１４５日齢の葉および茎を組み合わせた材料から調製されたＡＩＲの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣプロファイルを示す図である（青色線）。１６−２を予め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色線）。オオムギ成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対照試料として使用した（黄緑色線）。ラミナリビオース標準（水色線）。マルトース（Ｇα４Ｇ）およびセロビオース（Ｇβ４Ｇ）の保持時間を矢印により印を付けた。（Ｂ）Ａの試料の酵素消化ＡＩＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳクロマトグラムを表す図である。ＤＰ２（ラミナリビオース）、ＤＰ３（３−Ｏ−β−セロビオシルＤ−グルコース）およびＤＰ４（３−Ｏ−β−セロトリオシルＤ−グルコース）のピークを示す。
【図１０】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）に由来するＣｓｌＨ配列の間の、ヌクレオチド配列同一性、タンパク質配列同一性およびタンパク質配列類似性を示す図である。
【図１１−１】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）に由来するＣｓｌＨアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す図である。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】オオムギ（Hordeum vulgare）、コメ（Oryza sativa）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびポプラ（Populus trichocarpa）に由来するＣｓ１Ｂ、ＦおよびＨの全長アミノ酸配列の関係を示す系統樹である。
【図１３】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物交配の親として使用された４種のトランスジェニックシロイヌナズナ植物系統の表皮細胞壁における、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真である。ＨｖＣｓｌＨ１系統個体１５−８−３および１５−１１−７を、それぞれパネルＡおよびＢに、ＯｓＣＳＬＦ２系統個体Ｈ３７−５およびＨ１７−４−４を、それぞれパネルＣおよびＤに示す。
【図１４】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物交配から得られた子孫の細胞壁における、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真である。１５−８−３×Ｈ３７−５の交配による個体を（Ａ）、１５−８−３×Ｈ３７−５の同胞を（Ｂ）、１５−８−３×Ｈ３７−７を（Ｃ）、１５−８−３×Ｈ３７−７の同胞を（Ｄ）、５−８−１５×Ｈ３７−１６を（ＥおよびＦ）に、１５−１１−１３×Ｈ３７−１１を（Ｇ）に、１５−１１−７×Ｈ１７−４を（Ｈ）に示す。パネルＡ〜Ｅ、Ｇ〜Ｈは、表皮細胞を示し、パネルＦは葉肉細胞を示す。
【図１５】シロイヌナズナにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発現に使用したｐＧＷＢ１５ベクターのベクターマップを示す図である。
【図１６−１】オオムギ品種ヒマラヤ（cv. Himalaya）由来のＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＤＮＡ配列は１０塩基ごとに番号を付け、単一の大文字オープンリーディングフレームの翻訳アミノ酸配列を、下に１文字で示す。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１６−３】図１６−１の続き。
【図１７−１】オオムギＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡおよびゲノム配列と、３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子ホモログ（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１−３）のゲノム配列との比較を示す図である。オオムギｃＤＮＡ（上から、品種スクーナー（cv. Schooner）由来のＨｖＣｓｌＨ１（配列番号１）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣｓｌＨ１Ｈｉｍ（配列番号６９））ならびにゲノムクローン（品種モレックス（cv.Morex）由来のＨｖＣｓｌＨ１ｇ（配列番号９）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣｓｌＨ１ｇＨｉｍ（配列番号７１））のＤＮＡ配列を、３種のコムギ配列（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１−３（それぞれ、配列番号７８、８０および８１）とともに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを使用してＢｉｏＥｄｉｔでアライメントした。アライメントの位置を配列の上に番号付けし、ダッシュはアライメントを最適化するために導入されたギャップを示す。コムギゲノム配列（ＴａＣｓｌＨ１−１）と同一のヌクレオチドは、点で表す。エクソン／イントロンの境界は、コムギゲノム配列（ＴａＣｓｌＨ１−１）において太字で示す。参照用に、ＣｓｌＨコード領域のＡＴＧ開始コドンは、アライメント位置９８において始まり、終止コドンＴＡＡは位置３３２０において始まり、双方とも下線を付けてある。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１７−３】図１７−１の続き。
【図１７−４】図１７−１の続き。
【図１７−５】図１７−１の続き。
【図１７−６】図１７−１の続き。
【図１８−１】オオムギ品種ヒマラヤと、コムギのＣｓｌＨ１タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である。オオムギ遺伝子の翻訳アミノ酸配列（最上段、ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ））を、３種のコムギ配列（ＴａＣｓｌＨ１−１ｐｒｏ、１−２ｐｒｏおよび１−３ｐｒｏとして示す）とともに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを使用してＢｉｏＥｄｉｔでアライメントした。アライメントの位置を配列の上に番号付けし、アライメントを最適化するために導入されたオオムギ配列に単一のダッシュ（ギャップを示す）が存在する。アミノ酸は、それらの一文字形式で示し、オオムギ配列（ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ））と同一のアミノ酸は点で示す。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９】子葉鞘の成長の間のオオムギ品種ヒマラヤのＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。パネルＡは、子葉鞘の成長の間ならびに若葉（Ｌ）、根（Ｒ）および中期胚乳（Ｅ）におけるオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲの図である。構成的に発現される遺伝子（α−チューブリン）を対照として示す。パネルＢは、発芽開始後のさまざまな時点（日）における、成長中の子葉鞘中のＨｖＣｓｌＨ１に関する、正規化発現レベル（Ｑ−ＰＣＲ）を示す。
【図２０】葉の成長の間のオオムギのＣｓｌＦおよびＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。オオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、他のオオムギＣｓｌＦ遺伝子と比較した。構成的に発現した遺伝子（α−チューブリン）を対照として示す。
【図２１】胚乳成長の間のオオムギ品種ヒマラヤおよびコムギＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、コムギ品種ウェストニア（下のパネル）と比較したオオムギ品種ヒマラヤ遺伝子（上のパネル）の成長中の胚乳におけるＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差を示す。ＤＰＡ＝開花後の日数である。
【図２２】胚乳成長期のオオムギ品種ヒマラヤおよびコムギＣｓｌＨ１遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、成長中の胚乳における、コムギＣｓｌＨ１遺伝子と比較したオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差を示す。Ｔａ０ ｄｐａ試料を１に設定し、他の発現レベルはこれに対して相対的レベルである。
【図２３】Ｂｘ１７プロモーターの制御下におけるオオムギ品種ヒマラヤのＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現に使用した、植物形質転換ベクターのプラスミドマップを示す図である。ｐＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１と称する植物形質転換ベクターの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、さまざまな遺伝エレメントを表す：Ｂｘｌ７ｐｒｏｍ＝オオムギＨｖＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現を駆動するＢｘ１７プロモーター；Ｈｖｇ９１８５＿１＝プライマー対ＳＪ９１およびＳＪ８５を用いて単離されたＨｖＣｓｌＨ１ゲノムクローン１番；Ｎｏｓ３’＝ノパリンシンターゼポリアデニル化配列；ＮＰＴＩＩ＝細菌カナマイシン耐性遺伝子。選択された制限部位の位置は、プラスミドマップの外側に示す。
【図２４】カナマイシン耐性を付与する、植物の選択可能なマーカープラスミドのプラスミドマップを示す図である。ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏと称する植物形質転換ベクターの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、さまざまな遺伝要素を表す：３５Ｓｐｒｏｍ＝植物の選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；ＮＰＴＩＩ＝植物カナマイシン耐性遺伝子；ＳＴＬＳイントロン＝ジャガイモ（Solanum tuberosum）大型サブユニットイントロン；３５Ｓ ｐｏｌｙＡ＝ＣａＭＶ ３５Ｓポリアデニル化配列；Ａｍｐ ｒｅｓ＝細菌アンピシリン耐性遺伝子。選択された制限部位の位置は、プラスミドマップの外側に示す。
【図２５】オオムギ品種ヒマラヤＣｓｌＨ１遺伝子を発現するＴ０植物系統１０由来の単一コムギ穀粒のβグルカン含有量を示す図である。グラフは、Ｔ０系統１０番由来の個体コムギ穀粒のβグルカン含有量を示す。βグルカンは、粉末重量のパーセントとして示す。
【図２６】空ベクター対照（２０８）およびトランスジェニック（２３６）オオムギ中のＣｓｌＨ１遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す図である。発現は、受粉７日後（７Ｄ）および受粉１４日後（１４Ｄ）における葉および成長中の穀粒において示す。
【図２７】オオムギおよびコムギのＣｓｌＨ配列に関する、ＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列の同一性／類似性の比較を示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１＝オオムギ品種スクーナー由来のＤＮＡコード配列（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）；ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ）オオムギ品種ヒマラヤ由来のＤＮＡコード配列（配列番号６９）および対応するアミノ酸配列（配列番号７０）；ＴａＣｓｌＨ１−１＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング（Chinese Spring）由来のＤＮＡコード配列（配列番号７２）および対応するアミノ酸配列（配列番号７５）；ＴａＣｓｌＨ１−２＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（配列番号７３）および対応するアミノ酸配列（配列番号７６）；ＴａＣｓｌＨ１−３＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（配列番号７４）および対応するアミノ酸配列（配列番号７７）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下の説明は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするが、上記の説明に関する限定であることを意図しないと理解されるべきである。
【００４３】
本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生合成酵素をコードする遺伝子の同定に基づく。
【００４４】
「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン」は、β−Ｄ−グルコピラノシル単量体が（１→４）結合および（１→３）結合の両者によって重合された直鎖の非分枝状多糖類を含むと理解されるべきである。
【００４５】
天然の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンにおける（１→４）結合と（１→３）結合の比率は、一般に２．２〜２．６：１の範囲である。ただし、比率はこの範囲以外のこともある。たとえば、ソルガム胚乳の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、同比率は、１．１５：１である。２種類の結合は、規則的な繰り返し配列にはならない。（１→３）結合単位は、２以上の（１→４）結合により分離される。２ないし３つの隣り合う（１→４）結合の領域が優勢であるが、これら単位の配置には規則性がない。結合配列は、２つのグルコース単位より、さらに前記結合への依存がなく、二次マルコフ連鎖分布に従っている。さらに、１０％以下の連鎖は、５から２０の隣り合う（１→４）結合の長いストレッチからなる場合がある。したがって、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、セロトリオシル（cellotriosyl）（Ｇ４Ｇ４ＧRed）、セロテトラオシル（cellotetraosyl）（Ｇ４Ｇ４Ｇ４ＧRed）単位、およびより長い（１→４）−β−Ｄ−オリゴグルコシル単位の（１→３）−β−結合した共重合体とみなすことができる。
【００４６】
内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、三糖単位と四糖単位の比率は、穀物種によって異なる。例えば、コムギではその比率は３．０〜４．５：１であるが、オオムギでは２．９〜３．４：１、ライムギでは２．７：１およびオートムギでは１．８〜２．３：１である。さらに、実際の比率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出の温度および条件によっても異なる可能性がある。
【００４７】
穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンについて報告されている平均分子量は、穀物種、細胞壁の種類、抽出手順および分子量判定に用いた手順によるが、４８，０００（ＤＰ約３００）から３，０００，０００（ＤＰ〜１８５０）に及ぶ。これらは、分子量に関して常に多分散であって、これはオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに関し、数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ）１．１８に対する加重平均により説明される。ある種のオオムギ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、少量のタンパク質と共有結合しており、推定分子量最大４０，０００，０００を有している。
【００４８】
穀粒壁からの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出率は、自己会合、ならびに他の細胞壁多糖類およびタンパク質との会合の関数である。特に抽出率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン連鎖における分子量および結合分布に依存する。他のポリマーとの過剰な結合および高分子量が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを穀粒から抽出することをさらに困難にしている。
【００４９】
例えば、オオムギ、オートムギおよびライムギ粉の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの一部は、ｐＨ７．０、４０℃の水で抽出することができる。さらなる画分は、より高温で溶解度を高めることができる。４０℃において水溶性の総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合は、植物種内でも、また植物種によっても異なる。例えば、ロウ質の多い（アミロース分が高い）オオムギは、通常のオオムギよりも水溶性の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合がより高い。４０℃でオオムギから抽出された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、６５℃で抽出されたもの（２．０：１）より、三糖：四糖の比率がわずかに低い（１．７：１）。穀粒からの穀物（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを完全に抽出するためには、還元末端によるアルカリ性誘導の分解を防ぐために、ＮａＢＨ４を含む４Ｍ ＮａＯＨまたはＢａ（ＯＨ）２水溶液などのアルカリ性抽出剤を使用する必要がある。アルカリで抽出されたオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン画分は、分子量が高く、（１→４）:（１→３）結合の比率が高く、より多くの、連続的に結合した（１→４）結合のセグメントを有し、水による抽出物よりも三糖：四糖の比率が高い。ジメチルスルホキシド、高温の過塩素酸、トリクロロ酢酸、Ｎ−メチルモルホリノ−Ｎ−オキシドおよびジメチルアセトアミド−ＬｉＣｌなどの他の抽出剤も、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの溶解度を高めるために使用してもよい。しかしこれら抽出剤は、脱重合、またはポリマーの分解を生じる可能性がある。温水またはアルカリで抽出後、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、中性ｐＨおよび室温でよく溶解するようになる。しかし、冷却時に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは会合し、沈着する可能性がある。
【００５０】
上記の通り、本発明は、１つには（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒する生合成酵素の同定およびそれをコードする遺伝子に基づく。かかる酵素を本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」と称する。
【００５１】
本発明は、ＥＳＴ（expressed sequence tag）ライブラリーおよびセルロースシンターゼ（ＣｅｓＡ）遺伝子を含む他の配列データベースの分析に、一部起因する。さらに具体的には、ＣｅｓＡ遺伝子は、事実上、非常に大きな遺伝子スーパーファミリー（ＣｅｓＡ遺伝子およびセルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子ファミリーの両者を含む）のメンバーであることが、これら研究において確認された。
【００５２】
しかし、ほとんどの線維束植物のＣｓｌ遺伝子ファミリーは非常に大きく、ＣｓｌＡからＣｓｌＨと称するいくつかのグループに分類されている。シロイヌナズナでは、２９のＣｓｌ遺伝子が知られており、イネにおいては３７の同遺伝子が知られている。シロイヌナズナのゲノムは、細胞壁代謝に関与する７００超の遺伝子を含むと概ね考えられている。しかし、基本的に、これら遺伝子の具体的な機能はあまり明らかにされていない。
【００５３】
さらに、ＣｅｓＡ遺伝子とは対照的に、Ｃｓｌ遺伝子の機能を特定することは困難であることが分かっている。事実、高等植物の複数のＣｓｌ遺伝子のうち、ＣｓｌＡ及びＣｓｌＦグループのみに、一定の機能が割り当てられている。
【００５４】
本発明によって、ＣｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバーが（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードすることが明らかにされた。
【００５５】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、ＣｓｌＨヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の同定の結果、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節し、ならびに／あるいは細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提供する。
【００５６】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法を提供する。
【００５７】
「細胞」は、任意の適当な真核細胞または原核細胞とすることができる。したがって、本明細書において言及される「細胞」とは、酵母細胞もしくは菌糸真菌細胞などの真菌細胞；哺乳動物細胞などの動物細胞もしくは昆虫細胞；または植物細胞をはじめとする真核細胞とすることができる。あるいは、細胞は、大腸菌（E. coli）細胞を含む細菌細胞または古細菌細胞などの原核細胞とすることもできる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞、線維束植物細胞、例えば単子葉被子植物細胞もしくは双子葉被子植物細胞、または裸子植物細胞などである。いくつかの実施形態において、植物は単子葉植物細胞である。いくつかの実施形態において、植物は、イネ目のメンバーである。いくつかの実施形態において、単子葉植物細胞は、穀類植物細胞である。
【００５９】
本明細書において用いられる「穀類植物」という用語は、ヒトまたは動物の食料用の食用穀類を作出するイネ目（イネ科植物属）のメンバーを含む。イネ目穀類植物の例としては、決して本発明を限定するものではないが、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ソルガム、ライムギ、トリチカレ、オートムギ、オオムギ、テフ、野生米、スペルトコムギなどが挙げられる。しかしながら、穀類植物という用語は同様に、アマランス、ソバ、キノアなどの、食用穀類を作出しかつ偽穀類（pseudocereal）としても知られる非イネ目種のいくつかの植物を含むと理解されるべきである。
【００６０】
他の実施形態において、本発明は、他の単子葉植物、例えばロリウム種(Lolium spp)などの牧草を含むイネ目の他の非穀類植物などの使用を包含する。
【００６１】
上記の通り、本発明は、１つには、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することに基づく。
【００６２】
「ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒し、任意により、グルコピラノシル単量体の重合を触媒することができる、ＣｓｌＨによりコードされる任意のタンパク質とみなされるべきである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対し少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％のアミノ酸配列同一性を含む。
【００６５】
アミノ酸配列を比較する場合に、比較される配列は、配列番号２の少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも４００個のアミノ酸残基、少なくとも８００個のアミノ酸残基、又は全長にわたる比較ウィンドウと比較しうる。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施することができる。配列分析の詳細な検討は、Ausubel et al.のUnit 19.3に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００６６】
本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの例としては、配列番号２のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのオーソログが含まれる。
【００６７】
例えば、配列番号２のオオムギ（Hordeum vulgare）オーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。配列番号２のイネ（Oryza sativa）オーソログには、例えば、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。配列番号２のコムギ（Triticum aestivum）オーソログには、例えば、配列番号７５、配列番号７６および配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。
【００６８】
本明細書に記載の通り、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「レベル」の調節は、細胞中のＣｓｌＨ転写産物および／またはＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドのレベルの調節を含むと理解されるべきである。ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「活性」の調節は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの総活性、比活性、半減期および／または安定性の調節を含むと理解されるべきである。
【００６９】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性に関する「調節」によって、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少または増加させることを意図する。「減少させる」とは、例えば、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を意図する。「増加させる」とは、例えば、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍の増加を意図する。「調節」とは同様に、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを、この導入される酵素を通常は発現していない細胞に導入すること、またはそのような活性を通常有する細胞におけるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの実質的に完全な阻害を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルは、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を増加させることにより増加される。別の実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルは、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少させることにより減少される。
【００７１】
本発明の方法は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することができる、当技術分野において公知の任意の手段を包含する。これには、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼアゴニストもしくはアンタゴニストの適用のような、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの活性を調節する薬剤の適用、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性を模擬する薬剤の適用、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ核酸の発現の調節、または比活性、半減期および／もしくは安定性の増加したもしくは減少した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼが細胞によって発現されるような、細胞中での改変型もしくは変異型ＣｓｌＨ核酸の発現の達成などが含まれる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することにより調節する。
【００７３】
したがって、第２の態様において、本発明は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法を提供する。
【００７４】
本明細書において用いられる「ＣｓｌＨ核酸」という用語は、以下：
（ｉ）本明細書において定義されるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子；および／または
（ｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；および／または
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１以上を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
を含むと理解されるべきである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％の配列同一性を含む。
【００７６】
同一性の％を計算するために、核酸配列を配列番号１と比較する際に、比較されるヌクレオチド配列は、配列番号１の少なくとも３００個のヌクレオチド残基、少なくとも６００個のヌクレオチド残基、少なくとも１２００個のヌクレオチド残基、少なくとも２４００個のヌクレオチド残基、又は全長にわたる比較ウィンドウに対して比較されるべきである。比較ウィンドウは、２個の配列の最適アライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）に対して比較したときに、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施することができる。配列分析の詳細な検討は、Ausubel et al.のユニット１９．３に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００７７】
上述したように、ＣｓｌＨ核酸は、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に対してハイブリダイズする核酸を含みうる。本明細書において用いられる「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、通常は約０．０１から１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であって、温度は少なくとも３０℃を条件とする。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、または高ストリンジェンシー条件であってもよい。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃で３０％〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を使用するハイブリダイゼーションと、５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ中での洗浄（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃で４０％〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハイブリダイゼーションと、５５℃〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハイブリダイゼーションと、６０℃〜６５℃での０．１×ＳＳＣの洗浄を含む。任意により、洗浄緩衝溶液は、約０．１％から約１％のＳＤＳを含む場合もある。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約２４時間未満であり、通常は約４時間〜約１２時間である。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数でもあり、最終洗浄液のイオン強度および温度により影響を受ける。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはMeinkothおよびWahlの式（Anal. Biochem. 138: 267-284, 1984）から概算される。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌである。ここでＭは、一価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合、％ホルムアミドは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッド長さである。Ｔｍは、相補的なターゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨに基づく）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃下がる。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、異なる度合いの相補性を有する配列に対してハイブリダイズするために調整することができる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列は、Ｔｍを約１０℃下げることによりハイブリダイズできる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列およびその相補体の熱融解点（Ｔｍ）よりも低くなるよう選択される。例えば、高ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１、２、３、４または５℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。中程度のストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。低ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。上記式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成と望ましいＴｍを使用することにより、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本来的に記載されていることを理解するだろう。望ましい程度のミスマッチは、４５℃未満（水溶性溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍの結果になるとすれば、より高温を利用できるようにＳＳＣ濃度を高めることができる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Pt I, Chapter 2, Elsevier, New York, 1993）、Ausubel et al.編（Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995）およびSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989）に述べられている。
【００７９】
本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨ核酸の例としては、配列番号１のオーソログであるコード領域を有する核酸が含まれる。
【００８０】
例えば、配列番号１のオオムギ（Hordeum vulgare）コード領域オーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。配列番号１のイネ（Oryza sativa）コード領域オーソログには、例えば、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。配列番号１のコムギ（Triticum aestivum）コード領域オーソログには、例えば、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。
【００８１】
本発明により想定されるＣｓｌＨ核酸はまた、１以上の非翻訳領域、例えば３’および５’非翻訳領域、および／またはイントロンを含んでもよい。例えば、本発明により想定されるＣｓｌＨ核酸は、例えば、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはゲノムヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
いくつかの特定の実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、１以上の非タンパク質コード領域および／または１以上のイントロンを含んでもよい、生物由来のゲノムヌクレオチド配列を含む。ＣｓｌＨ核酸を含むゲノムヌクレオチド配列としては、例えば以下が挙げられる：
オオムギ（Hordeum vulgare）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号９および／または配列番号７１に示される配列；
イネ（Oryza sativ）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２のいずれか１以上に示される配列；ならびに／あるいは
コムギ（Triticum aestivum）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号７８、配列番号７９および／または配列番号８０のいずれか１以上に示される配列。
【００８３】
上記の通り、本発明は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節する方法を提供する。本発明は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することができる任意の方法を包含する。
【００８４】
ＣｓｌＨ核酸の発現に関して「調節する」という用語は、一般的に、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳を増加または減少させることを指す。「減少させる」とは、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、 ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を包含している。「増加させる」とは、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加を包含している。調節することはまた、通常特定の細胞中では見いだされないＣｓｌＨ核酸の発現を導入すること、または通常当該活性を有する細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現の実質的に完全な阻害（例、ノックアウト）を含む。
【００８５】
細胞中の特定の核酸分子の発現を調節する方法は、当技術分野において公知であり、本発明ではそのような任意の方法を包含する。ＣｓｌＨ核酸の発現を調節する典型的な方法は、内在性ＣｓｌＨ核酸の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションさせるような細胞の遺伝的改変、ＣｓｌＨ核酸での形質転換による遺伝的改変、細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発現を調節する核酸分子の細胞への投与などを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸の発現を、細胞の遺伝子的改変により調節する。本明細書において用いられる「遺伝的に改変された」という用語は、細胞の遺伝的に改変されていない形態に比べて、遺伝的に改変された細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現の改変に影響を及ぼす任意の遺伝的改変を含むと理解されるべきである。本明細書において包含される遺伝的改変の典型的なタイプとしては、トランスポゾン、化学物質、紫外線またはファージ突然変異誘発などのランダム突然変異誘発と、内在性ＣｓｌＨ核酸を過剰発現または過小発現する変異体の選別；細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現および／または過剰発現を指令する１以上の核酸分子の、細胞への一過的または安定的導入；内在性ＣｓｌＨ核酸の部位特異的突然変異誘発；細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発現を阻害する１以上の核酸分子、例えば、コサプレッション構築物またはＲＮＡｉ構築物の導入などが挙げられる。
【００８７】
1つの特定の実施形態において、遺伝的改変は対象となる細胞への核酸の導入を含む。
【００８８】
核酸は、例えば、SambrookおよびRussell（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）に述べられたものなど、使用される細胞種に適した、当技術分野において公知の任意の方法を用いて導入することができる。
【００８９】
細胞が植物細胞である本発明のいくつかの実施形態において、核酸分子の導入のための適切な方法には、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバードメントに基づく形質転換方法および直接的ＤＮＡ取り込みに基づく方法が挙げられる。Roa-Rodriguez et al.（Agrobacterium-mediated transformation of plants, 3rd Ed. CAMBIA Intellectual Property Resource, Canberra, Australia, 2003）は、広範な植物種について、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の植物形質転換方法を総説している。マイクロプロジェクタイルボンバードメントは、植物組織を形質転換したり、植物、特に穀類植物の形質転換方法に使用されている。また、当該方法は、Casas et al.（Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 1995）により総説されている。プロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの直接的なＤＮＡ取り込みによる形質転換プロトコルは、Galbraith et al.（編）（Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Press, San Diego, 1995）に詳しく述べられている。上記方法に加えて、さまざまな他の形質転換プロトコルを用いてもよい。例えば、浸潤、細胞および組織のエレクトロポレーション、胚のエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、花粉管経路、炭化ケイ素およびリポソーム媒介による形質転換が挙げられる。これらのような方法は、Rakoczy-Trojanowska（Cell. Mol. Biol. Lett. 7: 849-858, 2002）により総説されている。他のさまざまな植物形質転換方法もまた、当業者にとって明らかなものである。
【００９０】
導入される核酸は、一本鎖であってもまたは二本鎖でもよい。核酸は、ｍＲＮＡに転写され、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたは別のタンパク質に翻訳される。また核酸は、ＲＮＡｉ構築物、コサプレッション構築物、アンチセンスＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｎｔＲＮＡなどのような非翻訳ＲＮＡをコードしてもよく、あるいは、直接細胞中で作用してもよい。導入された核酸は、未修飾のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはヌクレオチド塩基、糖もしくはリン酸骨格に対する修飾を含むが、核酸に対する機能的等価性を保持する修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡの場合がある。導入された核酸は、細胞中で任意により複製されてもよいし、細胞の染色体または染色体外エレメントに組み込まれてもよいし、ならびに／あるいは、細胞により転写されてもよい。導入された核酸はまた、宿主細胞に関して同種または異種のいずれかでよい。すなわち、導入された核酸は、遺伝的に改変された細胞と同じ生物種の細胞から得られるか（すなわち同種）、または導入された核酸は、異なる生物種から得られる（すなわち異種）。トランスジーンは、合成トランスジーンでもよい。
【００９１】
１つの特定の実施形態において、本発明は、ＣｓｌＨ核酸を細胞において発現、過剰発現または細胞に導入することにより、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増加させることを包含する。
【００９２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列を同定することにより、さらなる実施形態において、本発明は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をダウンレギュレーションする方法も提供する。
【００９３】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ遺伝子の同定は、以下などの方法による細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのノックアウトまたはノックダウンなどの方法を容易にする：
ノックアウト構築物との相同組換えによる、細胞中のＣｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、細胞中のＣｓｌＨ核酸の挿入突然変異（植物での標的化遺伝子破壊の例としては、Terada et al., Nat. Biotechnol. 20: 1030-1034, 2002を参照）；
細胞中のＣｓｌＨ核酸の転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡｉ（ＰＴＳＧおよびＲＮＡｉの総説については、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およびHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするアンチセンス構築物での細胞の形質転換（植物のアンチセンス抑制の例については、van der Krol et al.、Nature 333: 866-869、van der Krol et al.、BioTechniques 6: 958-967、およびvan der Krol et al.、Gen. Genet. 220: 204-212を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするコサプレッション構築物での細胞の形質転換（植物のコサプレッションの例については、van der Krol et al.、Plant Cell 2(4): 291-299を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とする二本鎖ＲＮＡをコードする構築物での細胞の形質転換（ｄｓＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については、Waterhouse et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをコードする構築物での細胞の形質転換（ｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については、Lu et al.、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10.1093/nar/gnh170, 2004を参照）；ならびに／あるいは
ＣｓｌＨ核酸と機能的に連結されるようなｍｉＮＲＡ標的配列の挿入（例えば、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子抑制の例については、Brown et al., Blood 110(13): 4144-4152, 2007参照）。
【００９４】
本発明は、細胞に投与されるＣｓｌＨ核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどの合成オリゴヌクレオチドの利用によって、細胞中のＣｓｌＨ核酸のダウンレギュレーションも促進するものである（合成ｓｉＲＮＡ介在抑制の例については、Caplen et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001、Elbashir et al.、Genes Dev. 15: 188-200, 2001、Elbashir et al.、Nature 411: 494-498, 2001、Elbashir et al.、EMBO J. 20: 6877-6888, 2001、およびElbashir et al.、Methods 26: 199-213, 2002を参照）。
【００９５】
上記例の他に、導入された核酸は、ＣｓｌＨ核酸に直接関係しないヌクレオチド配列を含むこともあるが、それでも、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を直接的または間接的に調節することがある。例としては、細胞中の内在性ＣｓｌＨ核酸分子の発現を促進するまたは抑制する転写因子または他のタンパク質をコードする核酸分子、直接的または間接的に内在性のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現を促進または抑制する他の非翻訳ＲＮＡなどがある。
【００９６】
遺伝的に改変された細胞中での導入核酸の発現を達成するため、必要に応じ、導入核酸は１以上の制御配列に機能的に連結されてもよい。「制御配列」という用語は、機能的に連結された核酸またはそれによりコードされる転写産物もしくはタンパク質の転写、翻訳およびまたは翻訳後修飾に必要なまたは有利な任意のヌクレオチド配列を含むと理解されるべきである。各制御配列は、機能的に連結された核酸に対し生来的でもまたは外来性でもよい。制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチドをコードする配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流の活性化配列、シグナルペプチドをコードする配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、制御配列はプロモーターを少なくとも含む。
【００９７】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、細胞中の核酸分子の発現を実現する、活性化する、または増強する任意の核酸をいう。プロモーターは、一般的に、プロモーターが制御する遺伝子の５'（上流）に位置させる。異種プロモーター／遺伝子の組み合わせである構築物において、プロモーターと遺伝子（該プロモーターが自然環境において制御する遺伝子、すなわち該プロモーターが由来する遺伝子）との間の距離にほぼ等しい遺伝子転写開始部位からの距離に、プロモーターを配置することが望ましい。当技術分野において周知の通り、この距離の変更は、プロモーター機能を失うことなく収めることができる。
【００９８】
プロモーターは、物理応力、病原体または特に金属イオンなどの外部刺激に反応して、あるいは１以上の転写活性化因子に反応して発現が生じる細胞、組織、器官または発生段階に関し、構成的に、または特異的に、機能的に連結したヌクレオチドの発現を制御してもよい。つまり、本発明の方法に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的のプロモーターまたは活性化プロモーターを含んでもよい。
【００９９】
本発明は、対象となる細胞で活性を有する任意のプロモーターを使用することを包含している。つまり、細菌、真菌、動物細胞または植物細胞のいずれかで活性を有する多様なプロモーターは、当業者であれば容易に理解するだろう。しかし、いくつかの実施形態においては、植物細胞を使用する。これらの実施形態では、植物で活性な構成的、誘導性、組織特異的または活性可能なプロモーターが典型的に使用される。
【０１００】
植物の構成的プロモーターは、通常植物のほぼ全ての組織での発現を指令し、環境および発生的要因からは、概ね独立している。本発明に従い使用することができる構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ（ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓ）プロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）から得られるノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーターなど、アグロバクテリウム種（Agrobacterium spp.）より得られるオパインプロモーターなどの細菌性植物病原体由来のプロモーター、およびルビスコ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ）プロモーター、植物ユビキチンプロモーター（Ｐｕｂｉ）、イネアクチンプロモーター（Ｐａｃｔ）およびオートムギグロブリンプロモーターなどの植物由来のプロモーターが含まれる。
【０１０１】
「誘導性」プロモーターには、化学的に誘導可能なプロモーターおよび物理的に誘導可能なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。化学的に誘導可能なプロモーターは、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化学化合物により制御される活性を有するプロモーターを含む。化学的に誘導可能なプロモーターの例には、アルコール制御プロモーター（例、欧州特許第６３７３３９号参照）、テトラサイクリン制御プロモーター（例、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号参照）、グルココルチコイド受容体プロモーター（例、米国特許第５，５１２，４８３号参照）、エストロゲン受容体プロモーター（例、欧州特許出願第１ ２３２ ２７３号参照）、エクジソン受容体プロモーター（例、米国特許第６，３７９，９４５号参照）などのステロイド反応プロモーター、メタロチオネインプロモーター（例、米国特許４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号参照）などの金属応答プロモーター、ならびにキチナーゼプロモーターまたはリゾチームプロモーター（例、米国特許第５，６５４，４１４号参照）またはＰＲタンパク質プロモーター（例、米国特許第５，６８９，０４４号、米国特許第５，７８９，２１４号、豪州特許第７０８８５０号、米国特許第６，４２９，３６２号参照）などの病因関連プロモーターを含む。
【０１０２】
誘導性プロモーターは、温度（高温、低温とも）、光などの非化学的環境要因により制御される物理的に制御されるプロモーターである場合もある。物理的に制御されるプロモーターの例には、ヒートショックプロモーター（例、米国特許第５,４４７８５８号、豪州特許第７３２８７２号、カナダ国特許出願第１３２４０９７号参照）、低温誘導性プロモーター（例、米国特許第６，４７９，２６０号、米国特許第６，０８４、０８号、米国特許第６，１８４，４４３号および米国特許第５，８４７，１０２号）、光誘導性プロモーター（例、米国特許第５，７５０，３８５号およびカナダ国特許第１３２１５６３号参照）、光抑制性プロモーター（例、ニュージーランド特許第５０８１０３３号および米国特許第５，６３９，９５２号）を含む。
【０１０３】
「組織特異的プロモーター」には、選択的にまたは特異的に、生物中の１以上の特定の細胞、組織もしくは器官、および／または生物の１以上の発生段階で発現するプロモーターが含まれる。組織特異的プロモーターは、場合によっては誘導性であってもよい。
【０１０４】
植物の組織特異的プロモーターの例には、米国特許出願第２００１０４７５２５号に記載された通りの根特異的プロモーター、欧州特許第３１６４４１号、米国特許第５，７５３，４７５号および欧州特許出願第９７３９２２号に記載の通りの子房特異的および花托組織特異的プロモーターをはじめとする果実特異的プロモーター、ならびに豪州特許第６１２３２６号および欧州特許出願第０７８１８４９号および豪州特許第７４６０３２号に記載の通りの種子特異的プロモーターが含まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、種子および／または穀粒特異的プロモーターである。種子または穀粒特異的プロモーターの例には、ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ−ｂ遺伝子プロモーター（例えば、Digeon et al.、Plant Mol. Biol. 39: 1101-1112, 1999を参照）、Ｐｂｆ遺伝子プロモーター（例えば、Mena et al.、Plant J. 16:53-62, 1998）、ＧＳ１−２ 遺伝子プロモーター（例えば、Muhitch et al.、Plant Sci. 163:865-872, 2002）、グルテリンもしくはＧｔ１遺伝子プロモーター（例えば、Okita et al., J. Biol. Chem. 264: 12573-12581, 1989、Zheng et al.、Plant J. 4: 357-366, 1993、Sindhu et al.、Plant Sci. 130: 189-196, 1997、 Nandi et al.、Plant Sci. 163: 713-722, 2002を参照）、Ｈｏｒ２−４遺伝子プロモーター（例えば、KnudsenおよびMuller, Planta 195: 330-336, 1991、Patel et al.、Mol. Breeding 6: 113-123, 2000、Wong et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16325-16330, 2002を参照）、リポキシゲナーゼ１遺伝子プロモーター（例えば、Rouster et al.、Plant J. 15: 435-440, 1998を参照）、Ｃｈｉ２６遺伝子プロモーター（例えば、Leah et al.、Plant J. 6: 579-589, 1994を参照）、Ｇｌｕ−Ｄ１−１遺伝子プロモーター （例えば、Lamacchia et al.、J. Exp. Bot. 52: 243-250, 2001、Zhang et al.、Theor. Appl. Genet. 106: 1139-1146, 2003を参照）、Ｈｏｒ３−１遺伝子プロモーター（例えば、Sorensen et al.、Mol. Gen. Genet. 250: 750-760, 1996、Horvath et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1914-1919, 2000を参照）およびＷａｘｙ（Ｗｘ）遺伝子プロモーター（例えば、Yao et al.、Acta Phytophysiol. Sin. 22: 431-436, 1996、Terada et al.、Plant Cell Physiol. 41: 881-888, 2000、Liu et al.、Transgenic Res. 12: 71-82, 2003を参照）がある。１つの特定の実施形態において、種子特異的プロモーターは胚乳特異的プロモーターである。
【０１０６】
プロモーターは、本明細書において「活性化可能プロモーター」と呼ばれる、１以上の所定の転写活性化因子により活性化可能であるプロモーターでもよい。例えば、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に機能的に連結された最小プロモーターを含む場合がある。これはとりわけ、１以上の転写活性化因子のＤＮＡ結合部位を含む。
【０１０７】
本明細書に記載の通り、「最小プロモーター」という用語は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ結合部位、好ましくはＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位および／または１以上のＣＡＡＴボックスを組み入れた任意のプロモーターを含むと理解されるべきである。細胞が植物細胞である場合、最小プロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）プロモーターに由来することができる。ＣａＭＶ ３５Ｓ由来の最小プロモーターは、例えばＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの（転写開始部位の）−９０位から＋１位（−９０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−６０位から＋１位（−６０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）またはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−４５位から＋１位（−４５ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）に相当する配列を含むことができる。
【０１０８】
上述した通り、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に融合された最小プロモーターを含むことがある。ＵＡＳは、最小プロモーターを活性化するために転写活性因子を結合することが可能な任意の配列でありうる。転写活性因子の例として、例えば、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｇｃｎ４およびＡｃｅ１などの酵母由来の転写活性因子、ＶＰ１６、Ｈａｐ１（Hach et al.、J Biol Chem 278: 248-254, 2000）、Ｇａｆ１（Hoe et al.、Gene 215(2): 319-328, 1998）、Ｅ２Ｆ（Albani et al.、J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000）、ＨＡＮＤ２（Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277: 12604-12612, 2002）、ＮＲＦ−１およびＥＷＧ（Herzig et al.、J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000）、Ｐ／ＣＡＦ（Itoh et al.、Nucl Acids Res 28: 4291 - 4298, 2000）、ＭａｆＡ（Kataoka et al.、J Biol Chem 277: 49903-49910, 2002）、ヒト活性転写因子４（LiangおよびHai、J Biol Chem 272: 24088 - 24095, 1997）、Ｂｃｌ１０（Liu et al.、Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1-6, 2004）、ＣＲＥＢ−Ｈ（Omori et al.、Nucl Acids Res 29: 2154 - 2162, 2001）、ＡＲＲ１およびＡＲＲ２（Sakai et al.、Plant J 24(6): 703-711, 2000）、Ｆｏｓ（Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5351-5356, 2000）、ＨＳＦ４（Tanabe et al.、J Biol Chem 274: 27845 - 27856, 1999）、ＭＡＭＬ１（Wu et al.、Nat Genet 26: 484-489, 2000）などのウイルス由来の転写活性因子が挙げられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＵＡＳは、少なくともＧＡＬ４転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと結合可能なヌクレオチド配列を含む。ＵＡＳ配列は、少なくともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含む転写活性因子と結合する配列であり、本明細書において、ＵＡＳＧと呼ぶ。特定の実施形態において、ＵＡＳＧは、配列5’-CGGAGTACTGTCCTCCGAG-3’またはその機能的ホモログを含む。
【０１１０】
本明細書に記載の通り、ＵＡＳＧ配列の「機能的ホモログ」は、少なくともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと結合でき、ＵＡＳＧヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも８０％の同一性または少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む任意のヌクレオチド配列をいうと理解されるべきである。
【０１１１】
活性化可能プロモーター中のＵＡＳ配列は、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の多数のタンデムリピートを含んでもよい。例えば、ＵＡＳＧはその天然の状態においては、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の４つのタンデムリピートを含む。したがって、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列のタンデムリピートの数に関して本明細書において用いられる「多数」という用語は、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのタンデムリピートを含むと理解されるべきである。
【０１１２】
上記の通り、制御配列は、ターミネーターも含むことがある。「ターミネーター」という用語は、転写終了のシグナルを示す転写ユニットの終端にあるＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であって、一次転写産物の３’末端に対してポリアデニル化配列の付加を促進する。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、使用しようとする細胞、組織または器官で機能的な任意のターミネーター配列であってもよい。植物細胞中で有用でありうる適切なターミネーター配列の例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）ターミネーター、ｐｉｎＩＩおよびｐｉｎＩＩＩターミネーターなどのジャガイモのプロテイナーゼ阻害遺伝子（ｐｉｎ）ターミネーターが含まれる。
【０１１３】
細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することにより、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを調節することは、いくつかの産業上の用途がある。
【０１１４】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、粘性溶液を形成することで知られている。水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの粘性を生じる物性は穀類加工の多くの局面において重要な決定因子である。例えば、オオムギ麦芽および穀類添加物由来の不完全に分解された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、麦汁およびビールの粘性に寄与できるが、麦汁分離およびビールのろ過における問題を伴う（例、Bamforth、Brew. Dig. 69 (5): 12-16, 1994を参照）。したがって、例えばいくつかの実施形態において、本発明は、ビール製造への適性を高めるため、オオムギ粒の１以上の細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減じることにより、オオムギ粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを減じるために適用することもできる。
【０１１５】
水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ブタや家禽などの単胃動物に対して反栄養的な効果（antinutritive effect）をもたらすとも考えられている。「反栄養的」な効果は、胃内容物の粘度を高め、消化酵素の放散および酵素作用の分解産物の吸収を遅らせることである。言い換えれば、これは成長率を遅らせることにつながる。さらに、家禽の飼料配合において、高い（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、「粘性の」糞に関係しており、これは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの消化性が低いことを示し、かつ生産者にとって主要な取扱いおよび衛生上の問題になりうる。したがって、別の実施形態において、本発明は、動物飼料としての植物の適合性を改善するため、動物飼料に使用される植物の１以上の細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを低下させるのに適用することができる。
【０１１６】
しかしながら、穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ヒトおよび動物の食事における食物繊維の重要な構成要素である。本明細書において用いられる「食物繊維」という用語は、大腸における完全なもしくは部分的な発酵とともにヒト小腸での消化および吸収に抵抗性を示す植物の可食部または類似の炭水化物を含むと理解されるべきである。「食物繊維」は、多糖類（特に（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む）、オリゴ糖、リグニンおよび関連する植物物質を含む。少なくともヒトの食事において、食物繊維は、全般的な腸の調子、便通、血中コレステロールの低減、および／または血中グルコールの低減を含めた有益な生理的効果を促進する。
【０１１７】
ヒトおよび単胃動物は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを分解する酵素を作らないが、いくぶんかの脱重合が胃および小腸で発生していることが示されている。これは、片利共生微生物の活性によるものと推測される。水溶性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンと他の非デンプン質の多糖類を比較すると、腸内細菌により容易に発酵し、可消化エネルギーにわずかながら寄与する。単胃動物における反栄養的効果とは対照的に、ヒトにおける高濃度のオートムギおよびオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に食事後の血糖値およびインスリン反応を抑えることにより、非インスリン依存の糖尿病にとって有益な効果をもたらす。食物中高濃度の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン（例えば２０％ｗ／ｖ）は、食物から食物コレステロールまたは胆汁酸の吸収を抑えることにより、血清コレステロール濃度を下げることにも関連付けられている。
【０１１８】
したがって、別の実施形態において、本発明は、植物またはその部分中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを高めることにより、食用植物または食用植物部分の食物繊維含有量を増加させることに適用することもできる。いくつかの実施形態において、食用植物または植物の可食部分は、穀類植物またはその一部である。
【０１１９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に（１→３）−β−Ｄ−グルカンにおいて、他のいくつかの多糖類と同じく、細網内系統の細胞の受容体との結合により媒介されるプロセスにより、ヒトの免疫反応を変化させるとも考えられている。さらに、血中の抗体が産生される前に、最初の防衛線として発動するシステムである、ヒトの補体経路のタンパク質を活性化する能力を有することがある。
【０１２０】
本発明は、組換え発現系における（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成も促進する。例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制御下にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換え技術によって生成することもでき、続いて細胞はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを発現し、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを生成する。
【０１２１】
ＣｓｌＨ核酸を発現させるために使用することができる多様な組換え発現系は当技術分野において周知である。組換え発現系の例は、大腸菌発現系などの細菌発現系（Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 411-421, 1999 おいて総説されている。例：Gene expression in recombinant microorganisms, Smith (編), Marcel Dekker, Inc. New York, 1994、およびProtein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, Baneyx (編), Chapters 2 and 3, Horizon Bioscience, Norwich, UK, 2004も参照）、バシラスｓｐｐ．発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 4を参照）、およびストレプトミセスｓｐｐ．発現系（例：Practical Streptomyces Genetics, Kieser et al.(編), Chapter 17, John Innes Foundation, Norwich, UK, 2000を参照）、サッカロミセスｓｐｐ．、シゾサッカロミセス・ポンベ、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）およびピチアｓｐｐ．の発現系、ならびに糸状菌発現系などの酵母発現系を含む真菌発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapters 5, 6および7、Buckholz and Gleeson, Bio/Technology 9(11): 1067-1072, 1991、Cregg et al.Mol. Biotechnol. 16(1): 23-52, 2000、CereghinoおよびCregg, FEMS Microbiology Reviews 24: 45-66, 2000、Cregg et al.、Bio/Technology 11: 905 - 910, 1993を参照）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づく発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 9を参照）、バキュロウイルス発現系を含む昆虫細胞培養（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 8、KostおよびCondreay, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 428-433, 1999、Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual WH Freeman & Co., New York, 1992、およびThe Baculovirus Expression System: A Laboratory Manual, Chapman & Hall, London, 1992を参照）、タバコ、ダイズ、イネおよびトマト細胞発現系などの植物細胞発現系（例：Hellwig et al.、Nat Biotechnol 22: 1415-1422, 2004の概説を参照）などを含む。
【０１２２】
したがって、第３の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップおよびその単離されたＣｓｌＨ核酸を細胞に発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、細胞は、先に定義された通りの組換え発現系から得られる細胞である。
【０１２４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンも提供する。
【０１２５】
第５の態様において、本発明は、
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
を含む細胞を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本発明の第５の態様の細胞は、本明細書に記載された本発明の第１または第２の態様の方法で作製される。別の実施形態において、細胞は植物細胞、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞および／または穀類植物細胞である。
【０１２８】
さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【０１２９】
本明細書では、「多細胞構造物」は、１以上の細胞の任意の凝集物を含む。したがって、「多細胞構造物」という用語は特に組織、器官、生物全体およびその一部を包含する。さらに、多細胞構造物は同様に、コロニー、植物カルス(plant calli)、懸濁培養物などの培養細胞の多細胞凝集物を包含すると理解されるべきである。
【０１３０】
上記の通り、本発明のいくつかの実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第６の態様に係る１以上の植物細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料または培養植物組織を含む。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀類植物を提供する。
【０１３２】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀粒を提供する。
【０１３３】
したがって、第７の態様において、本発明は、そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸分子を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒を提供する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、穀粒は、同種と野生型穀粒を比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが高くてもよい。別の実施形態において、穀粒は、同種由来の野生型穀粒と比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが低くてもよい。
【０１３５】
穀粒がコムギ粒であるいくつかの実施形態において、コムギ粒は、風乾全粒の生体重基準で少なくとも１％、少なくとも１．１％、少なくとも１．２％、少なくとも１．３％、少なくとも１．４％、少なくとも１．５％、少なくとも１．６％、少なくとも１．７％、少なくとも１．８％または１．９％の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを含む。
【０１３６】
第８の態様において、本発明は、以下：
本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
【０１３７】
したがって、本発明の第７の態様である穀粒を製粉して生産される穀粉は、例えば、本発明の第９の態様の穀粉の約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％または１００重量％から構成されてもよい。
【０１３８】
本明細書に述べるように、「製粉」は、Brennan et al.（Manual of Flour and Husk Milling, Brennan et al.（編）、 AgriMedia, ISBN: 3-86037-277-7）に述べられた製粉などの、穀粒を製粉する当技術分野において周知の任意の方法を包含する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、穀粉に使用される本発明の第７の態様である穀粒を製粉して製造される穀粉は、野生型粉と比較した場合により高いレベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む。
【０１４０】
「１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉」は、先に定義された任意の穀類植物から得られる穀粒を製粉して製造される穀粉である。本発明の第８の態様である穀粉の成分は、例えば０重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％または９０重量％を構成してもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉は、小麦粉である。また、これにより本発明の第８の態様の穀粉は、パン、ケーキ、ビスケットなどを調理するのに特に適している。
【０１４２】
上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定および単離に基づく。
【０１４３】
したがって、第９の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した単離されたＣｓｌＨ核酸分子、又はその相補体、逆相補体若しくは断片を提供する。
【０１４４】
本発明において、「単離された」とは、元の環境（例えば、それが天然に存在するならば天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、「人の手によって」その天然の状態から改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部とすることができ、又は細胞内に含まれてもよく、そのベクター、組成物、または特定の細胞は該ポリヌクレオチドの元の環境ではないので、依然として単離されている。「単離された」核酸分子は同様に、当技術分野において公知の方法を用いた化学合成によりまたはインビトロでの増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応など）により作製されるものを含めて、合成核酸分子を含むと理解されるべきである。
【０１４５】
本発明の単離された核酸分子は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。これは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。例えば、本発明の単離された核酸分子は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合でよいＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を含んでもよい。さらに、単離された核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領域から構成されてもよい。単離された核酸分子は、安定性または他の理由により修飾された１以上の塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでよい。「修飾」塩基は、例えば、イノシンなどのトリチル塩基および通常のものでない塩基を含む。さまざまな修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して実施することができることから、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を含む。
【０１４６】
上記の通り、本発明は、ヌクレオチド配列の断片を提供する。ヌクレオチド配列の「断片」とは、少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０または６００ヌクレオチド（ｎｔ）長とすべきである。これらの断片には、以下に限定されないが、診断用プローブおよびプライマーを含む多数の用途がある。もちろん、６０１〜３０００ｎｔ長のものなどのより大きな断片も、全てではないが、ＣｓｌＨ核酸の大部分に対応する断片と同様、本発明において有用である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、断片は、ＣｓｌＨ核酸の機能的断片を含みうる。すなわち、本発明のポリヌクレオチド断片は、本明細書に定義される通りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を有するポリペプチドをコードしうる。
【０１４８】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【０１４９】
ベクターまたは構築物は、さらに１以上の宿主の複製起点、１以上の宿主中で活性である選択可能なマーカー遺伝子、または細胞中で単離された核酸分子の転写を可能にする１以上の制御配列のうちの１以上を含んでもよい。
【０１５０】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、細胞により発現される場合に、これら形質転換された細胞の同定および／または選択を促進する表現型を細胞に与える任意のヌクレオチド配列を含む。適切な選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の範囲は、当技術分野において周知である。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の例は、抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、抗生物質オーレオバシジンＡに対する耐性を与えるＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｎｐｔＩおよびｎｐｔＩＩ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｈｐｔ）など、除草剤耐性遺伝子、例えばグルホシネート（glufosinate）、ホスフィノトリシンまたはビアラホス耐性遺伝子、例えばホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子（例：ｂａｒ）、３−エノイルピルビルシキミ酸（shikimate）５−リン酸塩シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするグリホサート耐性遺伝子（例：ａｒｏＡ）、ブロミキシニル（bromyxnil）ニトリラーゼをコードする遺伝子をはじめとするブロミキシニル（bromyxnil）耐性遺伝子、ジヒドロプテレート（dihydropterate）シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホンアミド（salfonamide）耐性遺伝子（例：ｓｕｌ）およびアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホニル尿素耐性遺伝子、ＧＵＳおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子などの酵素コードレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子、ならびに、とりわけルシフェラーゼ遺伝子などの発光に基づくレポーター遺伝子を含む。
【０１５１】
さらに、選択可能なマーカー遺伝子は、構築物中の個々のオープンリーディングフレームであるか、あるいはＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドとの融合タンパク質として発現する場合もあることに注目すべきである。
【０１５２】
本発明の第１０の態様は、本明細書に記載の通り、原核生物または真核生物中の遺伝子構築物の維持および／または複製、ならびに／あるいは遺伝子構築物またはその一部を原核生物または真核生物細胞のゲノムに組み込ませることを意図した、ヌクレオチド配列をさらに含む、本質的に全ての遺伝子構築物に及ぶ。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により植物細胞に少なくとも一部移入されるようにつくられる。したがって、ベクターまたは構築物は、左および／または右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。
【０１５４】
適切なＴ−ＤＮＡ境界配列は、当業者によって容易に確認されよう。しかしながら、「Ｔ−ＤＮＡ境界配列」という用語は、アグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp）の細胞からアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を受けやすい植物細胞に移入される核酸分子の範囲を定める、実質的に相同のおよび実質的に直接反復性のヌクレオチド配列を含む。例えば、PeraltaおよびReamによる論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(15): 5112-5116, 1985）およびGelvinの概説（Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1): 16-37, 2003）を参照されたい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介して植物に移入するためにつくられているが、本発明は、例えばBroothaerts et al.（Nature 433: 629-633, 2005）に記載されているようなアグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp.）以外の細菌を介して、細菌媒介による植物細胞への導入を促進する遺伝子構築物に対する任意の適切な改変も包含している。
【０１５６】
当業者は、所望であれば、本明細書に記載された構築物をどのように作製するか、また、所望の条件下で特定の細胞または細胞種でその発現を得るための必要条件を知るであろう。特に、本発明を実施するために必要な遺伝子操作は、大腸菌細胞などの原核細胞または植物細胞もしくは動物細胞での、本明細書に記載の遺伝子構築物またはその誘導体の増殖を必要とすることが、当業者に公知であろう。核酸分子をクローニングするための方法例は、Sambrook et al.（2000, 前記）に述べられている。
【０１５７】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様の単離された核酸分子または本発明の第１０の態様の遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
【０１５８】
本発明の第１０もしくは第１１の態様の単離された核酸分子、または本発明の第１２の態様の遺伝子構築物は、当技術分野において周知の任意の手段を介して細胞中に導入することができる。
【０１５９】
上記に言及される単離された核酸分子または構築物は、エピソーム（例：プラスミド、コスミド、人工染色体または同様のもの）の一部分として、ＤＮＡ分子として細胞中に維持されてもよいし、あるいは細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。
【０１６０】
本明細書において用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用語は、その最も広義な背景において、細胞の遺伝子相補体を構成するあらゆるＤＮＡを含むと理解されるべきである。したがって、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ 、葉緑体ＤＮＡ、内在性プラスミドＤＮＡなどを含むと理解されるべきである。したがって、「ゲノムに組み込まれた」という用語は、染色体への組み込み、ミトコンドリアＤＮＡへの組み込み、色素体ＤＮＡへの組み込み、葉緑体ＤＮＡへの組み込み、内在性プラスミドへの組み込みなどを包含する。
【０１６１】
単離された核酸分子は、とりわけ、細胞が単離された核酸分子を発現するように、制御配列および／またはプロモーターに機能的に連結することができる。
【０１６２】
細胞は、原核細胞または真核細胞でありうる。したがって、細胞は大腸菌細胞もしくはアグロバクテリウム属の種（Agrobacterium spp.）の細胞を含む細菌細胞、または古細菌細胞などの原核細胞とすることができる。細胞は、酵母細胞または菌糸真菌細胞などの真菌細胞、哺乳類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、または植物細胞を含む真核細胞であってもよい。特定の実施形態において、細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態において、植物細胞は、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞または穀物植物細胞である。
【０１６３】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む、本明細書において上で定義した多細胞構造物を提供する。
【０１６４】
上記の通り、いくつかの実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料または培養植物組織を特に含むと理解されるべきである。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む、単子葉植物、イネ目植物もしくは穀類植物またはその部分を提供する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む穀粒を提供する。
【０１６７】
上記の通り、本発明は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミノ酸配列も提供する。したがって、第１３の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、またはその断片を提供する。
【０１６８】
単離されたポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドイソスター（isostere）によって互いに連結されたアミノ酸を含み、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。本発明の単離されたポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当技術分野において周知である化学的修飾技術により修飾されてもよい。
【０１６９】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および／または末端を含めて、単離されたポリペプチドのどこで行われてもよい。同じ種類の修飾は、所定の単離されたポリペプチドの複数部位で同程度または種々の程度で存在してもよいことが理解されるだろう。また、本発明の単離されたポリペプチドは、多数の種類の修飾を含んでもよい。
【０１７０】
ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐しても、および／または、分岐の有無にかかわらず環状でもよい。環状の、分岐した、および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後自然プロセスの結果であっても、あるいは合成方法により作製されてもよい。
【０１７１】
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル反応、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキンチン化などのトランスファーＲＮＡ媒介によるタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる（例としては、Proteins--Structure And Molecular Properties 2nd Ed., Creighton (編), W. H. Freeman and Company, New York, 1993、Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, Johnson (編), Academic Press, New York, 1983、Seifter et al., Meth Enzymol 182: 626-646, 1990、Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663: 48-62,1992を参照）。
【０１７２】
上記の通り、本発明は、単離されたポリペプチドの断片も提供する。ポリペプチド断片は、該断片が「自立」するかまたは一部もしくは領域を形成する大きなポリペプチド内に含まれてもよい。
【０１７３】
ポリペプチド断片は、少なくとも３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸長でありうる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、断片は、機能的断片であり、従って、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を含む。しかしながら、該断片は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの１以上の生物学的機能を保有しないにもかかわらず、他の機能的活性は依然として保有されてもよい。例えば、該断片はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を欠くが、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体に対して導入および／または結合する能力を保有する。ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそれに結合する能力を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質断片は、本明細書において「ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープ」と呼ぶ。
【０１７５】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープは、３〜４個の少ないアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、例えば少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも２００個のアミノ酸残基を含んでもよい。ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの特定のエピトープが当該免疫学的活性を保有しているかどうかは、当技術分野で周知の方法により容易に判定することができる。したがって、１つのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド断片は、１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドである。
【０１７６】
１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドは、当技術分野で周知の合成および組換え方法を含むポリペプチドを生成する慣用的な手段により作製することができる。いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを持つポリペプチドは、化学合成の周知の方法を用いて合成されてもよい。例えば、Houghtenは、多数のペプチドを合成する単純な方法を述べている（Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135, 1985）。
【０１７７】
ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド、およびＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを有するポリペプチドは、例えば、本発明のＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドと結合する抗体の生成において有用である。
【０１７８】
当該抗体は、とりわけ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの検出および局在決定において、また、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドのアフィニティ精製において有用である。抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、多様な定性的または定量的イムノアッセイにおいて、慣用的に使用することができる。例えば、Harlow et al.、Antibodies:A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press 2nd Ed., 1988）を参照されたい。
【０１７９】
したがって、第１４の態様において、本発明は、上記に定義の、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【０１８０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントおよび上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１８１】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に対して免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスでありうる。
【０１８２】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよいし、あるいは異種ポリペプチドまたは固相担体材料などの異種エピトープと本発明のポリペプチドとの両者に対して特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号、ＷＯ９２／０８８０２号、ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／０５７９３号、Tutt et al.、J. Immunol. 147: 60-69, 1991、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、およびKostelny et al.、J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992を参照されたい。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用してもよい。別の実施形態において、本発明の抗体は、例えばインビトロおよびインビボ診断および治療方法の両者をはじめとする本発明のポリペプチドの精製、検出および標的化のために使用してもよい。例えば、抗体は、生体サンプル中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを定性的にかつ定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて使用しうる。例として、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）を参照されたい。
【０１８４】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、例えば、共有結合によって抗体がＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたはそのエピトープと結合するのを妨げないような任意のタイプの分子の抗体への共有結合により、修飾されている誘導体を包含すると理解されるべきである。例えば、抗体の誘導体は、例えばグルコシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより修飾されている抗体を含む。さらに、多くの化学的修飾のいずれを公知の技術によって行ってもよい。これらは特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１８５】
抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。
【０１８６】
例えば、インビボ免疫法を使用する場合、動物を遊離ペプチドで免疫してもよいが、抗ペプチド抗体力価は、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドなどの、高分子キャリアにペプチドを結合することにより、増強させることができる。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）法などのリンカーを用いてキャリアに結合させてもよく、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いてキャリアに結合させてもよい。
【０１８７】
ウサギ、ラット、マウスなどの動物は、例えば遊離ペプチドまたはキャリアを結合したペプチドを用いて、約１００マイクログラムのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内および／または皮内注射することにより、免疫することができる。例えば固体表面に吸着する遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、約２週間隔で、検出可能な抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、何回かの追加免疫注射が必要となることもある。免疫された動物の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選別により、例えば、当技術分野で周知の方法により固相支持体上へのペプチドの吸着と、選択された抗体の溶出により、高めてもよい。
【０１８８】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたは１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手法により作製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に対し特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘発するため、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等の様々な宿主動物に投与することができる。例えばフロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなど潜在的に有用なヒトのアジュバントなど、様々なアジュバントを、宿主動物種に応じて免疫反応を高めるために使用してもよい。当該アジュバントもまた、当技術分野において周知である。
【０１８９】
別の例として、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、遺伝子組換えおよびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの利用をはじめとする当技術分野で周知の多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であって、例えば、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988）およびHammerling et al.、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas （Elsecier, NY, 1981）などに教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物およびファージクローンを含む任意の単一クローンから誘導され、また抗体が生成される方法以外に由来する抗体をいう。
【０１９０】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、スクリーニングする方法は、慣用的に行われ、当技術分野で周知である。例えば、マウスは、本発明のポリペプチドまたは当該ペプチドを発現する細胞により免疫することができる。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中で検出された後、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。脾細胞は、周知の技術により、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞などの適切な骨髄腫細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドと結合することのできる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で周知の方法によりアッセイする。一般に高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを有するマウスを免疫することにより生成することができる。
【０１９１】
１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するため）パパインなどの酵素、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため）を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断により生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９２】
本発明の抗体は、当技術分野において周知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示（ディスプレイ）される。特定の実施形態において、当該ファージはレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例：ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用することができる。対象とする抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識化された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原などを使用し、選択または同定することができる。これら方法に使用されるファージは、典型的には、該ファージにより発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え技術によって融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインと共に含む、線状ファージである。
【０１９３】
ファージディスプレイ法の例としては、Brinkman et al.（J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995）、Ames et al.（J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995）、Kettleborough et al.（Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994）、Persic et al.（Gene 187: 9-18, 1997）、Burton et al.（Advances in Immunology 57: 191-280, 1994）、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号により開示された方法が挙げられる。
【０１９４】
ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、全抗体または任意の望ましい他の抗原結合性フラグメントを生成するために使用することができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌および細菌を含む、任意の望ましい宿主で発現させることができる。例えば、組換え技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを生産するための技術はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４、Mullinax et al.（BioTechniques 12(6): 864-869, 1992）およびSawai et al.（AJRI 34:26-34, 1995）およびBetter et al.（Science 240: 1041-1043, 1988）に開示された方法など当技術分野で周知の方法を用いて、使用することも可能である。
【０１９５】
一本鎖Ｆｖおよび抗体を生産するために使用可能な技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号、Huston et al.（Methods in Enzymology 203: 46-88, 1991）、Shu et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999, 1993）およびSkerra et al.（Science 240: 1038-1040, 1988）に記載されている。
【０１９６】
本発明をさらに、以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例１】
【０１９７】
オオムギはＣＳＬＨ遺伝子を１種だけ有する
オオムギ中の候補ＣＳＬＨ遺伝子を、コメＣＳＬＨ配列とともに、中止になったStanford cell wall website、NCBI、HarvEST、GrainGenes、Barley Gene IndexおよびBarley BaseなどのオンラインＥＳＴデータベースに照会することによりまず同定する。オオムギ由来の全ＣＳＬＨ関連ＥＳＴは、全長３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびタンパク質のＣＯＯＨ末端の４８８個の（予測では約７５０の）アミノ酸残基をコードする領域に含まれる約１，５００ｂｐの単一の連続配列にアライメントできた（表２）。この遺伝子をＨｖＣｓｌＨ１と名付けた。ＨｖＣｓｌＨ１由来プローブを用いたオオムギＢＡＣライブラリのスクリーニングにより、すべてがＨｖＣｓｌＨ１を含むいくつかのゲノムクローンが同定され、これにより、欠落した５’末端が得られた（データ非掲載）。単一の２，２５６ｂｐＯＲＦを含み、推定分子量８２．６ｋＤａおよびｐＩ７．０であるタンパク質をコードする、２，４３０ｂｐのＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した（図６Ａ）。ＡＲＡＭＥＭＮＯＮを用いたこの配列の概念上の翻訳の分析により、５つから９つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）が見出され、さまざまなプログラムの間のコンセンサスは、２つのＮＨ２末端および４つのＣＯＯＨ末端のＴＭＤ（図６Ｂ）であり、成熟タンパク質の両末端は、細胞質性であることが予測される。このトポロジーもまた、細胞質内にＤ，Ｄ，Ｄ，ＱＦＫＲＷモチーフを含む大型の中心ドメインを配置している（図６Ｃ）。ヌクレオチドレベルでは、ＨｖＣｓｌＨ１は、３種のコメＣＳＬＨ遺伝子と、６８〜７４％の同一性（６２〜６９％のアミノ酸同一性）を有している（実施例６を参照されたい）（Hazen et al., Plant Physiol 128: 336-340, 2002）。系統発生学的再構成は、ＨｖＣｓｌＨ１が、おそらくＯｓＣＳＬＨ１のオオムギオーソログであることを示している（図７）。Ｓｌｏｏｐ×Ｈａｌｃｙｏｎの倍加半数体集団を使用するＨｖＣｓｌＨ１の遺伝子マッピング（Read et al., Aust J Agr Res 54: 1145-1153, 2003）は、ＨｖＣｓｌＨ１は染色体２Ｈの短腕上にあり、Ｂｕｒｔｏｎらにより報告された（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）４種のＨｖＣＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、８、１０）のクラスターからおよそ１．５ｃＭであり、非発芽オオムギ穀粒中のβ−グルカン含有量を調節する主要ＱＴＬ内にあった（Han et al., Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995；図８）ことを示している。
【０１９８】
支援情報
ＢＡＣライブラリのスクリーニングを用い、全長ＨｖＣｓｌＨファミリーメンバーの完全なセットを得た。オオムギゲノム（品種モレックス）の６．５等価体を含むＢＡＣフィルターをスクリーニングし、３種の明らかに陽性のクローンを同定した（データ非掲載）。ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したこれらのクローン由来のＢＡＣ ＤＮＡのブロットを検出した場合、同じ３種のクローンである３−５−１０、３−７−３および３−７−８が陽性であると検証された。ＢＡＣ ３−５−１０および３−７−８の消化パターンは同一であると思われ、多くのバンドはＢＡＣ ３−７−３と共通であり、このことは、３種のＢＡＣはすべて、オオムギゲノムの同一の領域または非常に類似した領域を含むことを示している。ゲノムＤＮＡのブロットを同じプローブとハイブリダイズさせた場合、単一のバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶを用いて消化したレーンに観察され、ＢＡＣ消化の結果を裏付けた。すべてのＨｖＣｓｌＨ ＥＳＴもまた単一の遺伝子に由来するので（表２）、これらのデータは、オオムギゲノム中にはＣＳＬＨ遺伝子が１種だけ存在することを強く示唆している。
【０１９９】
アダプタープライマーＰＣＲ法（Siebert et al., Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995）を使用して、ＨｖＣｓｌＨ１の５’末端を同定した。ＤＮＡを、ＢＡＣ３−５−１０および３−７−３から単離し、アダプターが連結された平滑末端ＤＮＡ断片を作製するさまざまな制限酵素を用いて消化した。次いで、遺伝子の５’末端を含有する断片を増幅するために、アダプター特異的プライマーおよびＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマー（表３）を用いて、ネステッドＰＣＲを実施した。プライマーＡＰ２およびＨ１Ｒ６を使用する、ＮｒｕＩにより消化されたＢＡＣ ３−７−３ ＤＮＡの増幅により、Ｎ末端配列の約２０個のアミノ酸以外をすべて含む１．３ｋｂｐの断片を増幅することに成功した。Ｈ１Ｒ１０プライマー、すなわち１．３ｋｂ断片の５’末端近くにアニーリングするために設計されたアンチセンスプライマーを用いたＢＡＣ ３−７−３ＤＮＡの直接配列決定は、オープンリーディングフレームの残り＋配列の上流の７４８ｂｐの同定を可能にした。先に得られた結果から予測されたように、ＢＡＣ ３−５−１０から得られた配列はＢＡＣ ３−７−３と同一であり、オオムギゲノム内にＣＳＬＨ遺伝子が１種だけ存在することが確認された。
【表２】
【０２００】
【表３】
【０２０１】
【実施例２】
【０２０２】
シロイヌナズナにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発現は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの堆積をもたらす
シロイヌナズナにおける異種発現のために、ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦを、Ｇａｔｅｗａｙを可能にするバイナリーベクターのｐＧＷＢ１５にクローニングし（Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007；図１５）、ＨｖＣｓｌＨ１をＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下に置き、３×ＨＡエピトープタグをコードされるタンパク質のＮＨ２末端に付加した（図１Ａ）。形質転換シロイヌナズナ種子の初期選択により、ＰＣＲでＨｖＣｓｌＨ１の含有が確認されたいくつかの推定トランスジェニック実生を同定した。これらのＴ１植物のＲＮＡブロット分析により、ロゼット葉中におよそ９０％のＨｖＣｓｌＨ１転写産物が蓄積したことが示された（図１Ｂ）。抗ＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用して、これらの系統におけるＨｖＣｓｌＨ１タンパク質を検出した（図１Ｃ）。混合したミクロソーム膜の分画（５０，０００〜１００，０００×ｇのペレット）を、プールされた３週齢のカナマイシン耐性Ｔ２実生から調製した。抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングは、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を含有する２８の系統のうちわずか４系統だけが予想サイズ（約９０ｋＤａ）のポリペプチドを蓄積したことを示した（図１Ｃ）。分子量がより大きいタンパク質およびより小さいタンパク質が検出されることもあった（例えば、レーン１１）。９０ｋＤａのタンパク質は、総タンパク質抽出物（データ非掲載）または非形質転換シロイヌナズナ植物から調製された混合膜分画（図１Ｃ、Ｃｏｌ−０レーン）中には観察されなかった。ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１が、ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡを発現する植物系統の一部だけに蓄積する理由、あるいは、ＨｖＣｓｌＨ１のタンパク質レベルと、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物のレベル（図１ＢおよびＣを比較されたい）または植物中に存在するＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンの数（データ非掲載）のいずれかとの間に相関がない理由は知られていないが、このことは以前から観察されていた（Burton et al., Science 311: 1940-1742, 2006）。ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１を発現する８、１１、１６および２４系統と検出可能なレベルのタンパク質を発現しない６系統（対照）を、次の実験のために選択した。
【０２０３】
免疫ＥＭを使用して、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の細胞壁が検出可能なレベルのβ−グルカンを蓄積するかどうかを決定した。８、１１、１６、２４および６系統の自家受粉子孫（Ｔ２世代）由来の成葉片の切片を、β−グルカンに特異的なモノクローナル抗体で検出し（Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994）、その後１８ｎｍの金粒子と結合した二次抗体を使用して検出した。金粒子は、ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１陽性の８、１１および１６系統（それぞれ、図２Ａ、Ｃ、Ｂ）の細胞壁中に明らかであるが、ＨｖＣｓｌＨ１を発現した（データ非掲載）２４系統または検出可能なＨｖＣｓｌＨ１タンパク質を有さなかった６系統（図２Ｅ）のいずれにおいても細胞壁中に明らかではなかった。各陽性トランスジェニック系統は、組織標識の異なるパターンを示した。８系統において、表皮細胞壁、時として木部壁にまばらな標識が観察されるが（図２Ａ）、一方１１系統では、表皮壁および維管束組織壁はわずかに標識されただけであるが、より強い（よりまばらではあるが）標識が葉肉壁において観察された（図２Ｃ）。広範囲に分布する明るい標識が、１６系統の成葉の細胞壁すべてに存在した（図２Ｂ）。「構成的に」発現される３５Ｓプロモーターにより駆動される遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統による異所性多糖類産生の不規則かつ非一貫性のパターンは、以前から観察されている（Burton et al., 2006,上記）。非形質転換シロイヌナズナの葉の切片においては、標識は見られなかった（図２Ｄ）。標識レベルの低下は、このβ−グルカンを特異的に加水分解する枯草菌（Bacillus subtilis）のエンドヒドロラーゼとともにプレインキュベートを行ったトランスジェニック植物の葉切片に見られた（Burton et al., 2006,上記、データ非掲載）。
【０２０４】
トランスジェニックシロイヌナズナの細胞壁にβ−グルカンが存在することの生化学的確認の提供、および新生β−グルカンの微細構造の調査のために、葉および／または茎材料を、植物８、１１および１６系統に由来する系統の自家受粉のＴ３およびＴ４の子孫からプールした。これらの系統は、ＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンについてホモ接合性であった。β−グルカンは、植物の年齢とともに蓄積されることが見出されたので、試料は植物が老齢になった際に採取した。細胞壁を調製し、（１，３：１，４）−β−グルカン特異的エンドヒドロラーゼを用いて消化し、放出されたオリゴ糖をＨＰＡＥＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによってプロファイルした。（１，４）−β−グルコシド結合が（１，３）−β−Ｄ−グルコシル残基の還元末端側にある場合、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼは、これらの結合を特異的に加水分解する。この酵素の作用により、さまざまな重合度（ＤＰ）の、一連のオリゴ糖が生成される。この一連の診断用オリゴ糖は三糖類のＧ４Ｇ３ＧＲおよび四糖類のＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ（式中、Ｇは、β−Ｄ−グルコピラノース、３および４は、それぞれ（１，３）および（１，４）結合を示し、ＧＲは還元末端残基を指す）。８および１１系統ならびに植物１６に由来する２種の独立した系統（１６−１および１６−２系統）由来の葉または葉および茎から調製した細胞壁を、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて処理した場合、可変量のＧ４Ｇ３ＧＲおよびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲが放出された（図３、図９Ａ）。これらのオリゴ糖は、酵素で処理しなかった対照では検出されなかった。Ｇ４Ｇ３ＧＲとＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲとの比（ＤＰ３：ＤＰ４）は、１６−１系統において３．５であることが推定され、これは、オオムギ葉試料由来のβ−グルカンに関して得られたＤＰ３：ＤＰ４比の３．６と同様である。グルコース（Ｇ３ＧＲ）の（１，３）−β結合二糖類であるラミナリビオースと同時溶出したピークが、複数の試料において、８、１１および１６−２系統においてさまざまなレベルで観察された（図９Ａ、データ非掲載）。この産物はオオムギおよび酵素未処理の対照試料には存在せず（図９Ａ）、その出現が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ調製物中の酵素の混入あるいは内在性二糖類またはシロイヌナズナ内の酵素活性によるものではないことが検証される。このプロファイルにおけるオリゴ糖の種類をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によってさらに確認し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、ＨＰＡＥＣプロファイルにおいて観察された比と同様の比でＨｅｘ２、Ｈｅｘ３およびＨｅｘ４の存在を示した（図９Ｂ）。１６−１および１６−２系統におけるβ−グルカンの量は、Ｇ４Ｇ３ＧＲのピーク面積から推定されるように、それぞれ、総細胞壁の０．００５％および０．００３％（ｗ／ｗ）であった。
【実施例３】
【０２０５】
ＨｖＣｓｌＨ１は、ＨｖＣｓｌＨ１を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の、ＥＲ関連小胞およびゴルジ関連小胞内に位置するが、細胞膜には位置しない
１１系統由来の高圧凍結葉の切片を、金標識抗ＨＡ抗体とともにインキュベートし、ＨｖＣｓｌＨ１の細胞内位置を決定した。標識は、小胞体およびゴルジ由来小胞に見出されたが、細胞膜には見出されなかった（図４Ａ、Ｂ）。同様の結果が、根および実生の標識切片において観察された（データ非掲載）。
【実施例４】
【０２０６】
オオムギにおいて、成長中の穀粒、花の組織および二次細胞壁肥厚中の葉の細胞で、ＨｖＣｓｌＨ１は、低レベルで転写される
さまざまなオオムギ組織において、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して決定した。遺伝子特異的プライマーを表４に表す。
【表４】
【０２０７】
図５（Ａ〜Ｃ）は、一連のオオムギの栄養組織および花組織のｃＤＮＡにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物が慣用的に１，０００ｓコピー／μｌ ｃＤＮＡ未満のレベルで蓄積されたことを示す。この値は、本発明者らが通常１０，０００ｓから１００，０００ｓコピー／μｌ ｃＤＮＡの範囲の値で研究した他のオオムギＣＥＳＡおよびＣＳＬの一部より低かった。ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルは、子葉鞘および葉脚を含む、急速に伸長する細胞を含む組織において比較的低く、これらは活発にβ−グルカンを合成する組織である。
【０２０８】
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルは葉頂において最も高く、ここでは、細胞はもはや活発に成長せずβ−グルカンの蓄積も減っている（図５Ｃ；２、４）。葉におけるＨｖＣｓｌＨ１の転写は、１０日齢の実生の葉頂から開始した約１３ｃｍ長の葉内の６か所の範囲から単離されたＲＮＡを使用してさらに特徴を調べた。これらの範囲は、完全に成熟した細胞（範囲Ａ）から分裂細胞を含む葉脚（範囲Ｆ）を含む。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ（実施例５を参照されたい）を使用して、ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡを含む葉頂中のそれらの細胞を同定した。この技術において、遺伝子転写産物が検出された細胞は、紫から暗い褐色に染色される（図５Ｄ、１８Ｓ ＲＮＡ陽性対照）。転写の起こらなかった細胞は、明るい褐色に染色され、陰性対照として検出される（図５Ｅ）。ＨｖＣｓｌＨ１は、維管束間の、厚膜組織の繊維細胞および木部細胞などの二次細胞壁肥厚にある細胞において大部分は転写される（図５Ｆ）。オオムギ葉から採取した切片を使用する免疫ＥＭおよびβ−グルカン抗体での検出により、これらの細胞の細胞壁中のβ−グルカンを同定した。
【０２０９】
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルを、さらに、一連の２４日の成長中の胚乳においてより詳細に調査した（図５Ｂ）。ＨｖＣｓｌＨ１の発現は、成長中のデンプン質胚乳全体で低かった。胚乳細胞壁においてβ−グルカンが最初に検出されるおよそ１日前の４ＤＰＡにおいて、最大転写レベルに達した。この転写パターンは、成長中の穀粒においてもまた発現された、いくつかのオオムギＣＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、７、８および１０）の転写パターンと同様であるが、ＨｖＣＳＬＦ９および６は、さらにより高い転写産物レベルを示す。
【実施例５】
【０２１０】
考察
本明細書に提示したデータは、イネ科植物特異的ＣＳＬＨ遺伝子ファミリーのメンバーであるＨｖＣｓｌＨ１の産物が、シロイヌナズナにおいてβ−グルカンの生合成を仲介することを示している。オオムギは、ＥＳＴデータベース分析、ゲノムＤＮＡブロット分析およびＢＡＣライブラリのスクリーニングに基づき、ＣＳＬＨ遺伝子を一つだけ有すると思われる。パンコムギ、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum）、トールフェスク（Festuca arundinacae）およびミナトカモジグサ（Brachypodium distachon）（すべてイチゴツナギ亜科（Pooideae））などの他のイネ科植物のＥＳＴ分析は、オオムギと同様の１種の同定ＣＳＬＨ遺伝子を有するが、トウモロコシ、ソルガムおよびサトウキビ（すべてキビ亜科（Panicoideae））、コメなど（エールハルタ亜科（Ehrhartoideae））は、複数のＣＳＬＨ遺伝子を有すると思われる。ＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡのエピトープタグ付加形態を、シロイヌナズナにおいて異種発現させた場合、タンパク質が検出された４つの植物系統の３つが、β−グルカン特異的モノクローナル抗体により認識された多糖類を、それらの細胞壁に蓄積した。トランスジェニック系統の単離細胞壁を、特異的（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて消化した場合、特有の三糖類（Ｇ４Ｇ３ＧＲ）および四糖類（Ｇ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ）が、オオムギ胚乳由来のβ−グルカンに見出される比と同様の比で検出され、トランスジェニックシロイヌナズナ系統由来の細胞壁が、β−グルカンを含んだことを実証する。さらに、エピトープタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１は、トランスジェニック植物細胞の小胞体およびゴルジ由来小胞において見出された。ＨｖＣｓｌＨ１を発現したトランスジェニックシロイヌナズナ系統の形態学的表現型は、野生型植物と同一であると思われる。
【０２１１】
（１，３）−および（１，４）−β−グルコシル結合の全割合ならびに１６−１系統植物に由来する細胞壁の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化からのＧ４Ｇ３ＧＲおよびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ産物の比は、オオムギ組織から単離されたβ−グルカンにおいて観察される比と同様であるが、観察された一つの独特な特徴は、１６−２系統の細胞壁から、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼにより放出される主要なオリゴ糖がラミナリビオースであることであった（Ｇ３ＧＲ；図９Ａ）。可変レベルのＧ３ＧＲの存在はまた、三糖類の四糖類に対するレベルの増加、したがってＤＰ３：ＤＰ４比の増大に関連した。大部分の植物系統の細胞壁消化物中にＧ３ＧＲが存在することは、交互の（１，３）−β−および（１，４）−β−結合のグルコシル残基（−Ｇ３Ｇ４Ｇ３Ｇ４−）の多糖類含有切片を示す。これらが個別の多糖類中に存在するか、またはさらに通常の微細構造の特徴を有するβ−グルカン鎖の一部を構成するかは分かっていない。交互の（１，３）−β−Ｄ−グルコシルおよび（１，４）−β−Ｄ−グルコシル残基は、オオムギと、他の穀類のβ−グルカンにおいて共通ではないが、非開花植物のトクサ属（Equisetum）由来のβ−グルカンの重要な成分を表し、さらに担子菌類および子嚢菌類を含む多くの真菌由来のβ−グルカン中に検出される。Ｇ３ＧＲはトランスジェニックシロイヌナズナにおけるβ−グルカンシンターゼの誤制御を介して生じる可能性があり、その膜の微小環境が異なるため、またはオオムギにおいて、（１，３）−βグルコシド結合形成を抑制する（または（１，４）−βグルコシド結合形成を促進する）未知の因子が、シロイヌナズナに最適以下のレベルで存在するためと思われる。植物１６に由来する系統の中でこの因子のレベルがわずかに変化することが、得られた構造の違いの原因であろう。β−グルカンの構造のばらつきに関する別の考えられる説明は、組み立て後のプロセシングの微妙な差に関すると思われる（さらに、下記の支援情報を参照されたい）。
【０２１２】
オオムギにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１は、組織が完全に成熟した細胞を含む葉頂で最も高度に転写された。ＨｖＣｓｌＨ１および任意のオオムギＣＳＬＦの連携転写（coordinate transcription）を示す証拠はなく、それらがコードする産物が、タンパク質複合体の成分ではないことを示唆している。例えば、ＨｖＣｓｌＨ１の転写は、オオムギにおいてβ−グルカンが特徴的に蓄積される組織である子葉鞘または成長中の胚乳などの伸長する細胞中では高くない。通常は、細胞増殖の調節、およびおそらく暗所においてエネルギー供給源として動員できるグルコースの一時貯蔵に関係すると思われる栄養組織の一次細胞壁に見出されるが、β−グルカンは、木部管状要素および厚膜組織繊維の木化細胞壁においてもまた見出され、ここでは、β−グルカンに対する抗体を使用する免疫ＥＭにより、中葉領域（一次細胞壁）と膜組織細胞の二次細胞壁との両方において標識が示される。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲは、葉中のＨｖＣｓｌＨ１遺伝子の転写が、維管束間の厚膜組織の繊維細胞および木部細胞などの細胞に限定されていることを示すので、植物中の他の場所における一次細胞壁のβ−グルカン合成における役割を除外することはできないが、この遺伝子の主要な役割は、二次細胞壁成長の間のβ−グルカン合成にあることが示唆される。
【０２１３】
β−グルカンの微細構造がどのように生じたかにかかわらず、ＣＳＬＨがシロイヌナズナにおいてβ−グルカンの合成を仲介できることは明らかであり、どのようにこの多糖類が合成されるかという本発明者らの理解に関する暗示を有する研究成果である。β−グルカンの組み立てに関すると考えられる機序は、優勢なセロトリオシルおよびセロテトラオシル単位の合成、これらの（１，４）−β−単位と単一の（１，３）−β−結合とのランダムな結合、そして三糖類単位と四糖類単位のモル比を制御する手段で説明できるはずである。少なくとも２種のグルコシルトランスフェラーゼ活性が共同して作用すると思われ、一方の活性は、（１，４）−β−結合グルコース残基を連続的に付加し、三糖類および四糖類を組み立て、他方の活性は、単一の（１，３）−β−結合を付加する。多糖類シンターゼの本発明者らの最近の知見に基づき、いくつかの機序は仮定として可能である。最も簡略な説明は、１種のポリペプチドが両方のグルコシド結合型の合成に関与していることである。本発明者らのトランスジェニック実験は、ＣＳＬＨタンパク質が独立してβ−グルカンを作ることができ、したがっておそらく両方の型のβ結合を生成することができることを示している。ＣＳＬＨファミリーは、糖質作用性酵素（Carbohydrate Active Enzymes：ＣＡＺｙ）データベースにより、グリコシルトランスフェラーゼファミリー２（ＧＴ２）のメンバーであると分類され（http://www.cazy.org; Coutinho et al., J Mol Biol 328: 307-317, 2003）、このファミリーは、（１，３）−β−または（１，４）−β−結合のいずれかの合成を独立して触媒できる酵素を含み、二機能性酵素、すなわち２種のグリコシド結合を合成できる酵素の例でもある。例えば、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）は、（１，４）−β−グルクロン酸−（１，３）−β−Ｎ−アセチルグルコサミンの繰り返し二糖単位を合成し、両方のトランスフェラーゼ活性が、１種のポリペプチドにある。マウスＨＡＳ１において、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷモチーフを含む領域は、これらの活性の両方に関与する。Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷモチーフをさらに含む、ＣＳＬＨの活性部位は、同様に二機能性であると思われる。別の可能性は、ＣＳＬＨシンターゼが、単子葉植物および双子葉植物に共通の、第２の結合の合成に関与する別のグルコシルトランスフェラーゼと、唯一のグルコシド結合を合成することである。
【実施例６】
【０２１４】
材料と方法
バイナリーベクターの構築および植物の形質転換
ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦを、オオムギ品種スクーナーの成葉頂のｃＤＮＡから、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）（Stratagene）を用い、プライマーＨｖＨ１ＴＯＰＯｆおよびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を使用して増幅し、ＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングした。製造業者（Invitrogen）のプロトコルを使用し、ＬＲ反応を使用して、ＮＨ２末端に３×ＨＡタグを含むデスティネーションベクターｐＧＷＢ１５にｃＤＮＡをクローニングし（Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007）、ＤＮＡ配列決定により、予測配列を確認した。ＨｖＣｓｌＨｌ：：ｐＧＢＷ１５構築体を、大腸菌（Escherichia coli）からアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＡＧＬ１株に、三親接合を介し、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を使用して移した。シロイヌナズナＣｏｌ−０植物を、フローラルディップ法を使用して形質転換した（Clough and Bent, Plant J 16: 735-743, 1998）。
【０２１５】
ＲＮＡブロット分析
Ｔ１植物の成熟ロゼット葉からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Invitrogen）を使用して抽出した、約１０μｇの総ＲＮＡ試料を調製し、１％ｗ／ｖアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離した（Farrell, RNA methodologies: A laboratory guide for isolation and characterization, Academic Press, Inc., San Diego, 1993）。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋膜に転写し、Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出モジュール（Amersham-Biosciences）に概説された方法に従って、プレハイブリダイズおよびハイブリダイズを行った。プライマーＨ１Ｆ２およびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を用いて増幅したＨｖＣｓｌＨ１断片を、Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅラベリングモジュール（Amersham）を使用し、製造業者のプロトコルに従って標識し、プローブとして使用した。
【０２１６】
定量的ＰＣＲ分析
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＱＰＣＲを、Burton et al.（Plant Physiol 146, 1821-1833, 2008）に記載された変法を用いて、Burton et al.（Science 311, 1940-1942, 2006; Plant Physiol 134, 224-236, 2004）に記載のように実施した。オオムギ対照遺伝子のプライマー配列を表４に記載する。
【０２１７】
ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ
ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲを、Koltai & Bird（Plant Physiol 123: 1203-1212, 2000）の方法に従って、下記の変形を加え実施した。組織を切片にした後、ゲノムＤＮＡを、３７℃において６時間、１×ＤＮａｓｅ緩衝液および４Ｕ ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（Promega）中で処理することによって取り出した。ｃＤＮＡの合成を、ＲＮａｓｅ Ｈステップを省き、遺伝子特異的プライマー（１μｇ、表３）を逆転写に使用したことを除き、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Invitrogen）を使用して実施した。ＰＣＲを、１×ＰＣＲ緩衝液、２００μｍ ｄＮＴＰ（Promega）、０．２ｎｍｏｌジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Roche）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎｇの各プライマーおよび２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含む、最終容量５０μＬ中で実施した。サイクリングパラメーターは、下記のとおりである：初期変性９６℃２分、次いで、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル。その後切片を洗浄し、１．５Ｕのアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（Roche）とともにインキュベートし、Koltai & Bird（2000、上記）により概説されたように、１０〜２０分発色させた。陰性対照切片では、逆転写酵素を省き、すべてのＨｖ １８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを含み、ゲノムＤＮＡから任意の増幅があったかどうかを確認した。
【０２１８】
混合ミクロソーム膜の調製
ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物のＴ１種子を回収し、約１００個の種子を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Sigma）を含有する１×ＭＳ寒天培地上に撒いた。３週間後、カナマイシン耐性の実生をプールし、液体窒素中で凍結し、ホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５、０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、８３μＬ植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma、P9599））を含む乳鉢および乳棒で４℃において粉砕した。ホモジネートを、５０μＭメッシュのフィルターを通してろ過し、Ｓ／Ｎを、６，０００×ｇで１０分間、４℃において遠心した。Ｓ／Ｎをデカントし、５０，０００×ｇで３０分間、４℃において、４．５ｍｌの超遠心管（Beckmann）において遠心した。５０，０００×ｇのＳ／Ｎをデカントし、ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に、ガラス−テフロンホモジナイザーを使用して再懸濁した。再懸濁したペレットを、Ｔｒｉ−ＭＥＳ緩衝液を用いて４．５ｍＬに希釈し、１００，０００×ｇで、１時間、４℃において遠心した。ペレットを、上に概説したように、０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬（BioRad）を使用して測定し、ウシ血清アルブミンを標準として使用した。
【０２１９】
ウェスタンブロッティング
膜タンパク質（３０μｇ）の試料を、６０℃において２０〜６０分間、２００ｍＭジチオスレイトールおよび試料緩衝液（３７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール、３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０２５％ブロモフェノールブルー）中でインキュベートし、ＳＤＳ：タンパク質比を１．５ｍｇＳＤＳ対３０μｇのタンパク質にして、その後８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース（ＯＳＭＯＮＩＣ（商標）Ｎｉｔｒｏｐｕｒｅ ２２μｍ）に、０．０５％ＳＤＳを含有するＴｏｗｂｉｎ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中で４℃において１００Ｖ、９０分間かけてブロットした。次いで、膜を、３％ｗ／ｖ粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）において一晩ブロッキングし、その後、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳで１：１０００に希釈したラット抗ＨＡポリクローナル抗体（Roche）中で室温で１時間インキュベートした。膜を０．０５％ＳＤＳ（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳで３回洗浄し、次いで、３％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含有するＴＢＳで１：１０００に希釈した抗ラットＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Dako）中でインキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Pierce）を用いて検出した。
【０２２０】
免疫電子顕微鏡法
シロイヌナズナ組織を固定し、Burton et al.（Science 311, 1940-1942, 2006）に従って、抗（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的抗体（Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994）を用いて標識した。抗ＨＡ抗体を用いた標識のために、植物組織を２つの銅のプランチェットの間に置き、Ｌｅｉｃａ ＥＭ高圧フリーザーにおいて急速に凍結させた（２．７×１０５ｋＰａおよび−１０，０００℃ｓ−１の適切な速度に設定する）。プランチェットを、−５０℃、７２時間に設定したＬｅｉｃａ自動凍結置換装置中で１００％エタノールに移した。試料を、室温（ＲＴ）で一晩置き、取り出し、ＬＲ Ｗｈｉｔｅ樹脂でろ過し、Burton et al.（2006、上記）に記載のようにゼラチンカプセルに包埋した。包埋した葉組織の切片をフォルムバー被覆金グリッド上に回収し、１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１：２００に希釈したラット抗ＨＡポリクローナル抗体中で室温で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。グリッドをＰＢＳで数回洗浄し、次いで、１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：２０に希釈した１８ｎｍ金（Jackson ImmunoResearch）と結合した抗ラット二次抗体中で室温で１時間インキュベートした。次いで、グリッドを洗浄し、染色後、Burton et al.（2006、上記）に記載のようにＴＥＭ下で見た。
【０２２１】
細胞壁材料の調製
アルコール不溶性画分（ＡＩＲ）を、植物材料を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を使用して粉砕することによって調製した。５倍量の８０％エタノールをホモジネートに加え、その後４℃において１時間回転することによって混合した。３，４００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、残留物を室温で８０％エタノール中で１時間、２回還流し、その後５０％エタノール中で１時間、２回還流した。エタノール可溶性画分を取り除き、ＡＩＲを１００％エタノールで１回洗浄し、その後４０℃において真空乾燥させた。
【０２２２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的エンドヒドロラーゼ消化
ＡＩＲ（１００ｍｇ、上記のように調製）を、５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ６．５中で２時間、５０℃において、２００ｒｐｍで振とうしてインキュベーター中で連続混合しながらインキュベートした。２時間後、懸濁液を遠心分離（３，４００×ｇ、５分）にかけ、上清（Ｓ／Ｎ）を取り除いた。別の５ｍＬの緩衝液を加え、インキュベートおよび遠心分離を繰り返した。この２次インキュベートで得たＳ／Ｎを、酵素非含有陰性対照として使用した。ペレット化したＡＩＲを、５ｍＬのＮａＰＯ４緩衝液に再懸濁し、これに、１００μｌの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ（McCleary et al., J Inst Brew 91: 285-295, 1985）を加えた。混合物を、連続混合しながら、５０℃において２時間インキュベートし、その後Ｓ／Ｎを、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖として回収した。陰性対照および（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ処理Ｓ／Ｎを、グラファイト化カーボンカートリッジ上で、Packer et al.（Glycoconj J 15: 737-747, 1998）により記載のように脱塩し、乾燥させた。
【０２２３】
ＨＰＡＥＣ分析
乾燥させた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖を、１００μＬのＭｉｌｌｉ Ｈ２Ｏに溶解し、２０μＬを、０．２Ｍ ＮａＯＨ中の５０ｍＭ ＮａＯＡｃを用いて平衡化したＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（Dionex）に、パルスアンペロメトリック検出装置（ＰＡＤ）およびオートサンプラーを搭載したＤｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣ ＩＣＳ ３００システム（Dionex）を使用して注入した。オリゴ糖を、０．２Ｍ ＮａＯＨ中５０ｍＭのＮａＯＡｃから０．２Ｍ ＮａＯＨ中３５０ｍＭまでの線形勾配で、１５分かけて、１ｍＬ／分で溶出した。ラミナリビオース（Seigaku）、マルトースおよびセロビオース（双方ともSigma）を、標準として流した。
【０２２４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
残りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖のアリコート（３０μＬ）を凍結乾燥させ、ＤＭＳＯに溶解し、ＮａＯＨ法（Ciucanu and Kerek, Carb Research 131: 209-217, 1984）を使用してメチル化した。メチル化オリゴ糖を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に分配し、ＤＣＭ相をＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。ＤＣＭ相を、Ｎ２気流下で乾燥させ、その後１０μＬの５０％アセトニトリルに再溶解した。１μＬのアリコートを、１μＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（５０％アセトニトリルに溶解して１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、１μＬの混合物を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計（Voyager DSTR, Applied Biosystems）において分析するために、ＭＡＬＤＩプレートにスポットした。
【０２２５】
ＥＳＴ分析、コンティグの組み立ておよびバイオインフォマティクス
ＢＬＡＳＴサーチツール（Altschul et al., Nucl Acids Res 25: 3389-3402, 1997）を使用して、ＣＳＬＨ ＥＳＴを、現在中止になったＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ ｗｅｂｓｉｔｅ、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、ＨａｒｖＥＳＴ（http://harvest.ucr.edu/）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml）、Ｂａｒｌｅｙ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｅｘ（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）およびＢａｒｌｅｙ Ｂａｓｅ（www. barleybase.org）を含む、公共のデータベースに照会することにより得た。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商標）３．０（GeneCodes）またはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ ９．１．０（Invitrogen）のモジュールであるＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓのいずれかを使用して、コンティグに組み立てた。ＤＮＡまたはタンパク質の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Thompson et al., Nucl Acids Res 24: 4876-4882, 1997）を使用してアライメントした。系統発生学的分析を、固有近隣結合アルゴリズムを使用して実施し、ツリーのロバスト性は、１０００回のブートストラップ反復を使用して評価した。配列類似性を、ＭａｔＧａｔ ２．０２（http://bitincka.com/ledion/matgat/）（Campanella et al., BMC Bioinformatics 4: 29, 2003）を使用して計算した。膜貫通ドメインは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de）（Schwacke et al., Plant Physiol 131: 16-26, 2003）に記載の一連のプログラムを使用して予測した。翻訳後修飾を予測するモチーフは、Ｔｏｏｌｓメニュー（http://www.expasy.org/tools/#pattern）のＥｘＰａｓｙに記載のプログラムを使用して同定した。タンパク質パラメーターは、ＥｘＰａｓｙ（http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam）のＰｒｏｔＰａｒａｍを使用して計算した。
【０２２６】
オオムギＢＡＣスクリーニング
非Ｙｄ２ 品種モレックス（Clemson University Genomics Institute, CUGI）由来のオオムギゲノムの６．５等価体を含有するＢＡＣフィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液（０．５３Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液 ｐＨ７．２、７．５％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１１μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、６５℃において６時間ブロッキングした。プライマーＨ１Ｆ１およびＨ１Ｒ１またはＨ１Ｒ５（表３）を用いて増幅した、放射性標識ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ断片を加え、６５℃において、２４時間インキュベートした。フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、室温で３回洗浄した。最終の洗浄を、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて実施した。フィルターを、Ｘ線フィルムに２ｄで撮影した。陽性ＢＡＣクローンを同定し、ＣＵＧＩウェブサイト（http://www.genome.clemson.edu）に支持されたように整理した。クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に画線し、３７℃において一晩増殖させた。各クローンのコロニーを採取し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に載せた、グリッドの付いたナイロン膜に置き、３７℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡを、膜上に固定し、０．４Ｍ ＮａＯＨに浸したろ紙上に２０分間置くことによって変性させ、次いで、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸したろ紙上に置くことによって中和した。次いで、膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄し、標準的条件（Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989）を使用してハイブリダイズを行った。
【０２２７】
ＢＡＣ ＤＮＡの単離
陽性クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス中で、３７℃において一晩培養した。細胞を、遠心分離（１２，０００×ｇ、３分）によってペレット化し、このペレットを９０μＬのＴＥＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ｗ／ｖスクロース）に再懸濁した。溶解溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）のアリコート（１８０μＬ）を加え、ゆっくりと混合し、その後１３５μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．６を加えた。染色体ＤＮＡを遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）によってペレット化した。Ｓ／Ｎを回収し、２μＬのＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃において１時間インキュベートした。Ｔｒｉｓ飽和フェノール−クロロホルム（比１：１）の４００μＬのアリコートを加え、試料を再度遠心分離にかけた（１２，０００×ｇ、５分）。Ｓ／Ｎを回収し、ＢＡＣ ＤＮＡを、２〜３倍の冷却９５％エタノールを使用して、室温で１０分かけて沈殿させた。ＢＡＣ ＤＮＡを、遠心分離（１５，０００×ｇ、１５分）によりペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、２０〜５０μＬのＴＥに再懸濁し、４℃において保存した。
【０２２８】
ゲノムウォーキング
Siebert et al.（Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995）のアダプターライゲーション法を使用して、公知のＣＳＬＨ ＥＳＴ配列の上流のゲノムＤＮＡ断片を増幅した。オオムギゲノムＤＮＡを消化するために使用した制限酵素は、ＥｃｏＲＶ、ＮｒｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩまたはＳｓｐＩであった。一次ＰＣＲ反応を、２μＬのライゲートＤＮＡ（１：１０希釈）、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、アダプタープライマーＡＰ１およびアンチセンスプライマーＨ１Ｒ７各１００ｎｇ（表３）、０．４ｍＭ ｄＮＴＰならびに１単位のＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する２５μＬ量で実施した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった：９６℃２分、次いで９４℃３０秒間、５９℃３０秒間、７２℃１分間を４０サイクル、および最終ステップ７２℃で７分間。二次ＰＣＲ反応を、１μＬの一次ＰＣＲ産物を用いて、アダプタープライマーＡＰ２およびネスティッドプライマーＨ１Ｒ６各１００ｎｇを使用して実施した。反応組成およびサイクルパラメーターは、アニーリング温度に６１℃を使用した以外は上記と同じであった。
【０２２９】
ＢＡＣの配列決定
配列決定のために、０．５から１μｇの単離ＢＡＣ ＤＮＡを、５ｐｍｏｌのプライマーおよび１×Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（ＢＤＴ）ミックス（Applied Biosystems, USA）と、最終容量２０μＬで混合した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった：９６℃１５分、次いで９６℃１０秒間、５５℃１０秒間および６０℃４分間を６５サイクル。ＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２および２．５容量の９５％エタノールを用いて氷上で１０分間沈殿させ、次いで１２，０００×ｇで３０分回転させることによってペレット化した。ペレットを７０％エタノールですすぎ、乾燥させ、配列決定のためにＡＧＲＦ（Brisbane, Australia）に送付した。
【０２３０】
ＨｖＣｓｌＨ１のマッピング
遺伝子マッピングを、６０系統のＳｌｏｏｐ×Ｈａｌｃｙｏｎの倍加半数体（ＤＨ）マッピング集団を使用して実施した（Read et al., Aust J Agric Res 54: 1145-1153, 2003）。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al.,1989、上記）の標準的方法を使用して、プライマーＨ１Ｆ１およびＨ１Ｒ５（表３）を使用してＰＣＲ増幅したＨｖＣｓｌＨ１プローブを、６種の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ）の１種を用いて消化した、親系統のゲノムＤＮＡを含有する膜とハイブリダイズさせた。次いで、二遺伝子ハイブリッド集団を、明らかな多型をもたらす酵素（ＤｒａＩ）を用いて消化した。多型をスコア化し、ＨｖＣｓｌＨ１マップの位置を、ＭａｐＭａｎａｇｅｒ ＱＴバージョン０．３０（Manly et al., Mamm genome 12: 930-932, 2001）の「find best location」機能を使用して決定した。マップの位置は、http://www.barleyworld.org/において利用可能な供給源を使用したＱＴＬデータと相関した。
【０２３１】
シロイヌナズナの成長条件
シロイヌナズナの種子を、滅菌溶液（次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素２％）、Ｔｗｅｅｎ−２０数滴）中で１５分間表面滅菌し、次いで滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で４回すすいだ。表面滅菌種子を、５０ｍＬの滅菌１×ＭＳ培地（４．３３ｇ／Ｌ ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎塩類（Phytotechnology Laboratories）、２％ｗ／ｖスクロース、１％ｗ／ｖバクトアガー）を含有する８５×２５ｍｍのペトリ皿に広げた。形質転換体の選択のために、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Sigma）を培地に加えた。プレートを、４℃の低温室に３〜５日置き、同時に発芽させた。次いで、低温湿性処理プレートを、昼と夜の温度がそれぞれ２３℃および１７℃の環境制御成長キャビネット（Thermoline L+MモデルTPG1260 TO-5x400、Smithfield、NSW、Australia）に移した。ロゼット葉における平均光強度レベルは、１６時間の明サイクルで、三足蛍光灯（Sylvania Standard F30W/133-T8 Cool White）により供給された、約７０μＥ ｍ−２Ｓ−１であった。ＭＳプレート上で３週間後、個々の苗を、水和させた直径４２ｍｍのＪｉｆｆｙペレットに移した。トレイに６つのペレットを９列並べ、３つのトレイを個々に２×３．５フィート金網台の棚に置き育てた。相対湿度を測定し、６０から７０％の間にした。植物に、地下灌漑によって２〜３日ごとに、Ｐｅｔｅｒ’ｓ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（商標）Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ植物用肥料（Scotts Australia）を補給した水道水を与えた。
【０２３２】
シロイヌナズナトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡの抽出およびＰＣＲ分析
ＤＮＡを、単一のシロイヌナズナの葉から、Edwards et al.（Nucl Acids Res 19: 1349, 1991）に記載の方法に従って抽出した。ゲノムＤＮＡの１μＬアリコートを、プライマーＨ１Ｆ２およびＨｖＣｓｌＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を使用する、下記のサイクリング計画：９４℃２分、その後９４℃２０秒、５７℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクルで、トランスジェニック植物のＰＣＲスクリーニングにおいて鋳型として使用した。
【実施例７】
【０２３３】
コメおよびオオムギ由来のＣｓｌＨ ＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメント
コメおよびオオムギ双方におけるＣｓｌＨ配列に関するＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメントを実施し、配列間の同一性および類似性のパーセントを計算し、その結果を図１０に示す。ＤＮＡおよびタンパク質配列をアライメントし、http://bitincka.com/ledion/matgat/からダウンロードしたＭａｔＧＡＴバージョン２．０２におけるデフォルトパラメーターを使用して比較した。
【０２３４】
マルチプル配列アライメントおよび系統樹作成を、Thompson et al.（Nucl Acids Res 25: 4876-4882,1997）により記載されたＣｌｕｓｔａｌＸプログラムを使用して実施した。タンパク質のアライメントおよび結果としての系統樹を、それぞれ図１１および１２に示す。
【実施例８】
【０２３５】
ＨｖＣｓｌＨ１およびＯｓＣＳＬＦ２トランスジェニックシロイヌナズナ系統の異種交配
タグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質が抗ＨＡ抗体を使用して検出された、２種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統１５−８および１５−１１を、ＯｓＣｓｌＦ２、Ｈ３７およびＨ１７−４を含む他の２種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統と、Burton et al.（Science 311: 1940-1942, 2006）により記載されたように、遺伝的に異種交配させるために選択した。ＨｖＣｓｌＨ１およびＯｓＣＳＬＦ２タンパク質を同じ細胞型の中に発現することによって、単一遺伝子（ＣＳＬＨまたはＣＳＬＦだけ）トランスジェニックシロイヌナズナ植物において観察されるレベルより高いレベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが細胞壁中に堆積される可能性があると考えられた。さらに、このことは、免疫電子顕微鏡研究および化学的細胞壁分析において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン検出の助けになるはずである。
【０２３６】
親系統の４種すべてが、それらの細胞壁に（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含有することを、免疫電子顕微鏡法により確認した（図１３）。４種の集団それぞれに由来する個体を、雌雄の親として使用した。雌親（例えば、個体Ｈ３７−５）の花はおしべの葯が裂開する前におしべを取り去り、雄親（例えば、個体１５−８−３）の裂開したおしべを使用して受粉した。個々の異種交配した花を標識し、得られた種子の鞘を脱水して回収した。
【０２３７】
個々の異種交配子孫を土に撒き、鋳型として葉のゲノムＤＮＡならびにＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマーおよび、別の反応において、ＯｓＣｓｌＦ２特異的プライマーを使用するＰＣＲによりそれらの遺伝子型を決定した。成葉を固定し、包埋し、切片にし、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンモノクローナル抗体を用いて標識した。図１４に観察されるように、多くの子孫が、親系統より非常に高いレベルの標識を有することが見出された。例えば、パネルＤに示す個体の表皮細胞中の標識は、その１５−８−３×Ｈ３７−７の親と比較して非常に多い（図１３）。同じ遺伝子型の同胞（図１４、パネルＣ）は、表皮細胞壁の標識のレベルが一貫して低いことを示した。
【実施例９】
【０２３８】
オオムギ栽培品種ヒマラヤおよびコムギ由来のＣｓｌＨ ｃＤＮＡおよびゲノム配列のクローニング
ＣｓｌＨ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を、オオムギ栽培品種ヒマラヤから、オオムギＥＳＴ配列、コメＣｓｌＨ１遺伝子配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）に基づくプライマーを使用するｃＤＮＡからのＰＣＲ、および５’ＲＡＣＥの組み合わせを使用して単離した。
【０２３９】
ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ）（配列番号６９）と称する２３３３ｂｐのコンセンサス配列を、図１６に示す。７５１アミノ酸（配列番号７０）の単一の長いオープンリーディングフレームが存在する。
【０２４０】
オリゴヌクレオチドプライマーＳＪ９１およびＳＪ８５を、コンセンサス配列の５’および３’末端から設計し、これらを使用して、図１７においてＨｖＣｓｌＨ１ｇＨｉｍ（配列番号７１）と称するゲノムＤＮＡから３２０３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【０２４１】
オオムギｃＤＮＡ配列およびゲノム配列のアライメントにより、ＣｓｌＨ遺伝子が、コンセンサスＧＴ．．ＡＧスプライスドナー／アクセプター部位に、個々に隣接する８個の小型（およそ１００ｂｐ）のイントロンを有することが示された（図１７）。
【０２４２】
ＣｓｌＨ１のコムギホモログを、ＴＩＧＲデータベースにおいてＴＣ２５５９２９と同定した。ＥＳＴのＣＪ６１４３９２、ＣＪ６０９７２９およびＣＪ７２１２０４により例示されるように、配列の３つのクラスにより、この仮想コンセンサスが構成された。ＰＣＲプライマーを、ＡＴＧ開始コドンの周囲のオオムギ配列（ＳＪ１６３）および３’末端における３種のＥＳＴ型すべてのコンセンサス配列（ＳＪ１６４）から設計し、コムギ栽培品種チャイニーズ・スプリング由来の全長ゲノム断片を増幅するために使用した。２種の配列型を同定し、ＴａＣｓｌＨ１−１（配列番号７８）およびＴａＣｓｌＨ１−２（配列番号７９）と名付けた。
【０２４３】
ＴａＣｓｌＨ１−３（配列番号８０）と称する第３のホモログを、材料および方法においてより詳細に記載した、プライマーＳＪ２０４およびＳＪ１６４を使用して単離した。
【０２４４】
オオムギ配列との比較により、イントロン−エクソン接合部が、３種の遺伝子すべてにおいて保存されていることが示された（図１７）。３種のコムギ遺伝子は、９４．８〜９６．１％同一である。
【０２４５】
３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子の推定コード領域の配列（配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４）は、それぞれ、７５２アミノ酸のポリペプチド（配列番号７５、配列番号７６および配列番号７７）をコードする。
【０２４６】
オオムギおよびコムギのＣＳＬＨ１遺伝子のＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列を、ｍｕｓｃｌｅアライメントプログラムを使用してアライメントし、同一性および類似性のパーセントを、ＰＡＭ２５０マトリックスを使用して計算した。同一性および類似性のパーセントを示す表を、図２７に示す。
【０２４７】
図２７に示すように、コムギタンパク質は、互いに約９４〜９５．０％の同一性を有し、オオムギタンパク質と約９２．６〜９３．１％の同一性を有する。
【実施例１０】
【０２４８】
オオムギおよびコムギにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発現
ＣｓｌＨ１遺伝子の発現を、半定量的（ＲＴ−ＰＣＲおよびゲル電気泳動）と定量的（リアルタイムＰＣＲ）法により調査した。
【０２４９】
βグルカンのレベルは、子葉鞘の成長に伴い増加し、その後成長の停止後に減少するので、子葉鞘は、βグルカンの生合成に関する遺伝子の発現を調べるために良好な組織である。ＣｓｌＨ１遺伝子は、成長の停止後にだけ最大の発現を示し、最も古い組織（６〜８日齢、図１９Ａ／Ｂに示すように）において高い。
【０２５０】
他の組織もまた調べた。成長中の葉において、ＣｓｌＨ１遺伝子は、葉の頂点の最も古い組織において示差的および最大発現を示す（図２０）。これらの結果から、ＣｓｌＨ１遺伝子は、分裂および伸長を停止し、したがって分化する細胞において、選択的に（しかし排他的ではない）発現すると思われる。成熟胚乳中の細胞は、成長の同様の段階にある、すなわち、細胞分裂が停止し、細胞の拡大が緩慢になり、細胞が特殊化したデンプン保存柔組織に分化する。
【０２５１】
オオムギ胚乳組織において、ＣｓｌＨ１遺伝子発現は、開花後４日ほどでピークを迎え、その後、後期の間に増加し、２８日目で最大に達する（図２１）。
【０２５２】
コムギにおいてＣｓｌＨ１遺伝子発現には大きな差があり、開花後４日目で発現はピークを迎え、その後は非常に低い。これらの結果をリアルタイムＰＣＲにより確認し、開花後２８日目において、ＣｓｌＨ遺伝子の発現が、オオムギにおいてコムギより約１０倍高いことが示された（図２２）。
【実施例１１】
【０２５３】
コムギ穀粒におけるオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現
トランスジェニックコムギ植物を、バイオリスティック形質転換により、発現が胚乳組織においてのみ起こるようにグルテニンプロモーターの制御下で全長ゲノムＨｖＣｓｌＨ１（品種ヒマラヤ）遺伝子により作出させた（図２３）。系統を、トランスジーンの有無に関して、若葉材料のＰＣＲによりスクリーニングした。１２種のＰＣＲ陽性系統および３種のＰＣＲ陰性系統（Ｈ１−２、−７および１１）を、成熟まで温室において成長させた。ＲＮＡを、開花約１５日後に成長中の穀粒から単離し、ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩを使用して調製した。その後、オオムギトランスジーンの発現を、リアルタイムＰＣＲにより分析した。使用したプライマーは、コムギおよびオオムギの遺伝子双方を増幅するので、表５は、内在性のコムギＣｓｌＨ遺伝子と比較した相対的発現レベルを示す。
【表５】
【０２５４】
大部分の系統が、対照より数百倍高いレベルでオオムギＣｓｌＨ遺伝子を発現し、９、１０、１２および１４系統は最も高い発現を示した（１０００倍を超えて高い）。
【０２５５】
成熟時に、単一穀粒のβグルカン含有量に関して分析し、結果の要約を表６に示す。
【表６】
【０２５６】
ＰＣＲ陰性系統はすべて、平均すると穀粒重量の０．６９％の、最も低いβ−グルカン含有量を有し、一方、ＰＣＲ陽性系統由来の穀粒は、０．９７％の高い平均β−グルカン含有量を有した。表６の最後の列は、所与の系統由来の任意の単一穀粒の最大β−グルカン含有量を示し、最も高いＰＣＲ陰性系統は１．０％（大部分の穀粒はこれより非常に低い）であるが、いくつかのＰＣＲ陽性系統は有意に高いβ−グルカンレベルの穀粒を有し、９系統および１０系統（最も発現が高い）は、最大１．９％のβ−グルカンを含む穀粒を有する。β−グルカンのこれらのレベルは、以前はコムギでは見られなかった。
【０２５７】
これらのＴ０植物の先端は、トランスジーンについて分離するＴ１種子を含有する。ＤＮＡを単一の遺伝子座に挿入した場合、３種のトランスジェニック対１種の野生型種子の比が観察されるはずである。図２５は、Ｈ１トランスジェニック１０系統由来の個々のＴ１種子のβ−グルカンレベルを示し、これにより、およそ３／４（４７／６１）が、ＰＣＲ陰性系統の平均（０．７％）より高いβ−グルカンレベルを有することを見出すことができる。最も高いβ−グルカンレベル（１．９％）と平均ＰＣＲ陰性レベル（０．７％）との比から、β−グルカン含有量の増加は、野生型コムギ穀粒で通常見られる量の２．７倍である。さらに重要な観察結果は、穀粒の多くの割合が、少なくとも１．４％のβグルカンを有することである。
【０２５８】
系統がホモ接合性になり、遺伝子量が増加した場合、これらの穀粒においてβ−グルカンのさらなる増加が見られることが予想される。
【実施例１２】
【０２５９】
実施例９から１１までの材料および方法
植物材料
オオムギ（Hordeum vulgare）栽培品種ヒマラヤおよびコムギ（Triticum aestivum）栽培品種チャイニーズ・スプリング、ウェストニア（Westonia）およびボブホワイト（Bob White26）を、標準的温室条件下で成長させた。
【０２６０】
プライマー配列
実施例９から１１まで、および本実施例において参照するプライマー配列を、下記の表７に示す：
【表７】
【０２６１】
ＤＮＡ、ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
植物ＤＮＡを、十分に膨張した葉の組織から、ＣＴＡＢに基づく方法（Murray and Thompson, Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325, 1980）を使用して単離した。総ＲＮＡを、葉および子葉鞘の組織から、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡｅａｓｙキットを使用して単離した。ＲＮＡを、成長中の胚乳からフェノールＳＤＳ法およびＬｉＣｌ沈殿（Clarke et al., Functional and Integrative Genomics 8, 211-221, 2007）を使用して単離した。ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅを用いて、Ambion社の「ＤＮＡフリー」キットを使用して処理し、次いでｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｌＩＩ逆転写酵素を使用して、製造業者（Clontech）の指示書に従って合成した。
【０２６２】
ＣｓｌＨ遺伝子のクローニング
ＣｓｌＨ遺伝子をクローニングする方法は、ＣｓｌＦ遺伝子のクローニングおよび特性決定において記載された方法と同様であった（Burton et al., Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）。コメセルロースシンターゼ様Ｈ１遺伝子（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）のオオムギホモログの１．８ｋｂ仮想コンセンサス配列（ＴＣ１４０３２７）を、ＴＩＧＲデータベースにおいて同定した。ＰＣＲプライマー対（ＳＪ２７−ＳＪ７３およびＳＪ７２−ＳＪ７５）を、コメＣｓｌＨ１配列に基づいて設計し、これらを用いてｃＤＮＡ由来の配列を増幅した。次いで、遺伝子の５’末端を５’ＲＡＣＥにより、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリと、ネステッドＣｓｌＨ１プライマーＳＪ２８およびＳＪ７９を使用して、製造業者（Clontech）の指示書に従って増幅した。
【０２６３】
全長ゲノムクローンを、プライマーＳＪ９１およびＳＪ８５ならびにＰｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて、製造業者の推奨するサイクリング条件（変性９８℃３０秒、その後、９８℃５秒、６３℃７秒および７２℃３分を３５サイクル）に従って増幅することによって単離し、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングした。
【０２６４】
コムギＣｓｌＨゲノムクローンを、ＰＣＲによって、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、栽培品種チャイニーズ・スプリングからプライマーＳＪ１６３およびＳＪ１６４を使用して７０℃のアニーリング温度で単離した。ゲノムウォーキングキットを、製造業者（Clontech）の指示書に従って使用し、さまざまなボブホワイト（データ非掲載）から、３種のコムギＣｓｌＨホモログすべてのコード領域の上流に伸長する配列を得た。第３のホモログに特異的なプライマー（ＳＪ２０４）を設計し、ＳＪ１６４とともに使用して第３の全長単離ゲノムクローンを単離した。予測エクソン／イントロン境界が、配列決定ｃＤＮＡ断片により正しくスプライシングされ得ることを確認した（データ非掲載）。
【０２６５】
ＲＴ−ＰＣＲによるコムギおよびオオムギ中のＣｓｌＨ遺伝子の発現分析
総ＲＮＡを、７日齢の植物の第１葉、さまざまな年齢の濃い色の成長した子葉鞘および開花後４日（ＤＰＡ）間隔をあけて回収した成長中の穀粒の切片から単離し、ＤＮＡｓｅ処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩを用いて製造業者（Invitrogen）の指示書に従って逆転写した。ＰＣＲ反応を、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Qiagen）を使用して実施した。ｃＤＮＡを希釈し、１μｌ当たり１ｎｇの元のＲＮＡと等量のレベルでＰＣＲ反応に使用した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲのためにはＣｓｌＨ１プライマーＳＪ７２およびＳＪ７４、ＣｓｌＦ遺伝子のためのプライマー対は下記のとおりであった；（ＣｓｌＦ６；ＳＪ１０７−ＳＪ８２）、（ＣｓｌＦ４；ＳＪ９４−ＳＪ９５）、（ＣｓｌＦ９；ＳＪ９７−ＳＪ９３）、（ＣｓｌＦ３；ＳＪ４４−ＳＪ３８）、（ＣｓｌＦ８；ＳＪ９６−ＳＪ３７）。アニーリング温度は５９℃を使用した。試験増幅を実施して、増幅が飽和（チューブリンの２４サイクルを除き、およそ３２〜３５サイクル）でなかったことを確実にし、産物を、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。リアルタイムＰＣＲを３連の試料について、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００装置（Corbett Life Sciences, AU）においてＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Qiagen）、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎならびにプライマーＳＪ１８３およびＳＪ１６４ならびにアニーリング温度６０℃を使用して実施した。相対的発現レベルを、コムギ０ｄｐａ試料を比較因子（１に設定）として用いて、装置のソフトウェアを使用して計算した。この試料のＣｔ値は２５．５サイクルであった。１５ｄｐａにおけるトランスジェニック穀粒の分析のために、相対的発現値を、チューブリンに対して正規化し、最も低い発現系統（Ｈ１−１３）と比較した。
【０２６６】
Ｑ−ＰＣＲによるオオムギ中のＣｓｌＨ遺伝子の発現分析
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を、発芽後０．５から７日の成長中の子葉鞘において測定した。ＨｖＣｓｌＨ１転写産物は、伸長段階の完了および葉の出現後にだけ蓄積されることが示された。発現の最も高いレベルは、子葉鞘が老化（ねじれおよび収縮）する７日後に見られた（Gibeaut et al., Planta 221:729-738, 2005）。
【０２６７】
胚乳においてオオムギＣｓｌＨ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックコムギ植物の作製
全長オオムギ品種ヒマラヤのゲノムＣｓｌＨ配列（配列番号７１）を、プライマーＳＪ９１およびＳＪ８５を使用して増幅し、高分子量グルテニンＢｘ１７プロモーターの１．９ｋｂ断片とノパリンシンターゼターミネーターの間に、ＥｃｏＲＩ断片として挿入した（図２３）。Ｂｘ１７プロモーターは、成長中の胚乳において高レベルの発現をもたらす（Reddy and Appels, Theor Appl Genet 85: 616-624, 1993）。
【０２６８】
ボブホワイト２６コムギ植物を、バイオリスティック法（Pellegrineschi et al., Genome 45: 421-430, 2002）を使用して、５０ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８を選択試薬として用い形質転換させた。ＨｖＣｓｌＨ発現ベクター（ｐＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１）とＮＰＴＩＩ選択可能なマーカー（ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏ、図２４）の発現を駆動するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを有する第２のプラスミドとを等モル量で混合し、未熟胚に同時に撃ち込んだ。
【０２６９】
トランスジェニック植物を、トランスジーンの存在に関して、若葉組織およびSigma社のＲｅｄＥｘｔｒａｃｔｎＡｍｐ（商標）キットを使用して、プライマーＳＪ２４４およびＳＪ７９を用いてスクリーニングした。
【０２７０】
開花（葯の出現および花粉の脱落）において、先端をタグ付加し、穀粒をおよそ１５ｄｐａにおいて試料採取可能にした。先端由来の３種の穀粒をプールし、ＲＮＡを抽出し、逆転写し、トランスジーンの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによりプライマーＳＪ１８３およびＳＪ８５を使用して分析した。発現レベルを、α−チューブリン（プライマーＴＵＢおよびＴＵＢ２Ｆ）に対して正規化し、最終的に最も低い発現体と比較した比で表した。
【０２７１】
成熟単一穀粒由来の粉を、β−グルカン含有量に関して、リケナーゼ酵素法（AACC Method 32-33, Megazyme assay kit, McCleary and Glennie-Holmes, J. Inst Brewing 91: 285-295, 1985）の小規模バージョンを使用して分析した。β−グルカン含有量を、粉砕全粒粉のパーセント（ｗ／ｗ）として表した。
【実施例１３】
【０２７２】
オオムギ品種ゴールデンプロミス（Golden Promise）中のオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現
オオムギＣｓｌＨ ｃＤＮＡ（配列番号１）の全長コード領域を、２種のＧａｔｅｗａｙ可能なオオムギ形質転換ベクターに移した。ベクターｐＲＢ４７４は、胚乳特異的発現を提供するオートムギグロブリンプロモーターを含有し（Vickers et al., Plant Mol Biol 62: 195-214, 2006）、ベクターｐＭＤＣ３２（Curtis and Grossniklaus, Plant Physiol. 133: 462-9, 2003）は、すべての植物組織において構成的発現を駆動する二重３５Ｓプロモーターを含有する。
【０２７３】
オオムギの形質転換
ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに移し、オオムギ栽培品種ゴールデンプロミスの未熟胚盤を、確立されたプロトコルを使用して形質転換し、トランスジェニック植物の２種の集団を作製した。トランスジーンの挿入は、サザンブロッティングにより確認した。植物２３６−１から２３６−１８は、オートムギグロブリンプロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ遺伝子を含有する。植物２３７−１および２は、３５Ｓプロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ遺伝子を含有する。植物２０８−２、−３、−５および−７は対照植物であり、オートムギグロブリンプロモーターのみを有する空ベクターｐＲＢ４７４についてトランスジェニックである。
【０２７４】
転写産物の分析
葉および受粉後７および１４日（ＤＡＰ）の成長中の穀粒の試料を、２３６種の植物から回収した。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を使用して、標準的プロトコルに従って抽出し、ｃＤＮＡを、Burton et al.（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）に従って合成した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、Burton et al.（2008、上記）に従って実施した。ＣｓｌＨ遺伝子の転写産物レベルを、トランスジェニック穀粒の胚乳において、一般的に非常に低い野生型胚乳レベルと比較した。
【０２７５】
図２６に示すように、空ベクター対照系統（２０８）は、ＣｓｌＨ転写産物の典型的な野生型のレベルを有する。トランスジェニック系統（２３６）は、７日目（７Ｄ）においてＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡレベルの有意な増加を示し、受粉後１４日目（１４Ｄ）においてさらに増加する。
【０２７６】
β−グルカンの分析
トランスジェニック植物由来のＴ１種子を回収した。個々の個体植物由来のバルクＴ１穀粒の試料を粉砕して粉にし、存在するβ−グルカンの量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ法（上記）を使用して分析した。個々の植物からのデータを、２回の再現の平均値として表し、β−グルカンの量を穀粒重量のパーセントとして、下記の表８に示す。
【表８】
【０２７７】
空ベクター対照系統（２０８）は、およそ４％の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量を有し、これは野生型ゴールデンプロミス穀粒では典型的である。Ｔ１穀粒をバルク化した（したがって、ヌル分離穀粒（null-segregant grain）を含有する）にもかかわらず、有意な数のトランスジェニック系統（網掛け部分）が対照より高い総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量を示し、最も高い値は５．９％であった。
【０２７８】
当業者であれば、本明細書に記述されている本発明が、具体的に記述されているもの以外の変形および変更を許容することを理解するであろう。本発明はそのような全ての変形および変更を含むと理解されるべきである。本発明は同様に、個別的にまたは集合的に、本明細書において述べられ、または示されているステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに該ステップまたは特徴のいずれか２つ以上の任意のおよび全ての組合せを含む。
【０２７９】
同様に、本明細書において用いられる単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上既に特段の指示がないかぎり、複数の態様を含むことに留意しなければならない。すなわち、例えば、「トランスジーン（a transgene）」への言及は、単一のトランスジーンだけでなく２以上のトランスジーンを含み、「植物細胞(a plant cell)」は単一の細胞だけでなく２以上の細胞を含むなどである。
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本発明は、オーストラリア仮特許出願2007907071の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より具体的には、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼに関する。
【背景技術】
【０００３】
穀類の各種組織は、穀粒成長中、休眠中および発芽後において、多様な機能を有する。
【０００４】
例えば、果皮膜および種皮の組織は、発育中および休眠中に種を保護することに係わる。しかし、穀粒が成熟し、穀粒のこれらの外側組織が死んだ後、組織内残留物は、ほぼ全体が細胞壁残留物から構成される。種皮とアリューロン表面との間にある核組織は、穀粒成長のために栄養素の伝達に関与するが、成熟と同時にこの組織もまた、細胞壁断片を残すのみで崩壊する。成熟した穀粒のデンプン質の胚乳の薄い有壁細胞は死ぬが、デンプンと貯蔵タンパク質が充満する。対照的に、厚い有壁かつ有核のアリューロン細胞は、穀粒の成熟時点でも生きており、タンパク体および脂肪滴が充満している。デンプン質胚乳の接触面には胚盤があり、胚乳を発育させるための栄養素を運ぶ役割をすると共に、発芽中に胚乳の貯蔵物の消化産物を成長する胚に輸送する。
【０００５】
穀粒中の各組織の異なる構造と機能は、少なくとも１つには、これらの細胞種それぞれの細胞壁組成によって決まる。
【０００６】
非セルロース多糖類は、穀類組織の細胞壁における主要な成分であり、例えば（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン、ヘテロキシラン（主にアラビノキシラン）、グルコマンナン、キシログルカン、ペクチン多糖類およびカロースなどを含む。これら非セルロース多糖類は、通常、穀粒全重量の１０％未満を構成するにすぎないが、穀粒品質の重要な決定因子である。
【０００７】
個々の非セルロース多糖類とその他の壁構成成分との正確な物理的関係は述べられてこなかったが、壁中で、セルロースの微小線維は非セルロース多糖類およびタンパク質のマトリックス相に組み込まれいる。壁の完全性は、主にマトリックス相と微小線維構成素との間の広範な非共有結合相互作用、特に水素結合によって維持される。いくつかの穀粒組織の壁中に、ヘテロキシラン、リグニンおよびタンパク質の間に共有結合が存在する。各成分間の共有結合の範囲は、壁の種類および遺伝子型によっても異なる。
【０００８】
非セルロース多糖類、特にヘテロキシランおよび（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、アリューロンおよびデンプン質胚乳の壁、また恐らくは、胚盤においても、比較的高い割合を占める。これらの組織において、セルロース含量はそれに応じて低くなる。該してセルロース含有量が低い壁は、リグニンを全く含まないという事実の他、穀粒の中央部の壁の構造的な硬さに関する限定的な要件、および穀粒の発芽後に壁成分を急速に脱重合するための要件に関係すると考えられている。
【０００９】
対照的に、果皮膜の細胞壁は、胚および胚乳のための保護膜を提供し、発芽中に動員されないものであるが、同細胞壁中のセルロースおよびリグニンの含有量は非常に高く、非セルロース多糖類の濃度は、それに応じて低い。
【００１０】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、混合結合もしくは穀類β−グルカンとも呼ばれ、非セルロース多糖類であるが、穀類および牧草が属する単子葉植物イネ科（Poaceae）の植物、および同類のイネ目（Poales）の近縁ファミリーに天然に存在する。
【００１１】
これらの非セルロース多糖類は、ほとんどの穀粒のデンプン質胚乳およびアリューロン細胞壁において重要な構成物質であり、細胞壁の最高で７０重量％から９０％重量までを占めることがよくある。
【００１２】
オオムギ、オートムギおよびライムギは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの豊富な供与源であるが、これらに比べ、コムギ、イネおよびトウモロコシは、この多糖類濃度が低い。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、穀類および牧草の栄養組織にある細胞壁の比較的微量な成分である。栄養組織において比較的微量な成分として現れるが、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、例えば、動物による栄養組織の消化率の観点から、またバイオエタノール生産用に作物残滓を使用する観点からもなお重要である。
【００１３】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、酒造および飼料製造業者を含む大規模食品加工活動において重要である。さらには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンなど、穀類の非デンプン質多糖類は、ヒトの栄養素として潜在的に有用な効果があることから、近年新たな関心を引き寄せている。
【００１４】
しかしながら、このような関心の高さにもかかわらず、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン生合成をはじめとして、穀類中の非セルロース多糖類生合成を制御する遺伝子および酵素の知識には大きな隔たりがある。
【００１５】
穀粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、遺伝子型および環境の両者により影響を受けると考えられている。例えば、穀類中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの濃度は、遺伝子型、穂の穀粒の位置、ならびに植え付け場所、成長中の気候条件および土壌窒素などの環境条件に左右される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの調節を促し、これによって穀粒または栄養組織の品質を変えられるので、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の同定は望ましいと言える。そこで、細胞内の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの調節を可能にし、それに伴う穀類または栄養組織品質の変化を可能にするため、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の特定は、是非とも必要である。
【００１７】
本明細書における従来技術の参照は、従来技術がいかなる国においても共通する一般知識の一部を形成することの同意と、またはいかなる形態の示唆と解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのファミリーをコードするヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列が提供される。本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼはＣｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされることが明らかにされた。
【００１９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列の同定の結果として、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する、ならびに／あるいは細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提供する。
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することによって調節する。従って、第２の態様において、本発明は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞においてＣｓｌＨ核酸を発現させる、過剰発現させる又は導入することにより、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増大させることを包含する。あるいは、別の実施形態において、本発明は、細胞におけるＣｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダウンにより細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をダウンレギュレートする方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、組換え発現系における（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成を促進する。例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制御下にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換え技術によって生成することもでき、続いてこの細胞はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを発現し、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを生成する。したがって、第３の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップおよびその単離されたＣｓｌＨ核酸を細胞に発現させるステップを含む方法を提供する。
【００２４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを提供する。
【００２５】
第５の態様において、本発明は、
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
を含む細胞を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。
【００２７】
さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀粒を提供する。したがって、第７の態様において、本発明は、そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸分子を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒を提供する。
【００２９】
第８の態様において、本発明は、以下：
本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
【００３０】
上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定および単離に基づく。
【００３１】
したがって、第９の態様において、本発明は、単離されたＣｓｌＨ核酸分子、又はその相補体、逆相補体若しくは断片を提供する。
【００３２】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【００３３】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様に記載の単離された核酸分子または本発明の第１０の態様に記載の遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
【００３４】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【００３５】
上記の通り、本発明は同様に、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミノ酸配列を提供する。
【００３６】
したがって、第１３の態様において、本発明は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド又はその断片を規定するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００３７】
第１４の態様において、本発明は、上記に定義の単離されたＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【００３８】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの、その変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を示唆するが、 その他任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を示唆するものではないと理解されよう。
【００３９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書において配列識別子番号（配列番号）により示される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号２）などに数値的に対応する。配列識別子の概要を表１に示す。配列のリストは、本明細書の最後に示されている。
【表１】
【００４０】
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ａ）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）における機能獲得実験に使用した、ＨｖＣｓｌＨ１：：ｐＧＢＷ１５構築体のＴ−ＤＮＡの概略を示す図である。Ｇａｔｅｗａｙクローニング後、３×ＨＡタグを、全長ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦのＮＨ２末端に結合した。（Ｂ）は、ノーザンブロット分析により決定された、成熟ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ１植物の葉における転写産物レベルの図である。上のパネル、Ｘ線フィルム撮影；下のパネル、対応する、臭化エチジウム染色したゲル。観察された２．５ｋｂの転写産物のサイズは、タグ付加ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡの予想されたサイズに一致する。（Ｃ）ウェスタンブロット分析により決定された、３週齢のプールされたＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ２系統における３×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質レベルの図である。３０マイクログラムの混合ミクロソーム膜タンパク質を各レーンに添加し、抗ＨＡ抗体でブロットをプロービングした。ＢおよびＣ；番号はトランスジェニック系統を指し、Ｃｏｌ−０は、野生型の非形質転換系統を指す。Ｃｏｌ−０、８および１４系統は同じブロット由来であり、他の系統はすべて異なるブロット由来である。
【図２】β−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた、ＨｖＣｓｌＨ１発現系の細胞壁におけるβ−グルカンの検出を示す透過型電子顕微鏡写真を示す（Meikle et al., Plant J 5:1-9, 1994）。（Ａ〜Ｃ）８、１６、１１系統；（Ｄ）野生型Ｃｏｌ−０対照；（Ｅ）６系統。ＡおよびＤは維管束の細胞；ＢおよびＣは葉肉細胞；Ｅは上皮細胞を示す。スケールバー＝０．５μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｅ）、１μｍ（Ｄ）。
【図３】１４５日齢のシロイヌナズナ系統１６−１ロゼット葉組織から調製されたアルコール不溶性画分（ＡＩＲ）の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣプロファイルを示す図である（青色線）。１６−１を予め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色線）。オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対照試料として使用した（黄緑色線）。Ｇ４Ｇ３ＧＲ（３−Ｏ−β−セロビオシルＤ−グルコース、ＤＰ３）およびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ（３−Ｏ−β−セロトリオシルＤ−グルコース、ＤＰ４）のピークを示す。
【図４】シロイヌナズナトランスジェニック系統１１の高圧凍結葉の切片における、金標識抗ＨＡ抗体による３×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質の検出を示す透過型電子顕微鏡写真を示す。（ＡおよびＢ）葉肉細胞。Ｇ、ゴルジ体、ｃｗ、細胞壁、ｖ、液胞、ｅｒ、小胞体。スケールバー＝０．５μｍ（Ａ）、０．２μｍ（Ｂ）。矢印は、ゴルジ関連小胞の標識を示す。
【図５】ＱＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ分析により決定された、オオムギにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発現を示す図である。（Ａ）さまざまなオオムギ組織中のＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベル（コピー／マイクロリットルｃＤＮＡ）の図である。正規化のための対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンおよびα−チューブリンとした。（Ｂ）受粉後０〜２４日の成長中の胚乳における、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベルの図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、α−チューブリンおよび伸長因子１ａとした。（Ｃ）１０日齢の第１葉中のＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベルの図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンおよびＨＳＰ７０とした。ＱＰＣＲプロットのエラーバーは、標準偏差を示す。（Ｄ〜Ｆ）１８Ｓ ＲＮＡ（陽性対照、Ｄ）、ＨｖＣｓｌＨ１（Ｆ）および陰性対照（Ｅ）のためのプローブを使用する、７日齢の第１葉の成熟域のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ画像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図６】ＨｖＣｓｌＨ１の構造的特徴を示す図である。（Ａ）ＨｖＣｓｌＨ１のエクソン−イントロン構造である。黒いバーがエクソンを示し、細い黒線がイントロンと５’および３’ＵＴＲを示す。四角形の上の数字はエクソンのサイズを示し、線の下の数字はイントロンのサイズを示す。イタリック体の数字は、５’および３’のＵＴＲのサイズを指し、下線のある太字は、開始コドンの上流の公知の配列の長さを指す。数字は塩基対で表されている。太い黒いバーは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/）により予測される、６つのコンセンサス膜貫通ドメインを示す。（Ｂ）ＨｖＣｓｌＨ１のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性プロット（Kyte and Doolittle, J Mol Biol 157: 105-132, 1982）の図である。＋１．６のカットオフを用いた１９個のアミノ酸ウィンドウを使用した。６つの予測膜貫通ドメインを黒いバーで示す。数字はアミノ酸を示す。（Ｃ）ＨｖＣｓｌＨ１の予測膜トポロジーの図である。ＮＨ２、アミノ末端；ＣＯＯＨ、カルボキシ末端；ｌｕｍｅｎ、ＥＲの内部、ゴルジ体または小胞体；ｃｙｔ、細胞質、ｍｅｍ、膜、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ、ＣＡＺｙ ＧＴ２ファミリーの特徴的モチーフ。ＨｖＣｓｌＨ１におけるＱＸＸＲＷモチーフの配列は、ＱＦＫＲＷである。
【図７】全長のオオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）のＣＳＬＨ配列の系統樹を示す図である。ＣＳＬＢファミリーは、ＣＳＬファミリーの中でＣＳＬＨファミリーと最も密接に関係しているので、シロイヌナズナ（A. thaliana）およびポプラ（Populus trichocarpa）のＣＳＬＢタンパク質配列もまた含まれる。アライメントはＣｌｕｓｔａｌＸを使用して作成し、近隣結合を用いる固有距離アルゴリズムを使用した。各分岐群を支持するブートストラップ反復の数（総数１，０００から）を、その分岐群の節間の下に示す。アクセッション番号は、ＨｖＣｓｌＨ１（ＦＪ４５９５８１）、ＯｓＣＳＬＨ１（Ｏｓ１０ｇ２００９０、ＡＣ１１９１４８）、ＯｓＣＳＬＨ２（Ｏｓ０４ｇ３５０２０、ＡＬ６０６６３２）、ＯｓＣＳＬＨ３（Ｏｓ０４ｇ３５０３０、ＡＬ６０６６３２）、ＰｔＣＳＬＢ１（http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html; ＩＤ ｎｏ．５７２９８２）、ＰｔＣＳＬＢ２（ＩＤ ｎｏ．６８４２１４）、ＡｔＣＳＬＢ１（Ａｔ２Ｇ３２６１０、ＮＭ＿１２８８２０）、ＡｔＣＳＬＢ２（Ａｔ２Ｇ３２６２０、ＮＭ＿１２８８２１）、ＡｔＣＳＬＢ３（Ａｔ２Ｇ３２５３０、ＮＭ＿１７９８５９）、ＡｔＣＳＬＢ４（Ａｔ２Ｇ３２５４０、ＮＭ＿１２８８１３）、ＡｔＣＳＬＢ５（Ａｔ４Ｇ１５２９０、ＮＭ＿１１７６１７、ＡｔＣＳＬＢ６（Ａｔ４Ｇ１５３２０、ＮＭ＿１１７６２０）である。
【図８】ＨｖＣｓｌＨ１が位置する、２Ｈ染色体の短腕の部分的ゲノムマップを示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１および４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子のクラスターを、セントロメア（黒丸により表示）に近接するＳｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘのビンマップ上の６９．２〜７１．５Ｍｂに相当する区間にマッピングした。ＨｖＣｓｌＨ１はビン８に配置され、ｗｇ９９６マーカーと同時分離する。Ｓｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘの参照マップにおいて、ｗｇ９９６はａｂｃ１６２と同時分離し、ａｂｃ４６８の２．３ｃＭ南であり、４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子と同時分離するマーカーである（Burton et al., Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）。鍵となるマーカーを、染色体の上部からのそれらの距離をセンチモルガン（ｃＭ）で左に示し、Ｈａｎらの麦芽β−グルカンＱＴＬ分析（Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995）におけるＬＯＤ（塩基１０に対する対数オッズ）スコアを右に示す。
【図９】（Ａ）シロイヌナズナ系統１６−２由来の１４５日齢の葉および茎を組み合わせた材料から調製されたＡＩＲの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣプロファイルを示す図である（青色線）。１６−２を予め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色線）。オオムギ成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対照試料として使用した（黄緑色線）。ラミナリビオース標準（水色線）。マルトース（Ｇα４Ｇ）およびセロビオース（Ｇβ４Ｇ）の保持時間を矢印により印を付けた。（Ｂ）Ａの試料の酵素消化ＡＩＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳクロマトグラムを表す図である。ＤＰ２（ラミナリビオース）、ＤＰ３（３−Ｏ−β−セロビオシルＤ−グルコース）およびＤＰ４（３−Ｏ−β−セロトリオシルＤ−グルコース）のピークを示す。
【図１０】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）に由来するＣｓｌＨ配列の間の、ヌクレオチド配列同一性、タンパク質配列同一性およびタンパク質配列類似性を示す図である。
【図１１−１】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（Oryza sativa）に由来するＣｓｌＨアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す図である。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】オオムギ（Hordeum vulgare）、コメ（Oryza sativa）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびポプラ（Populus trichocarpa）に由来するＣｓ１Ｂ、ＦおよびＨの全長アミノ酸配列の関係を示す系統樹である。
【図１３】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物交配の親として使用された４種のトランスジェニックシロイヌナズナ植物系統の表皮細胞壁における、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真である。ＨｖＣｓｌＨ１系統個体１５−８−３および１５−１１−７を、それぞれパネルＡおよびＢに、ＯｓＣＳＬＦ２系統個体Ｈ３７−５およびＨ１７−４−４を、それぞれパネルＣおよびＤに示す。
【図１４】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物交配から得られた子孫の細胞壁における、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノクローナル抗体を用いた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真である。１５−８−３×Ｈ３７−５の交配による個体を（Ａ）、１５−８−３×Ｈ３７−５の同胞を（Ｂ）、１５−８−３×Ｈ３７−７を（Ｃ）、１５−８−３×Ｈ３７−７の同胞を（Ｄ）、５−８−１５×Ｈ３７−１６を（ＥおよびＦ）に、１５−１１−１３×Ｈ３７−１１を（Ｇ）に、１５−１１−７×Ｈ１７−４を（Ｈ）に示す。パネルＡ〜Ｅ、Ｇ〜Ｈは、表皮細胞を示し、パネルＦは葉肉細胞を示す。
【図１５】シロイヌナズナにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発現に使用したｐＧＷＢ１５ベクターのベクターマップを示す図である。
【図１６−１】オオムギ品種ヒマラヤ（cv. Himalaya）由来のＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＤＮＡ配列は１０塩基ごとに番号を付け、単一の大文字オープンリーディングフレームの翻訳アミノ酸配列を、下に１文字で示す。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１６−３】図１６−１の続き。
【図１７−１】オオムギＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡおよびゲノム配列と、３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子ホモログ（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１−３）のゲノム配列との比較を示す図である。オオムギｃＤＮＡ（上から、品種スクーナー（cv. Schooner）由来のＨｖＣｓｌＨ１（配列番号１）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣｓｌＨ１Ｈｉｍ（配列番号６９））ならびにゲノムクローン（品種モレックス（cv.Morex）由来のＨｖＣｓｌＨ１ｇ（配列番号９）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣｓｌＨ１ｇＨｉｍ（配列番号７１））のＤＮＡ配列を、３種のコムギ配列（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１−３（それぞれ、配列番号７８、８０および８１）とともに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを使用してＢｉｏＥｄｉｔでアライメントした。アライメントの位置を配列の上に番号付けし、ダッシュはアライメントを最適化するために導入されたギャップを示す。コムギゲノム配列（ＴａＣｓｌＨ１−１）と同一のヌクレオチドは、点で表す。エクソン／イントロンの境界は、コムギゲノム配列（ＴａＣｓｌＨ１−１）において太字で示す。参照用に、ＣｓｌＨコード領域のＡＴＧ開始コドンは、アライメント位置９８において始まり、終止コドンＴＡＡは位置３３２０において始まり、双方とも下線を付けてある。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１７−３】図１７−１の続き。
【図１７−４】図１７−１の続き。
【図１７−５】図１７−１の続き。
【図１７−６】図１７−１の続き。
【図１８−１】オオムギ品種ヒマラヤと、コムギのＣｓｌＨ１タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である。オオムギ遺伝子の翻訳アミノ酸配列（最上段、ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ））を、３種のコムギ配列（ＴａＣｓｌＨ１−１ｐｒｏ、１−２ｐｒｏおよび１−３ｐｒｏとして示す）とともに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを使用してＢｉｏＥｄｉｔでアライメントした。アライメントの位置を配列の上に番号付けし、アライメントを最適化するために導入されたオオムギ配列に単一のダッシュ（ギャップを示す）が存在する。アミノ酸は、それらの一文字形式で示し、オオムギ配列（ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ））と同一のアミノ酸は点で示す。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９】子葉鞘の成長の間のオオムギ品種ヒマラヤのＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。パネルＡは、子葉鞘の成長の間ならびに若葉（Ｌ）、根（Ｒ）および中期胚乳（Ｅ）におけるオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲの図である。構成的に発現される遺伝子（α−チューブリン）を対照として示す。パネルＢは、発芽開始後のさまざまな時点（日）における、成長中の子葉鞘中のＨｖＣｓｌＨ１に関する、正規化発現レベル（Ｑ−ＰＣＲ）を示す。
【図２０】葉の成長の間のオオムギのＣｓｌＦおよびＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。オオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、他のオオムギＣｓｌＦ遺伝子と比較した。構成的に発現した遺伝子（α−チューブリン）を対照として示す。
【図２１】胚乳成長の間のオオムギ品種ヒマラヤおよびコムギＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、コムギ品種ウェストニア（下のパネル）と比較したオオムギ品種ヒマラヤ遺伝子（上のパネル）の成長中の胚乳におけるＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差を示す。ＤＰＡ＝開花後の日数である。
【図２２】胚乳成長期のオオムギ品種ヒマラヤおよびコムギＣｓｌＨ１遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果を示す図である。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、成長中の胚乳における、コムギＣｓｌＨ１遺伝子と比較したオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差を示す。Ｔａ０ ｄｐａ試料を１に設定し、他の発現レベルはこれに対して相対的レベルである。
【図２３】Ｂｘ１７プロモーターの制御下におけるオオムギ品種ヒマラヤのＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現に使用した、植物形質転換ベクターのプラスミドマップを示す図である。ｐＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１と称する植物形質転換ベクターの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、さまざまな遺伝エレメントを表す：Ｂｘｌ７ｐｒｏｍ＝オオムギＨｖＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現を駆動するＢｘ１７プロモーター；Ｈｖｇ９１８５＿１＝プライマー対ＳＪ９１およびＳＪ８５を用いて単離されたＨｖＣｓｌＨ１ゲノムクローン１番；Ｎｏｓ３’＝ノパリンシンターゼポリアデニル化配列；ＮＰＴＩＩ＝細菌カナマイシン耐性遺伝子。選択された制限部位の位置は、プラスミドマップの外側に示す。
【図２４】カナマイシン耐性を付与する、植物の選択可能なマーカープラスミドのプラスミドマップを示す図である。ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏと称する植物形質転換ベクターの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、さまざまな遺伝要素を表す：３５Ｓｐｒｏｍ＝植物の選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；ＮＰＴＩＩ＝植物カナマイシン耐性遺伝子；ＳＴＬＳイントロン＝ジャガイモ（Solanum tuberosum）大型サブユニットイントロン；３５Ｓ ｐｏｌｙＡ＝ＣａＭＶ ３５Ｓポリアデニル化配列；Ａｍｐ ｒｅｓ＝細菌アンピシリン耐性遺伝子。選択された制限部位の位置は、プラスミドマップの外側に示す。
【図２５】オオムギ品種ヒマラヤＣｓｌＨ１遺伝子を発現するＴ０植物系統１０由来の単一コムギ穀粒のβグルカン含有量を示す図である。グラフは、Ｔ０系統１０番由来の個体コムギ穀粒のβグルカン含有量を示す。βグルカンは、粉末重量のパーセントとして示す。
【図２６】空ベクター対照（２０８）およびトランスジェニック（２３６）オオムギ中のＣｓｌＨ１遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す図である。発現は、受粉７日後（７Ｄ）および受粉１４日後（１４Ｄ）における葉および成長中の穀粒において示す。
【図２７】オオムギおよびコムギのＣｓｌＨ配列に関する、ＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列の同一性／類似性の比較を示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１＝オオムギ品種スクーナー由来のＤＮＡコード配列（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）；ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ）オオムギ品種ヒマラヤ由来のＤＮＡコード配列（配列番号６９）および対応するアミノ酸配列（配列番号７０）；ＴａＣｓｌＨ１−１＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング（Chinese Spring）由来のＤＮＡコード配列（配列番号７２）および対応するアミノ酸配列（配列番号７５）；ＴａＣｓｌＨ１−２＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（配列番号７３）および対応するアミノ酸配列（配列番号７６）；ＴａＣｓｌＨ１−３＝コムギ品種チャイニーズ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（配列番号７４）および対応するアミノ酸配列（配列番号７７）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下の説明は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするが、上記の説明に関する限定であることを意図しないと理解されるべきである。
【００４３】
本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生合成酵素をコードする遺伝子の同定に基づく。
【００４４】
「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン」は、β−Ｄ−グルコピラノシル単量体が（１→４）結合および（１→３）結合の両者によって重合された直鎖の非分枝状多糖類を含むと理解されるべきである。
【００４５】
天然の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンにおける（１→４）結合と（１→３）結合の比率は、一般に２．２〜２．６：１の範囲である。ただし、比率はこの範囲以外のこともある。たとえば、ソルガム胚乳の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、同比率は、１．１５：１である。２種類の結合は、規則的な繰り返し配列にはならない。（１→３）結合単位は、２以上の（１→４）結合により分離される。２ないし３つの隣り合う（１→４）結合の領域が優勢であるが、これら単位の配置には規則性がない。結合配列は、２つのグルコース単位より、さらに前記結合への依存がなく、二次マルコフ連鎖分布に従っている。さらに、１０％以下の連鎖は、５から２０の隣り合う（１→４）結合の長いストレッチからなる場合がある。したがって、穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、セロトリオシル（cellotriosyl）（Ｇ４Ｇ４ＧRed）、セロテトラオシル（cellotetraosyl）（Ｇ４Ｇ４Ｇ４ＧRed）単位、およびより長い（１→４）−β−Ｄ−オリゴグルコシル単位の（１→３）−β−結合した共重合体とみなすことができる。
【００４６】
内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、三糖単位と四糖単位の比率は、穀物種によって異なる。例えば、コムギではその比率は３．０〜４．５：１であるが、オオムギでは２．９〜３．４：１、ライムギでは２．７：１およびオートムギでは１．８〜２．３：１である。さらに、実際の比率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出の温度および条件によっても異なる可能性がある。
【００４７】
穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンについて報告されている平均分子量は、穀物種、細胞壁の種類、抽出手順および分子量判定に用いた手順によるが、４８，０００（ＤＰ約３００）から３，０００，０００（ＤＰ〜１８５０）に及ぶ。これらは、分子量に関して常に多分散であって、これはオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンに関し、数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ）１．１８に対する加重平均により説明される。ある種のオオムギ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはまた、少量のタンパク質と共有結合しており、推定分子量最大４０，０００，０００を有している。
【００４８】
穀粒壁からの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽出率は、自己会合、ならびに他の細胞壁多糖類およびタンパク質との会合の関数である。特に抽出率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン連鎖における分子量および結合分布に依存する。他のポリマーとの過剰な結合および高分子量が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを穀粒から抽出することをさらに困難にしている。
【００４９】
例えば、オオムギ、オートムギおよびライムギ粉の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの一部は、ｐＨ７．０、４０℃の水で抽出することができる。さらなる画分は、より高温で溶解度を高めることができる。４０℃において水溶性の総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合は、植物種内でも、また植物種によっても異なる。例えば、ロウ質の多い（アミロース分が高い）オオムギは、通常のオオムギよりも水溶性の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの割合がより高い。４０℃でオオムギから抽出された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、６５℃で抽出されたもの（２．０：１）より、三糖：四糖の比率がわずかに低い（１．７：１）。穀粒からの穀物（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを完全に抽出するためには、還元末端によるアルカリ性誘導の分解を防ぐために、ＮａＢＨ４を含む４Ｍ ＮａＯＨまたはＢａ（ＯＨ）２水溶液などのアルカリ性抽出剤を使用する必要がある。アルカリで抽出されたオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン画分は、分子量が高く、（１→４）:（１→３）結合の比率が高く、より多くの、連続的に結合した（１→４）結合のセグメントを有し、水による抽出物よりも三糖：四糖の比率が高い。ジメチルスルホキシド、高温の過塩素酸、トリクロロ酢酸、Ｎ−メチルモルホリノ−Ｎ−オキシドおよびジメチルアセトアミド−ＬｉＣｌなどの他の抽出剤も、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの溶解度を高めるために使用してもよい。しかしこれら抽出剤は、脱重合、またはポリマーの分解を生じる可能性がある。温水またはアルカリで抽出後、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、中性ｐＨおよび室温でよく溶解するようになる。しかし、冷却時に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは会合し、沈着する可能性がある。
【００５０】
上記の通り、本発明は、１つには（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒する生合成酵素の同定およびそれをコードする遺伝子に基づく。かかる酵素を本明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」と称する。
【００５１】
本発明は、ＥＳＴ（expressed sequence tag）ライブラリーおよびセルロースシンターゼ（ＣｅｓＡ）遺伝子を含む他の配列データベースの分析に、一部起因する。さらに具体的には、ＣｅｓＡ遺伝子は、事実上、非常に大きな遺伝子スーパーファミリー（ＣｅｓＡ遺伝子およびセルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子ファミリーの両者を含む）のメンバーであることが、これら研究において確認された。
【００５２】
しかし、ほとんどの線維束植物のＣｓｌ遺伝子ファミリーは非常に大きく、ＣｓｌＡからＣｓｌＨと称するいくつかのグループに分類されている。シロイヌナズナでは、２９のＣｓｌ遺伝子が知られており、イネにおいては３７の同遺伝子が知られている。シロイヌナズナのゲノムは、細胞壁代謝に関与する７００超の遺伝子を含むと概ね考えられている。しかし、基本的に、これら遺伝子の具体的な機能はあまり明らかにされていない。
【００５３】
さらに、ＣｅｓＡ遺伝子とは対照的に、Ｃｓｌ遺伝子の機能を特定することは困難であることが分かっている。事実、高等植物の複数のＣｓｌ遺伝子のうち、ＣｓｌＡ及びＣｓｌＦグループのみに、一定の機能が割り当てられている。
【００５４】
本発明によって、ＣｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバーが（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードすることが明らかにされた。
【００５５】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする、ＣｓｌＨヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の同定の結果、本発明はとりわけ、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節し、ならびに／あるいは細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提供する。
【００５６】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法を提供する。
【００５７】
「細胞」は、任意の適当な真核細胞または原核細胞とすることができる。したがって、本明細書において言及される「細胞」とは、酵母細胞もしくは菌糸真菌細胞などの真菌細胞；哺乳動物細胞などの動物細胞もしくは昆虫細胞；または植物細胞をはじめとする真核細胞とすることができる。あるいは、細胞は、大腸菌（E. coli）細胞を含む細菌細胞または古細菌細胞などの原核細胞とすることもできる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞、線維束植物細胞、例えば単子葉被子植物細胞もしくは双子葉被子植物細胞、または裸子植物細胞などである。いくつかの実施形態において、植物は単子葉植物細胞である。いくつかの実施形態において、植物は、イネ目のメンバーである。いくつかの実施形態において、単子葉植物細胞は、穀類植物細胞である。
【００５９】
本明細書において用いられる「穀類植物」という用語は、ヒトまたは動物の食料用の食用穀類を作出するイネ目（イネ科植物属）のメンバーを含む。イネ目穀類植物の例としては、決して本発明を限定するものではないが、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ソルガム、ライムギ、トリチカレ、オートムギ、オオムギ、テフ、野生米、スペルトコムギなどが挙げられる。しかしながら、穀類植物という用語は同様に、アマランス、ソバ、キノアなどの、食用穀類を作出しかつ偽穀類（pseudocereal）としても知られる非イネ目種のいくつかの植物を含むと理解されるべきである。
【００６０】
他の実施形態において、本発明は、他の単子葉植物、例えばロリウム種(Lolium spp)などの牧草を含むイネ目の他の非穀類植物などの使用を包含する。
【００６１】
上記の通り、本発明は、１つには、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することに基づく。
【００６２】
「ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの合成を触媒し、任意により、グルコピラノシル単量体の重合を触媒することができる、ＣｓｌＨによりコードされる任意のタンパク質とみなされるべきである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対し少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％のアミノ酸配列同一性を含む。
【００６５】
アミノ酸配列を比較する場合に、比較される配列は、配列番号２の少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも４００個のアミノ酸残基、少なくとも８００個のアミノ酸残基、又は全長にわたる比較ウィンドウと比較しうる。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施することができる。配列分析の詳細な検討は、Ausubel et al.のUnit 19.3に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００６６】
本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの例としては、配列番号２のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのオーソログが含まれる。
【００６７】
例えば、配列番号２のオオムギ（Hordeum vulgare）オーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。配列番号２のイネ（Oryza sativa）オーソログには、例えば、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。配列番号２のコムギ（Triticum aestivum）オーソログには、例えば、配列番号７５、配列番号７６および配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。
【００６８】
本明細書に記載の通り、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「レベル」の調節は、細胞中のＣｓｌＨ転写産物および／またはＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドのレベルの調節を含むと理解されるべきである。ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「活性」の調節は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの総活性、比活性、半減期および／または安定性の調節を含むと理解されるべきである。
【００６９】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性に関する「調節」によって、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少または増加させることを意図する。「減少させる」とは、例えば、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を意図する。「増加させる」とは、例えば、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍の増加を意図する。「調節」とは同様に、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを、この導入される酵素を通常は発現していない細胞に導入すること、またはそのような活性を通常有する細胞におけるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの実質的に完全な阻害を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルは、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を増加させることにより増加される。別の実施形態において、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルは、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減少させることにより減少される。
【００７１】
本発明の方法は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することができる、当技術分野において公知の任意の手段を包含する。これには、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼアゴニストもしくはアンタゴニストの適用のような、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの活性を調節する薬剤の適用、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性を模擬する薬剤の適用、細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ核酸の発現の調節、または比活性、半減期および／もしくは安定性の増加したもしくは減少した（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼが細胞によって発現されるような、細胞中での改変型もしくは変異型ＣｓｌＨ核酸の発現の達成などが含まれる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することにより調節する。
【００７３】
したがって、第２の態様において、本発明は、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法を提供する。
【００７４】
本明細書において用いられる「ＣｓｌＨ核酸」という用語は、以下：
（ｉ）本明細書において定義されるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする核酸分子；および／または
（ｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；および／または
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１以上を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
を含むと理解されるべきである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％の配列同一性を含む。
【００７６】
同一性の％を計算するために、核酸配列を配列番号１と比較する際に、比較されるヌクレオチド配列は、配列番号１の少なくとも３００個のヌクレオチド残基、少なくとも６００個のヌクレオチド残基、少なくとも１２００個のヌクレオチド残基、少なくとも２４００個のヌクレオチド残基、又は全長にわたる比較ウィンドウに対して比較されるべきである。比較ウィンドウは、２個の配列の最適アライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）に対して比較したときに、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラムのＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータに実装して実施することができる。配列分析の詳細な検討は、Ausubel et al.のユニット１９．３に記載されている（"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。
【００７７】
上述したように、ＣｓｌＨ核酸は、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に対してハイブリダイズする核酸を含みうる。本明細書において用いられる「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、通常は約０．０１から１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であって、温度は少なくとも３０℃を条件とする。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、または高ストリンジェンシー条件であってもよい。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃で３０％〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を使用するハイブリダイゼーションと、５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ中での洗浄（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃で４０％〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハイブリダイゼーションと、５５℃〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハイブリダイゼーションと、６０℃〜６５℃での０．１×ＳＳＣの洗浄を含む。任意により、洗浄緩衝溶液は、約０．１％から約１％のＳＤＳを含む場合もある。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約２４時間未満であり、通常は約４時間〜約１２時間である。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数でもあり、最終洗浄液のイオン強度および温度により影響を受ける。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはMeinkothおよびWahlの式（Anal. Biochem. 138: 267-284, 1984）から概算される。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌである。ここでＭは、一価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合、％ホルムアミドは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッド長さである。Ｔｍは、相補的なターゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨに基づく）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃下がる。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、異なる度合いの相補性を有する配列に対してハイブリダイズするために調整することができる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列は、Ｔｍを約１０℃下げることによりハイブリダイズできる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列およびその相補体の熱融解点（Ｔｍ）よりも低くなるよう選択される。例えば、高ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１、２、３、４または５℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。中程度のストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。低ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも、例えば１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。上記式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成と望ましいＴｍを使用することにより、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本来的に記載されていることを理解するだろう。望ましい程度のミスマッチは、４５℃未満（水溶性溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍの結果になるとすれば、より高温を利用できるようにＳＳＣ濃度を高めることができる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Pt I, Chapter 2, Elsevier, New York, 1993）、Ausubel et al.編（Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995）およびSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989）に述べられている。
【００７９】
本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨ核酸の例としては、配列番号１のオーソログであるコード領域を有する核酸が含まれる。
【００８０】
例えば、配列番号１のオオムギ（Hordeum vulgare）コード領域オーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。配列番号１のイネ（Oryza sativa）コード領域オーソログには、例えば、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。配列番号１のコムギ（Triticum aestivum）コード領域オーソログには、例えば、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。
【００８１】
本発明により想定されるＣｓｌＨ核酸はまた、１以上の非翻訳領域、例えば３’および５’非翻訳領域、および／またはイントロンを含んでもよい。例えば、本発明により想定されるＣｓｌＨ核酸は、例えば、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはゲノムヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
いくつかの特定の実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、１以上の非タンパク質コード領域および／または１以上のイントロンを含んでもよい、生物由来のゲノムヌクレオチド配列を含む。ＣｓｌＨ核酸を含むゲノムヌクレオチド配列としては、例えば以下が挙げられる：
オオムギ（Hordeum vulgare）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号９および／または配列番号７１に示される配列；
イネ（Oryza sativ）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２のいずれか１以上に示される配列；ならびに／あるいは
コムギ（Triticum aestivum）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号７８、配列番号７９および／または配列番号８０のいずれか１以上に示される配列。
【００８３】
上記の通り、本発明は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節する方法を提供する。本発明は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することができる任意の方法を包含する。
【００８４】
ＣｓｌＨ核酸の発現に関して「調節する」という用語は、一般的に、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳を増加または減少させることを指す。「減少させる」とは、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、 ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の低下を包含している。「増加させる」とは、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加を包含している。調節することはまた、通常特定の細胞中では見いだされないＣｓｌＨ核酸の発現を導入すること、または通常当該活性を有する細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現の実質的に完全な阻害（例、ノックアウト）を含む。
【００８５】
細胞中の特定の核酸分子の発現を調節する方法は、当技術分野において公知であり、本発明ではそのような任意の方法を包含する。ＣｓｌＨ核酸の発現を調節する典型的な方法は、内在性ＣｓｌＨ核酸の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションさせるような細胞の遺伝的改変、ＣｓｌＨ核酸での形質転換による遺伝的改変、細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発現を調節する核酸分子の細胞への投与などを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸の発現を、細胞の遺伝子的改変により調節する。本明細書において用いられる「遺伝的に改変された」という用語は、細胞の遺伝的に改変されていない形態に比べて、遺伝的に改変された細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現の改変に影響を及ぼす任意の遺伝的改変を含むと理解されるべきである。本明細書において包含される遺伝的改変の典型的なタイプとしては、トランスポゾン、化学物質、紫外線またはファージ突然変異誘発などのランダム突然変異誘発と、内在性ＣｓｌＨ核酸を過剰発現または過小発現する変異体の選別；細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現および／または過剰発現を指令する１以上の核酸分子の、細胞への一過的または安定的導入；内在性ＣｓｌＨ核酸の部位特異的突然変異誘発；細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発現を阻害する１以上の核酸分子、例えば、コサプレッション構築物またはＲＮＡｉ構築物の導入などが挙げられる。
【００８７】
1つの特定の実施形態において、遺伝的改変は対象となる細胞への核酸の導入を含む。
【００８８】
核酸は、例えば、SambrookおよびRussell（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）に述べられたものなど、使用される細胞種に適した、当技術分野において公知の任意の方法を用いて導入することができる。
【００８９】
細胞が植物細胞である本発明のいくつかの実施形態において、核酸分子の導入のための適切な方法には、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバードメントに基づく形質転換方法および直接的ＤＮＡ取り込みに基づく方法が挙げられる。Roa-Rodriguez et al.（Agrobacterium-mediated transformation of plants, 3rd Ed. CAMBIA Intellectual Property Resource, Canberra, Australia, 2003）は、広範な植物種について、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の植物形質転換方法を総説している。マイクロプロジェクタイルボンバードメントは、植物組織を形質転換したり、植物、特に穀類植物の形質転換方法に使用されている。また、当該方法は、Casas et al.（Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 1995）により総説されている。プロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの直接的なＤＮＡ取り込みによる形質転換プロトコルは、Galbraith et al.（編）（Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Press, San Diego, 1995）に詳しく述べられている。上記方法に加えて、さまざまな他の形質転換プロトコルを用いてもよい。例えば、浸潤、細胞および組織のエレクトロポレーション、胚のエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、花粉管経路、炭化ケイ素およびリポソーム媒介による形質転換が挙げられる。これらのような方法は、Rakoczy-Trojanowska（Cell. Mol. Biol. Lett. 7: 849-858, 2002）により総説されている。他のさまざまな植物形質転換方法もまた、当業者にとって明らかなものである。
【００９０】
導入される核酸は、一本鎖であってもまたは二本鎖でもよい。核酸は、ｍＲＮＡに転写され、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたは別のタンパク質に翻訳される。また核酸は、ＲＮＡｉ構築物、コサプレッション構築物、アンチセンスＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｎｔＲＮＡなどのような非翻訳ＲＮＡをコードしてもよく、あるいは、直接細胞中で作用してもよい。導入された核酸は、未修飾のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはヌクレオチド塩基、糖もしくはリン酸骨格に対する修飾を含むが、核酸に対する機能的等価性を保持する修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡの場合がある。導入された核酸は、細胞中で任意により複製されてもよいし、細胞の染色体または染色体外エレメントに組み込まれてもよいし、ならびに／あるいは、細胞により転写されてもよい。導入された核酸はまた、宿主細胞に関して同種または異種のいずれかでよい。すなわち、導入された核酸は、遺伝的に改変された細胞と同じ生物種の細胞から得られるか（すなわち同種）、または導入された核酸は、異なる生物種から得られる（すなわち異種）。トランスジーンは、合成トランスジーンでもよい。
【００９１】
１つの特定の実施形態において、本発明は、ＣｓｌＨ核酸を細胞において発現、過剰発現または細胞に導入することにより、細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増加させることを包含する。
【００９２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列を同定することにより、さらなる実施形態において、本発明は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をダウンレギュレーションする方法も提供する。
【００９３】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ遺伝子の同定は、以下などの方法による細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのノックアウトまたはノックダウンなどの方法を容易にする：
ノックアウト構築物との相同組換えによる、細胞中のＣｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、細胞中のＣｓｌＨ核酸の挿入突然変異（植物での標的化遺伝子破壊の例としては、Terada et al., Nat. Biotechnol. 20: 1030-1034, 2002を参照）；
細胞中のＣｓｌＨ核酸の転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡｉ（ＰＴＳＧおよびＲＮＡｉの総説については、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およびHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするアンチセンス構築物での細胞の形質転換（植物のアンチセンス抑制の例については、van der Krol et al.、Nature 333: 866-869、van der Krol et al.、BioTechniques 6: 958-967、およびvan der Krol et al.、Gen. Genet. 220: 204-212を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするコサプレッション構築物での細胞の形質転換（植物のコサプレッションの例については、van der Krol et al.、Plant Cell 2(4): 291-299を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とする二本鎖ＲＮＡをコードする構築物での細胞の形質転換（ｄｓＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については、Waterhouse et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照）；
ＣｓｌＨ核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをコードする構築物での細胞の形質転換（ｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については、Lu et al.、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10.1093/nar/gnh170, 2004を参照）；ならびに／あるいは
ＣｓｌＨ核酸と機能的に連結されるようなｍｉＮＲＡ標的配列の挿入（例えば、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子抑制の例については、Brown et al., Blood 110(13): 4144-4152, 2007参照）。
【００９４】
本発明は、細胞に投与されるＣｓｌＨ核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどの合成オリゴヌクレオチドの利用によって、細胞中のＣｓｌＨ核酸のダウンレギュレーションも促進するものである（合成ｓｉＲＮＡ介在抑制の例については、Caplen et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001、Elbashir et al.、Genes Dev. 15: 188-200, 2001、Elbashir et al.、Nature 411: 494-498, 2001、Elbashir et al.、EMBO J. 20: 6877-6888, 2001、およびElbashir et al.、Methods 26: 199-213, 2002を参照）。
【００９５】
上記例の他に、導入された核酸は、ＣｓｌＨ核酸に直接関係しないヌクレオチド配列を含むこともあるが、それでも、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を直接的または間接的に調節することがある。例としては、細胞中の内在性ＣｓｌＨ核酸分子の発現を促進するまたは抑制する転写因子または他のタンパク質をコードする核酸分子、直接的または間接的に内在性のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現を促進または抑制する他の非翻訳ＲＮＡなどがある。
【００９６】
遺伝的に改変された細胞中での導入核酸の発現を達成するため、必要に応じ、導入核酸は１以上の制御配列に機能的に連結されてもよい。「制御配列」という用語は、機能的に連結された核酸またはそれによりコードされる転写産物もしくはタンパク質の転写、翻訳およびまたは翻訳後修飾に必要なまたは有利な任意のヌクレオチド配列を含むと理解されるべきである。各制御配列は、機能的に連結された核酸に対し生来的でもまたは外来性でもよい。制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチドをコードする配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流の活性化配列、シグナルペプチドをコードする配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、制御配列はプロモーターを少なくとも含む。
【００９７】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、細胞中の核酸分子の発現を実現する、活性化する、または増強する任意の核酸をいう。プロモーターは、一般的に、プロモーターが制御する遺伝子の５'（上流）に位置させる。異種プロモーター／遺伝子の組み合わせである構築物において、プロモーターと遺伝子（該プロモーターが自然環境において制御する遺伝子、すなわち該プロモーターが由来する遺伝子）との間の距離にほぼ等しい遺伝子転写開始部位からの距離に、プロモーターを配置することが望ましい。当技術分野において周知の通り、この距離の変更は、プロモーター機能を失うことなく収めることができる。
【００９８】
プロモーターは、物理応力、病原体または特に金属イオンなどの外部刺激に反応して、あるいは１以上の転写活性化因子に反応して発現が生じる細胞、組織、器官または発生段階に関し、構成的に、または特異的に、機能的に連結したヌクレオチドの発現を制御してもよい。つまり、本発明の方法に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的のプロモーターまたは活性化プロモーターを含んでもよい。
【００９９】
本発明は、対象となる細胞で活性を有する任意のプロモーターを使用することを包含している。つまり、細菌、真菌、動物細胞または植物細胞のいずれかで活性を有する多様なプロモーターは、当業者であれば容易に理解するだろう。しかし、いくつかの実施形態においては、植物細胞を使用する。これらの実施形態では、植物で活性な構成的、誘導性、組織特異的または活性可能なプロモーターが典型的に使用される。
【０１００】
植物の構成的プロモーターは、通常植物のほぼ全ての組織での発現を指令し、環境および発生的要因からは、概ね独立している。本発明に従い使用することができる構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ（ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓ）プロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）から得られるノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーターなど、アグロバクテリウム種（Agrobacterium spp.）より得られるオパインプロモーターなどの細菌性植物病原体由来のプロモーター、およびルビスコ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ）プロモーター、植物ユビキチンプロモーター（Ｐｕｂｉ）、イネアクチンプロモーター（Ｐａｃｔ）およびオートムギグロブリンプロモーターなどの植物由来のプロモーターが含まれる。
【０１０１】
「誘導性」プロモーターには、化学的に誘導可能なプロモーターおよび物理的に誘導可能なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。化学的に誘導可能なプロモーターは、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化学化合物により制御される活性を有するプロモーターを含む。化学的に誘導可能なプロモーターの例には、アルコール制御プロモーター（例、欧州特許第６３７３３９号参照）、テトラサイクリン制御プロモーター（例、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号参照）、グルココルチコイド受容体プロモーター（例、米国特許第５，５１２，４８３号参照）、エストロゲン受容体プロモーター（例、欧州特許出願第１ ２３２ ２７３号参照）、エクジソン受容体プロモーター（例、米国特許第６，３７９，９４５号参照）などのステロイド反応プロモーター、メタロチオネインプロモーター（例、米国特許４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号参照）などの金属応答プロモーター、ならびにキチナーゼプロモーターまたはリゾチームプロモーター（例、米国特許第５，６５４，４１４号参照）またはＰＲタンパク質プロモーター（例、米国特許第５，６８９，０４４号、米国特許第５，７８９，２１４号、豪州特許第７０８８５０号、米国特許第６，４２９，３６２号参照）などの病因関連プロモーターを含む。
【０１０２】
誘導性プロモーターは、温度（高温、低温とも）、光などの非化学的環境要因により制御される物理的に制御されるプロモーターである場合もある。物理的に制御されるプロモーターの例には、ヒートショックプロモーター（例、米国特許第５,４４７８５８号、豪州特許第７３２８７２号、カナダ国特許出願第１３２４０９７号参照）、低温誘導性プロモーター（例、米国特許第６，４７９，２６０号、米国特許第６，０８４、０８号、米国特許第６，１８４，４４３号および米国特許第５，８４７，１０２号）、光誘導性プロモーター（例、米国特許第５，７５０，３８５号およびカナダ国特許第１３２１５６３号参照）、光抑制性プロモーター（例、ニュージーランド特許第５０８１０３３号および米国特許第５，６３９，９５２号）を含む。
【０１０３】
「組織特異的プロモーター」には、選択的にまたは特異的に、生物中の１以上の特定の細胞、組織もしくは器官、および／または生物の１以上の発生段階で発現するプロモーターが含まれる。組織特異的プロモーターは、場合によっては誘導性であってもよい。
【０１０４】
植物の組織特異的プロモーターの例には、米国特許出願第２００１０４７５２５号に記載された通りの根特異的プロモーター、欧州特許第３１６４４１号、米国特許第５，７５３，４７５号および欧州特許出願第９７３９２２号に記載の通りの子房特異的および花托組織特異的プロモーターをはじめとする果実特異的プロモーター、ならびに豪州特許第６１２３２６号および欧州特許出願第０７８１８４９号および豪州特許第７４６０３２号に記載の通りの種子特異的プロモーターが含まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、種子および／または穀粒特異的プロモーターである。種子または穀粒特異的プロモーターの例には、ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ−ｂ遺伝子プロモーター（例えば、Digeon et al.、Plant Mol. Biol. 39: 1101-1112, 1999を参照）、Ｐｂｆ遺伝子プロモーター（例えば、Mena et al.、Plant J. 16:53-62, 1998）、ＧＳ１−２ 遺伝子プロモーター（例えば、Muhitch et al.、Plant Sci. 163:865-872, 2002）、グルテリンもしくはＧｔ１遺伝子プロモーター（例えば、Okita et al., J. Biol. Chem. 264: 12573-12581, 1989、Zheng et al.、Plant J. 4: 357-366, 1993、Sindhu et al.、Plant Sci. 130: 189-196, 1997、 Nandi et al.、Plant Sci. 163: 713-722, 2002を参照）、Ｈｏｒ２−４遺伝子プロモーター（例えば、KnudsenおよびMuller, Planta 195: 330-336, 1991、Patel et al.、Mol. Breeding 6: 113-123, 2000、Wong et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16325-16330, 2002を参照）、リポキシゲナーゼ１遺伝子プロモーター（例えば、Rouster et al.、Plant J. 15: 435-440, 1998を参照）、Ｃｈｉ２６遺伝子プロモーター（例えば、Leah et al.、Plant J. 6: 579-589, 1994を参照）、Ｇｌｕ−Ｄ１−１遺伝子プロモーター （例えば、Lamacchia et al.、J. Exp. Bot. 52: 243-250, 2001、Zhang et al.、Theor. Appl. Genet. 106: 1139-1146, 2003を参照）、Ｈｏｒ３−１遺伝子プロモーター（例えば、Sorensen et al.、Mol. Gen. Genet. 250: 750-760, 1996、Horvath et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1914-1919, 2000を参照）およびＷａｘｙ（Ｗｘ）遺伝子プロモーター（例えば、Yao et al.、Acta Phytophysiol. Sin. 22: 431-436, 1996、Terada et al.、Plant Cell Physiol. 41: 881-888, 2000、Liu et al.、Transgenic Res. 12: 71-82, 2003を参照）がある。１つの特定の実施形態において、種子特異的プロモーターは胚乳特異的プロモーターである。
【０１０６】
プロモーターは、本明細書において「活性化可能プロモーター」と呼ばれる、１以上の所定の転写活性化因子により活性化可能であるプロモーターでもよい。例えば、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に機能的に連結された最小プロモーターを含む場合がある。これはとりわけ、１以上の転写活性化因子のＤＮＡ結合部位を含む。
【０１０７】
本明細書に記載の通り、「最小プロモーター」という用語は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ結合部位、好ましくはＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位および／または１以上のＣＡＡＴボックスを組み入れた任意のプロモーターを含むと理解されるべきである。細胞が植物細胞である場合、最小プロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）プロモーターに由来することができる。ＣａＭＶ ３５Ｓ由来の最小プロモーターは、例えばＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの（転写開始部位の）−９０位から＋１位（−９０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−６０位から＋１位（−６０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）またはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−４５位から＋１位（−４５ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）に相当する配列を含むことができる。
【０１０８】
上述した通り、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）に融合された最小プロモーターを含むことがある。ＵＡＳは、最小プロモーターを活性化するために転写活性因子を結合することが可能な任意の配列でありうる。転写活性因子の例として、例えば、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｇｃｎ４およびＡｃｅ１などの酵母由来の転写活性因子、ＶＰ１６、Ｈａｐ１（Hach et al.、J Biol Chem 278: 248-254, 2000）、Ｇａｆ１（Hoe et al.、Gene 215(2): 319-328, 1998）、Ｅ２Ｆ（Albani et al.、J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000）、ＨＡＮＤ２（Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277: 12604-12612, 2002）、ＮＲＦ−１およびＥＷＧ（Herzig et al.、J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000）、Ｐ／ＣＡＦ（Itoh et al.、Nucl Acids Res 28: 4291 - 4298, 2000）、ＭａｆＡ（Kataoka et al.、J Biol Chem 277: 49903-49910, 2002）、ヒト活性転写因子４（LiangおよびHai、J Biol Chem 272: 24088 - 24095, 1997）、Ｂｃｌ１０（Liu et al.、Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1-6, 2004）、ＣＲＥＢ−Ｈ（Omori et al.、Nucl Acids Res 29: 2154 - 2162, 2001）、ＡＲＲ１およびＡＲＲ２（Sakai et al.、Plant J 24(6): 703-711, 2000）、Ｆｏｓ（Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5351-5356, 2000）、ＨＳＦ４（Tanabe et al.、J Biol Chem 274: 27845 - 27856, 1999）、ＭＡＭＬ１（Wu et al.、Nat Genet 26: 484-489, 2000）などのウイルス由来の転写活性因子が挙げられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＵＡＳは、少なくともＧＡＬ４転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと結合可能なヌクレオチド配列を含む。ＵＡＳ配列は、少なくともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含む転写活性因子と結合する配列であり、本明細書において、ＵＡＳＧと呼ぶ。特定の実施形態において、ＵＡＳＧは、配列5’-CGGAGTACTGTCCTCCGAG-3’またはその機能的ホモログを含む。
【０１１０】
本明細書に記載の通り、ＵＡＳＧ配列の「機能的ホモログ」は、少なくともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと結合でき、ＵＡＳＧヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも８０％の同一性または少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む任意のヌクレオチド配列をいうと理解されるべきである。
【０１１１】
活性化可能プロモーター中のＵＡＳ配列は、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の多数のタンデムリピートを含んでもよい。例えば、ＵＡＳＧはその天然の状態においては、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の４つのタンデムリピートを含む。したがって、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列のタンデムリピートの数に関して本明細書において用いられる「多数」という用語は、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのタンデムリピートを含むと理解されるべきである。
【０１１２】
上記の通り、制御配列は、ターミネーターも含むことがある。「ターミネーター」という用語は、転写終了のシグナルを示す転写ユニットの終端にあるＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であって、一次転写産物の３’末端に対してポリアデニル化配列の付加を促進する。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、使用しようとする細胞、組織または器官で機能的な任意のターミネーター配列であってもよい。植物細胞中で有用でありうる適切なターミネーター配列の例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）ターミネーター、ｐｉｎＩＩおよびｐｉｎＩＩＩターミネーターなどのジャガイモのプロテイナーゼ阻害遺伝子（ｐｉｎ）ターミネーターが含まれる。
【０１１３】
細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節することにより、細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを調節することは、いくつかの産業上の用途がある。
【０１１４】
例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、粘性溶液を形成することで知られている。水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの粘性を生じる物性は穀類加工の多くの局面において重要な決定因子である。例えば、オオムギ麦芽および穀類添加物由来の不完全に分解された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、麦汁およびビールの粘性に寄与できるが、麦汁分離およびビールのろ過における問題を伴う（例、Bamforth、Brew. Dig. 69 (5): 12-16, 1994を参照）。したがって、例えばいくつかの実施形態において、本発明は、ビール製造への適性を高めるため、オオムギ粒の１以上の細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を減じることにより、オオムギ粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを減じるために適用することもできる。
【０１１５】
水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ブタや家禽などの単胃動物に対して反栄養的な効果（antinutritive effect）をもたらすとも考えられている。「反栄養的」な効果は、胃内容物の粘度を高め、消化酵素の放散および酵素作用の分解産物の吸収を遅らせることである。言い換えれば、これは成長率を遅らせることにつながる。さらに、家禽の飼料配合において、高い（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、「粘性の」糞に関係しており、これは（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの消化性が低いことを示し、かつ生産者にとって主要な取扱いおよび衛生上の問題になりうる。したがって、別の実施形態において、本発明は、動物飼料としての植物の適合性を改善するため、動物飼料に使用される植物の１以上の細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを低下させるのに適用することができる。
【０１１６】
しかしながら、穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、ヒトおよび動物の食事における食物繊維の重要な構成要素である。本明細書において用いられる「食物繊維」という用語は、大腸における完全なもしくは部分的な発酵とともにヒト小腸での消化および吸収に抵抗性を示す植物の可食部または類似の炭水化物を含むと理解されるべきである。「食物繊維」は、多糖類（特に（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む）、オリゴ糖、リグニンおよび関連する植物物質を含む。少なくともヒトの食事において、食物繊維は、全般的な腸の調子、便通、血中コレステロールの低減、および／または血中グルコールの低減を含めた有益な生理的効果を促進する。
【０１１７】
ヒトおよび単胃動物は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを分解する酵素を作らないが、いくぶんかの脱重合が胃および小腸で発生していることが示されている。これは、片利共生微生物の活性によるものと推測される。水溶性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンと他の非デンプン質の多糖類を比較すると、腸内細菌により容易に発酵し、可消化エネルギーにわずかながら寄与する。単胃動物における反栄養的効果とは対照的に、ヒトにおける高濃度のオートムギおよびオオムギ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に食事後の血糖値およびインスリン反応を抑えることにより、非インスリン依存の糖尿病にとって有益な効果をもたらす。食物中高濃度の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン（例えば２０％ｗ／ｖ）は、食物から食物コレステロールまたは胆汁酸の吸収を抑えることにより、血清コレステロール濃度を下げることにも関連付けられている。
【０１１８】
したがって、別の実施形態において、本発明は、植物またはその部分中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンレベルを高めることにより、食用植物または食用植物部分の食物繊維含有量を増加させることに適用することもできる。いくつかの実施形態において、食用植物または植物の可食部分は、穀類植物またはその一部である。
【０１１９】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に（１→３）−β−Ｄ−グルカンにおいて、他のいくつかの多糖類と同じく、細網内系統の細胞の受容体との結合により媒介されるプロセスにより、ヒトの免疫反応を変化させるとも考えられている。さらに、血中の抗体が産生される前に、最初の防衛線として発動するシステムである、ヒトの補体経路のタンパク質を活性化する能力を有することがある。
【０１２０】
本発明は、組換え発現系における（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成も促進する。例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制御下にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換え技術によって生成することもでき、続いて細胞はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを発現し、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを生成する。
【０１２１】
ＣｓｌＨ核酸を発現させるために使用することができる多様な組換え発現系は当技術分野において周知である。組換え発現系の例は、大腸菌発現系などの細菌発現系（Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 411-421, 1999 おいて総説されている。例：Gene expression in recombinant microorganisms, Smith (編), Marcel Dekker, Inc. New York, 1994、およびProtein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, Baneyx (編), Chapters 2 and 3, Horizon Bioscience, Norwich, UK, 2004も参照）、バシラスｓｐｐ．発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 4を参照）、およびストレプトミセスｓｐｐ．発現系（例：Practical Streptomyces Genetics, Kieser et al.(編), Chapter 17, John Innes Foundation, Norwich, UK, 2000を参照）、サッカロミセスｓｐｐ．、シゾサッカロミセス・ポンベ、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）およびピチアｓｐｐ．の発現系、ならびに糸状菌発現系などの酵母発現系を含む真菌発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapters 5, 6および7、Buckholz and Gleeson, Bio/Technology 9(11): 1067-1072, 1991、Cregg et al.Mol. Biotechnol. 16(1): 23-52, 2000、CereghinoおよびCregg, FEMS Microbiology Reviews 24: 45-66, 2000、Cregg et al.、Bio/Technology 11: 905 - 910, 1993を参照）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づく発現系（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 9を参照）、バキュロウイルス発現系を含む昆虫細胞培養（例：Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, 前記, chapter 8、KostおよびCondreay, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 428-433, 1999、Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual WH Freeman & Co., New York, 1992、およびThe Baculovirus Expression System: A Laboratory Manual, Chapman & Hall, London, 1992を参照）、タバコ、ダイズ、イネおよびトマト細胞発現系などの植物細胞発現系（例：Hellwig et al.、Nat Biotechnol 22: 1415-1422, 2004の概説を参照）などを含む。
【０１２２】
したがって、第３の態様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップおよびその単離されたＣｓｌＨ核酸を細胞に発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、細胞は、先に定義された通りの組換え発現系から得られる細胞である。
【０１２４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンも提供する。
【０１２５】
第５の態様において、本発明は、
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
を含む細胞を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本発明の第５の態様の細胞は、本明細書に記載された本発明の第１または第２の態様の方法で作製される。別の実施形態において、細胞は植物細胞、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞および／または穀類植物細胞である。
【０１２８】
さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する。
【０１２９】
本明細書では、「多細胞構造物」は、１以上の細胞の任意の凝集物を含む。したがって、「多細胞構造物」という用語は特に組織、器官、生物全体およびその一部を包含する。さらに、多細胞構造物は同様に、コロニー、植物カルス(plant calli)、懸濁培養物などの培養細胞の多細胞凝集物を包含すると理解されるべきである。
【０１３０】
上記の通り、本発明のいくつかの実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第６の態様に係る１以上の植物細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料または培養植物組織を含む。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀類植物を提供する。
【０１３２】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞を含む穀粒を提供する。
【０１３３】
したがって、第７の態様において、本発明は、そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸分子を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒を提供する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、穀粒は、同種と野生型穀粒を比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが高くてもよい。別の実施形態において、穀粒は、同種由来の野生型穀粒と比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが低くてもよい。
【０１３５】
穀粒がコムギ粒であるいくつかの実施形態において、コムギ粒は、風乾全粒の生体重基準で少なくとも１％、少なくとも１．１％、少なくとも１．２％、少なくとも１．３％、少なくとも１．４％、少なくとも１．５％、少なくとも１．６％、少なくとも１．７％、少なくとも１．８％または１．９％の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを含む。
【０１３６】
第８の態様において、本発明は、以下：
本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
【０１３７】
したがって、本発明の第７の態様である穀粒を製粉して生産される穀粉は、例えば、本発明の第９の態様の穀粉の約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％または１００重量％から構成されてもよい。
【０１３８】
本明細書に述べるように、「製粉」は、Brennan et al.（Manual of Flour and Husk Milling, Brennan et al.（編）、 AgriMedia, ISBN: 3-86037-277-7）に述べられた製粉などの、穀粒を製粉する当技術分野において周知の任意の方法を包含する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、穀粉に使用される本発明の第７の態様である穀粒を製粉して製造される穀粉は、野生型粉と比較した場合により高いレベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む。
【０１４０】
「１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉」は、先に定義された任意の穀類植物から得られる穀粒を製粉して製造される穀粉である。本発明の第８の態様である穀粉の成分は、例えば０重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％または９０重量％を構成してもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉は、小麦粉である。また、これにより本発明の第８の態様の穀粉は、パン、ケーキ、ビスケットなどを調理するのに特に適している。
【０１４２】
上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定および単離に基づく。
【０１４３】
したがって、第９の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した単離されたＣｓｌＨ核酸分子、又はその相補体、逆相補体若しくは断片を提供する。
【０１４４】
本発明において、「単離された」とは、元の環境（例えば、それが天然に存在するならば天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、「人の手によって」その天然の状態から改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部とすることができ、又は細胞内に含まれてもよく、そのベクター、組成物、または特定の細胞は該ポリヌクレオチドの元の環境ではないので、依然として単離されている。「単離された」核酸分子は同様に、当技術分野において公知の方法を用いた化学合成によりまたはインビトロでの増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応など）により作製されるものを含めて、合成核酸分子を含むと理解されるべきである。
【０１４５】
本発明の単離された核酸分子は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。これは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。例えば、本発明の単離された核酸分子は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合でよいＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を含んでもよい。さらに、単離された核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領域から構成されてもよい。単離された核酸分子は、安定性または他の理由により修飾された１以上の塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでよい。「修飾」塩基は、例えば、イノシンなどのトリチル塩基および通常のものでない塩基を含む。さまざまな修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して実施することができることから、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を含む。
【０１４６】
上記の通り、本発明は、ヌクレオチド配列の断片を提供する。ヌクレオチド配列の「断片」とは、少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０または６００ヌクレオチド（ｎｔ）長とすべきである。これらの断片には、以下に限定されないが、診断用プローブおよびプライマーを含む多数の用途がある。もちろん、６０１〜３０００ｎｔ長のものなどのより大きな断片も、全てではないが、ＣｓｌＨ核酸の大部分に対応する断片と同様、本発明において有用である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、断片は、ＣｓｌＨ核酸の機能的断片を含みうる。すなわち、本発明のポリヌクレオチド断片は、本明細書に定義される通りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を有するポリペプチドをコードしうる。
【０１４８】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクターを提供する。
【０１４９】
ベクターまたは構築物は、さらに１以上の宿主の複製起点、１以上の宿主中で活性である選択可能なマーカー遺伝子、または細胞中で単離された核酸分子の転写を可能にする１以上の制御配列のうちの１以上を含んでもよい。
【０１５０】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、細胞により発現される場合に、これら形質転換された細胞の同定および／または選択を促進する表現型を細胞に与える任意のヌクレオチド配列を含む。適切な選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の範囲は、当技術分野において周知である。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の例は、抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、抗生物質オーレオバシジンＡに対する耐性を与えるＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｎｐｔＩおよびｎｐｔＩＩ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例：ｈｐｔ）など、除草剤耐性遺伝子、例えばグルホシネート（glufosinate）、ホスフィノトリシンまたはビアラホス耐性遺伝子、例えばホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子（例：ｂａｒ）、３−エノイルピルビルシキミ酸（shikimate）５−リン酸塩シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするグリホサート耐性遺伝子（例：ａｒｏＡ）、ブロミキシニル（bromyxnil）ニトリラーゼをコードする遺伝子をはじめとするブロミキシニル（bromyxnil）耐性遺伝子、ジヒドロプテレート（dihydropterate）シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホンアミド（salfonamide）耐性遺伝子（例：ｓｕｌ）およびアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホニル尿素耐性遺伝子、ＧＵＳおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子などの酵素コードレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子、ならびに、とりわけルシフェラーゼ遺伝子などの発光に基づくレポーター遺伝子を含む。
【０１５１】
さらに、選択可能なマーカー遺伝子は、構築物中の個々のオープンリーディングフレームであるか、あるいはＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドとの融合タンパク質として発現する場合もあることに注目すべきである。
【０１５２】
本発明の第１０の態様は、本明細書に記載の通り、原核生物または真核生物中の遺伝子構築物の維持および／または複製、ならびに／あるいは遺伝子構築物またはその一部を原核生物または真核生物細胞のゲノムに組み込ませることを意図した、ヌクレオチド配列をさらに含む、本質的に全ての遺伝子構築物に及ぶ。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により植物細胞に少なくとも一部移入されるようにつくられる。したがって、ベクターまたは構築物は、左および／または右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。
【０１５４】
適切なＴ−ＤＮＡ境界配列は、当業者によって容易に確認されよう。しかしながら、「Ｔ−ＤＮＡ境界配列」という用語は、アグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp）の細胞からアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を受けやすい植物細胞に移入される核酸分子の範囲を定める、実質的に相同のおよび実質的に直接反復性のヌクレオチド配列を含む。例えば、PeraltaおよびReamによる論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(15): 5112-5116, 1985）およびGelvinの概説（Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1): 16-37, 2003）を参照されたい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介して植物に移入するためにつくられているが、本発明は、例えばBroothaerts et al.（Nature 433: 629-633, 2005）に記載されているようなアグロバクテリウム属の種（Agrobacterium sp.）以外の細菌を介して、細菌媒介による植物細胞への導入を促進する遺伝子構築物に対する任意の適切な改変も包含している。
【０１５６】
当業者は、所望であれば、本明細書に記載された構築物をどのように作製するか、また、所望の条件下で特定の細胞または細胞種でその発現を得るための必要条件を知るであろう。特に、本発明を実施するために必要な遺伝子操作は、大腸菌細胞などの原核細胞または植物細胞もしくは動物細胞での、本明細書に記載の遺伝子構築物またはその誘導体の増殖を必要とすることが、当業者に公知であろう。核酸分子をクローニングするための方法例は、Sambrook et al.（2000, 前記）に述べられている。
【０１５７】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様の単離された核酸分子または本発明の第１０の態様の遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
【０１５８】
本発明の第１０もしくは第１１の態様の単離された核酸分子、または本発明の第１２の態様の遺伝子構築物は、当技術分野において周知の任意の手段を介して細胞中に導入することができる。
【０１５９】
上記に言及される単離された核酸分子または構築物は、エピソーム（例：プラスミド、コスミド、人工染色体または同様のもの）の一部分として、ＤＮＡ分子として細胞中に維持されてもよいし、あるいは細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。
【０１６０】
本明細書において用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用語は、その最も広義な背景において、細胞の遺伝子相補体を構成するあらゆるＤＮＡを含むと理解されるべきである。したがって、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ 、葉緑体ＤＮＡ、内在性プラスミドＤＮＡなどを含むと理解されるべきである。したがって、「ゲノムに組み込まれた」という用語は、染色体への組み込み、ミトコンドリアＤＮＡへの組み込み、色素体ＤＮＡへの組み込み、葉緑体ＤＮＡへの組み込み、内在性プラスミドへの組み込みなどを包含する。
【０１６１】
単離された核酸分子は、とりわけ、細胞が単離された核酸分子を発現するように、制御配列および／またはプロモーターに機能的に連結することができる。
【０１６２】
細胞は、原核細胞または真核細胞でありうる。したがって、細胞は大腸菌細胞もしくはアグロバクテリウム属の種（Agrobacterium spp.）の細胞を含む細菌細胞、または古細菌細胞などの原核細胞とすることができる。細胞は、酵母細胞または菌糸真菌細胞などの真菌細胞、哺乳類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、または植物細胞を含む真核細胞であってもよい。特定の実施形態において、細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態において、植物細胞は、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞または穀物植物細胞である。
【０１６３】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む、本明細書において上で定義した多細胞構造物を提供する。
【０１６４】
上記の通り、いくつかの実施形態において、細胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料または培養植物組織を特に含むと理解されるべきである。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む、単子葉植物、イネ目植物もしくは穀類植物またはその部分を提供する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の第１１の態様の１以上の細胞を含む穀粒を提供する。
【０１６７】
上記の通り、本発明は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミノ酸配列も提供する。したがって、第１３の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、またはその断片を提供する。
【０１６８】
単離されたポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドイソスター（isostere）によって互いに連結されたアミノ酸を含み、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。本発明の単離されたポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当技術分野において周知である化学的修飾技術により修飾されてもよい。
【０１６９】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および／または末端を含めて、単離されたポリペプチドのどこで行われてもよい。同じ種類の修飾は、所定の単離されたポリペプチドの複数部位で同程度または種々の程度で存在してもよいことが理解されるだろう。また、本発明の単離されたポリペプチドは、多数の種類の修飾を含んでもよい。
【０１７０】
ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐しても、および／または、分岐の有無にかかわらず環状でもよい。環状の、分岐した、および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後自然プロセスの結果であっても、あるいは合成方法により作製されてもよい。
【０１７１】
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル反応、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキンチン化などのトランスファーＲＮＡ媒介によるタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる（例としては、Proteins--Structure And Molecular Properties 2nd Ed., Creighton (編), W. H. Freeman and Company, New York, 1993、Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, Johnson (編), Academic Press, New York, 1983、Seifter et al., Meth Enzymol 182: 626-646, 1990、Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663: 48-62,1992を参照）。
【０１７２】
上記の通り、本発明は、単離されたポリペプチドの断片も提供する。ポリペプチド断片は、該断片が「自立」するかまたは一部もしくは領域を形成する大きなポリペプチド内に含まれてもよい。
【０１７３】
ポリペプチド断片は、少なくとも３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸長でありうる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、断片は、機能的断片であり、従って、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を含む。しかしながら、該断片は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの１以上の生物学的機能を保有しないにもかかわらず、他の機能的活性は依然として保有されてもよい。例えば、該断片はＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を欠くが、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体に対して導入および／または結合する能力を保有する。ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそれに結合する能力を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質断片は、本明細書において「ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープ」と呼ぶ。
【０１７５】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープは、３〜４個の少ないアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、例えば少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも２００個のアミノ酸残基を含んでもよい。ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの特定のエピトープが当該免疫学的活性を保有しているかどうかは、当技術分野で周知の方法により容易に判定することができる。したがって、１つのＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド断片は、１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドである。
【０１７６】
１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドは、当技術分野で周知の合成および組換え方法を含むポリペプチドを生成する慣用的な手段により作製することができる。いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを持つポリペプチドは、化学合成の周知の方法を用いて合成されてもよい。例えば、Houghtenは、多数のペプチドを合成する単純な方法を述べている（Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135, 1985）。
【０１７７】
ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド、およびＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを有するポリペプチドは、例えば、本発明のＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドと結合する抗体の生成において有用である。
【０１７８】
当該抗体は、とりわけ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの検出および局在決定において、また、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドのアフィニティ精製において有用である。抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、多様な定性的または定量的イムノアッセイにおいて、慣用的に使用することができる。例えば、Harlow et al.、Antibodies:A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press 2nd Ed., 1988）を参照されたい。
【０１７９】
したがって、第１４の態様において、本発明は、上記に定義の、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそのエピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。
【０１８０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントおよび上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１８１】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に対して免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスでありうる。
【０１８２】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよいし、あるいは異種ポリペプチドまたは固相担体材料などの異種エピトープと本発明のポリペプチドとの両者に対して特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号、ＷＯ９２／０８８０２号、ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／０５７９３号、Tutt et al.、J. Immunol. 147: 60-69, 1991、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、およびKostelny et al.、J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992を参照されたい。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用してもよい。別の実施形態において、本発明の抗体は、例えばインビトロおよびインビボ診断および治療方法の両者をはじめとする本発明のポリペプチドの精製、検出および標的化のために使用してもよい。例えば、抗体は、生体サンプル中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを定性的にかつ定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて使用しうる。例として、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）を参照されたい。
【０１８４】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、例えば、共有結合によって抗体がＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼまたはそのエピトープと結合するのを妨げないような任意のタイプの分子の抗体への共有結合により、修飾されている誘導体を包含すると理解されるべきである。例えば、抗体の誘導体は、例えばグルコシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより修飾されている抗体を含む。さらに、多くの化学的修飾のいずれを公知の技術によって行ってもよい。これらは特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１８５】
抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。
【０１８６】
例えば、インビボ免疫法を使用する場合、動物を遊離ペプチドで免疫してもよいが、抗ペプチド抗体力価は、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドなどの、高分子キャリアにペプチドを結合することにより、増強させることができる。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）法などのリンカーを用いてキャリアに結合させてもよく、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いてキャリアに結合させてもよい。
【０１８７】
ウサギ、ラット、マウスなどの動物は、例えば遊離ペプチドまたはキャリアを結合したペプチドを用いて、約１００マイクログラムのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内および／または皮内注射することにより、免疫することができる。例えば固体表面に吸着する遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、約２週間隔で、検出可能な抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、何回かの追加免疫注射が必要となることもある。免疫された動物の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選別により、例えば、当技術分野で周知の方法により固相支持体上へのペプチドの吸着と、選択された抗体の溶出により、高めてもよい。
【０１８８】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたは１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手法により作製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に対し特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘発するため、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等の様々な宿主動物に投与することができる。例えばフロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなど潜在的に有用なヒトのアジュバントなど、様々なアジュバントを、宿主動物種に応じて免疫反応を高めるために使用してもよい。当該アジュバントもまた、当技術分野において周知である。
【０１８９】
別の例として、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、遺伝子組換えおよびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの利用をはじめとする当技術分野で周知の多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であって、例えば、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988）およびHammerling et al.、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas （Elsecier, NY, 1981）などに教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物およびファージクローンを含む任意の単一クローンから誘導され、また抗体が生成される方法以外に由来する抗体をいう。
【０１９０】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、スクリーニングする方法は、慣用的に行われ、当技術分野で周知である。例えば、マウスは、本発明のポリペプチドまたは当該ペプチドを発現する細胞により免疫することができる。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中で検出された後、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。脾細胞は、周知の技術により、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞などの適切な骨髄腫細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドと結合することのできる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で周知の方法によりアッセイする。一般に高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを有するマウスを免疫することにより生成することができる。
【０１９１】
１以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するため）パパインなどの酵素、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため）を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断により生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９２】
本発明の抗体は、当技術分野において周知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示（ディスプレイ）される。特定の実施形態において、当該ファージはレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例：ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用することができる。対象とする抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識化された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原などを使用し、選択または同定することができる。これら方法に使用されるファージは、典型的には、該ファージにより発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え技術によって融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインと共に含む、線状ファージである。
【０１９３】
ファージディスプレイ法の例としては、Brinkman et al.（J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995）、Ames et al.（J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995）、Kettleborough et al.（Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994）、Persic et al.（Gene 187: 9-18, 1997）、Burton et al.（Advances in Immunology 57: 191-280, 1994）、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号により開示された方法が挙げられる。
【０１９４】
ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、全抗体または任意の望ましい他の抗原結合性フラグメントを生成するために使用することができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌および細菌を含む、任意の望ましい宿主で発現させることができる。例えば、組換え技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを生産するための技術はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４、Mullinax et al.（BioTechniques 12(6): 864-869, 1992）およびSawai et al.（AJRI 34:26-34, 1995）およびBetter et al.（Science 240: 1041-1043, 1988）に開示された方法など当技術分野で周知の方法を用いて、使用することも可能である。
【０１９５】
一本鎖Ｆｖおよび抗体を生産するために使用可能な技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号、Huston et al.（Methods in Enzymology 203: 46-88, 1991）、Shu et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999, 1993）およびSkerra et al.（Science 240: 1038-1040, 1988）に記載されている。
【０１９６】
本発明をさらに、以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例１】
【０１９７】
オオムギはＣＳＬＨ遺伝子を１種だけ有する
オオムギ中の候補ＣＳＬＨ遺伝子を、コメＣＳＬＨ配列とともに、中止になったStanford cell wall website、NCBI、HarvEST、GrainGenes、Barley Gene IndexおよびBarley BaseなどのオンラインＥＳＴデータベースに照会することによりまず同定する。オオムギ由来の全ＣＳＬＨ関連ＥＳＴは、全長３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびタンパク質のＣＯＯＨ末端の４８８個の（予測では約７５０の）アミノ酸残基をコードする領域に含まれる約１，５００ｂｐの単一の連続配列にアライメントできた（表２）。この遺伝子をＨｖＣｓｌＨ１と名付けた。ＨｖＣｓｌＨ１由来プローブを用いたオオムギＢＡＣライブラリのスクリーニングにより、すべてがＨｖＣｓｌＨ１を含むいくつかのゲノムクローンが同定され、これにより、欠落した５’末端が得られた（データ非掲載）。単一の２，２５６ｂｐＯＲＦを含み、推定分子量８２．６ｋＤａおよびｐＩ７．０であるタンパク質をコードする、２，４３０ｂｐのＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した（図６Ａ）。ＡＲＡＭＥＭＮＯＮを用いたこの配列の概念上の翻訳の分析により、５つから９つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）が見出され、さまざまなプログラムの間のコンセンサスは、２つのＮＨ２末端および４つのＣＯＯＨ末端のＴＭＤ（図６Ｂ）であり、成熟タンパク質の両末端は、細胞質性であることが予測される。このトポロジーもまた、細胞質内にＤ，Ｄ，Ｄ，ＱＦＫＲＷモチーフを含む大型の中心ドメインを配置している（図６Ｃ）。ヌクレオチドレベルでは、ＨｖＣｓｌＨ１は、３種のコメＣＳＬＨ遺伝子と、６８〜７４％の同一性（６２〜６９％のアミノ酸同一性）を有している（実施例６を参照されたい）（Hazen et al., Plant Physiol 128: 336-340, 2002）。系統発生学的再構成は、ＨｖＣｓｌＨ１が、おそらくＯｓＣＳＬＨ１のオオムギオーソログであることを示している（図７）。Ｓｌｏｏｐ×Ｈａｌｃｙｏｎの倍加半数体集団を使用するＨｖＣｓｌＨ１の遺伝子マッピング（Read et al., Aust J Agr Res 54: 1145-1153, 2003）は、ＨｖＣｓｌＨ１は染色体２Ｈの短腕上にあり、Ｂｕｒｔｏｎらにより報告された（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）４種のＨｖＣＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、８、１０）のクラスターからおよそ１．５ｃＭであり、非発芽オオムギ穀粒中のβ−グルカン含有量を調節する主要ＱＴＬ内にあった（Han et al., Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995；図８）ことを示している。
【０１９８】
支援情報
ＢＡＣライブラリのスクリーニングを用い、全長ＨｖＣｓｌＨファミリーメンバーの完全なセットを得た。オオムギゲノム（品種モレックス）の６．５等価体を含むＢＡＣフィルターをスクリーニングし、３種の明らかに陽性のクローンを同定した（データ非掲載）。ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したこれらのクローン由来のＢＡＣ ＤＮＡのブロットを検出した場合、同じ３種のクローンである３−５−１０、３−７−３および３−７−８が陽性であると検証された。ＢＡＣ ３−５−１０および３−７−８の消化パターンは同一であると思われ、多くのバンドはＢＡＣ ３−７−３と共通であり、このことは、３種のＢＡＣはすべて、オオムギゲノムの同一の領域または非常に類似した領域を含むことを示している。ゲノムＤＮＡのブロットを同じプローブとハイブリダイズさせた場合、単一のバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶを用いて消化したレーンに観察され、ＢＡＣ消化の結果を裏付けた。すべてのＨｖＣｓｌＨ ＥＳＴもまた単一の遺伝子に由来するので（表２）、これらのデータは、オオムギゲノム中にはＣＳＬＨ遺伝子が１種だけ存在することを強く示唆している。
【０１９９】
アダプタープライマーＰＣＲ法（Siebert et al., Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995）を使用して、ＨｖＣｓｌＨ１の５’末端を同定した。ＤＮＡを、ＢＡＣ３−５−１０および３−７−３から単離し、アダプターが連結された平滑末端ＤＮＡ断片を作製するさまざまな制限酵素を用いて消化した。次いで、遺伝子の５’末端を含有する断片を増幅するために、アダプター特異的プライマーおよびＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマー（表３）を用いて、ネステッドＰＣＲを実施した。プライマーＡＰ２およびＨ１Ｒ６を使用する、ＮｒｕＩにより消化されたＢＡＣ ３−７−３ ＤＮＡの増幅により、Ｎ末端配列の約２０個のアミノ酸以外をすべて含む１．３ｋｂｐの断片を増幅することに成功した。Ｈ１Ｒ１０プライマー、すなわち１．３ｋｂ断片の５’末端近くにアニーリングするために設計されたアンチセンスプライマーを用いたＢＡＣ ３−７−３ＤＮＡの直接配列決定は、オープンリーディングフレームの残り＋配列の上流の７４８ｂｐの同定を可能にした。先に得られた結果から予測されたように、ＢＡＣ ３−５−１０から得られた配列はＢＡＣ ３−７−３と同一であり、オオムギゲノム内にＣＳＬＨ遺伝子が１種だけ存在することが確認された。
【表２】
【０２００】
【表３】
【０２０１】
【実施例２】
【０２０２】
シロイヌナズナにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発現は、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの堆積をもたらす
シロイヌナズナにおける異種発現のために、ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦを、Ｇａｔｅｗａｙを可能にするバイナリーベクターのｐＧＷＢ１５にクローニングし（Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007；図１５）、ＨｖＣｓｌＨ１をＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下に置き、３×ＨＡエピトープタグをコードされるタンパク質のＮＨ２末端に付加した（図１Ａ）。形質転換シロイヌナズナ種子の初期選択により、ＰＣＲでＨｖＣｓｌＨ１の含有が確認されたいくつかの推定トランスジェニック実生を同定した。これらのＴ１植物のＲＮＡブロット分析により、ロゼット葉中におよそ９０％のＨｖＣｓｌＨ１転写産物が蓄積したことが示された（図１Ｂ）。抗ＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用して、これらの系統におけるＨｖＣｓｌＨ１タンパク質を検出した（図１Ｃ）。混合したミクロソーム膜の分画（５０，０００〜１００，０００×ｇのペレット）を、プールされた３週齢のカナマイシン耐性Ｔ２実生から調製した。抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングは、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を含有する２８の系統のうちわずか４系統だけが予想サイズ（約９０ｋＤａ）のポリペプチドを蓄積したことを示した（図１Ｃ）。分子量がより大きいタンパク質およびより小さいタンパク質が検出されることもあった（例えば、レーン１１）。９０ｋＤａのタンパク質は、総タンパク質抽出物（データ非掲載）または非形質転換シロイヌナズナ植物から調製された混合膜分画（図１Ｃ、Ｃｏｌ−０レーン）中には観察されなかった。ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１が、ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡを発現する植物系統の一部だけに蓄積する理由、あるいは、ＨｖＣｓｌＨ１のタンパク質レベルと、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物のレベル（図１ＢおよびＣを比較されたい）または植物中に存在するＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンの数（データ非掲載）のいずれかとの間に相関がない理由は知られていないが、このことは以前から観察されていた（Burton et al., Science 311: 1940-1742, 2006）。ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１を発現する８、１１、１６および２４系統と検出可能なレベルのタンパク質を発現しない６系統（対照）を、次の実験のために選択した。
【０２０３】
免疫ＥＭを使用して、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の細胞壁が検出可能なレベルのβ−グルカンを蓄積するかどうかを決定した。８、１１、１６、２４および６系統の自家受粉子孫（Ｔ２世代）由来の成葉片の切片を、β−グルカンに特異的なモノクローナル抗体で検出し（Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994）、その後１８ｎｍの金粒子と結合した二次抗体を使用して検出した。金粒子は、ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１陽性の８、１１および１６系統（それぞれ、図２Ａ、Ｃ、Ｂ）の細胞壁中に明らかであるが、ＨｖＣｓｌＨ１を発現した（データ非掲載）２４系統または検出可能なＨｖＣｓｌＨ１タンパク質を有さなかった６系統（図２Ｅ）のいずれにおいても細胞壁中に明らかではなかった。各陽性トランスジェニック系統は、組織標識の異なるパターンを示した。８系統において、表皮細胞壁、時として木部壁にまばらな標識が観察されるが（図２Ａ）、一方１１系統では、表皮壁および維管束組織壁はわずかに標識されただけであるが、より強い（よりまばらではあるが）標識が葉肉壁において観察された（図２Ｃ）。広範囲に分布する明るい標識が、１６系統の成葉の細胞壁すべてに存在した（図２Ｂ）。「構成的に」発現される３５Ｓプロモーターにより駆動される遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統による異所性多糖類産生の不規則かつ非一貫性のパターンは、以前から観察されている（Burton et al., 2006,上記）。非形質転換シロイヌナズナの葉の切片においては、標識は見られなかった（図２Ｄ）。標識レベルの低下は、このβ−グルカンを特異的に加水分解する枯草菌（Bacillus subtilis）のエンドヒドロラーゼとともにプレインキュベートを行ったトランスジェニック植物の葉切片に見られた（Burton et al., 2006,上記、データ非掲載）。
【０２０４】
トランスジェニックシロイヌナズナの細胞壁にβ−グルカンが存在することの生化学的確認の提供、および新生β−グルカンの微細構造の調査のために、葉および／または茎材料を、植物８、１１および１６系統に由来する系統の自家受粉のＴ３およびＴ４の子孫からプールした。これらの系統は、ＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンについてホモ接合性であった。β−グルカンは、植物の年齢とともに蓄積されることが見出されたので、試料は植物が老齢になった際に採取した。細胞壁を調製し、（１，３：１，４）−β−グルカン特異的エンドヒドロラーゼを用いて消化し、放出されたオリゴ糖をＨＰＡＥＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによってプロファイルした。（１，４）−β−グルコシド結合が（１，３）−β−Ｄ−グルコシル残基の還元末端側にある場合、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼは、これらの結合を特異的に加水分解する。この酵素の作用により、さまざまな重合度（ＤＰ）の、一連のオリゴ糖が生成される。この一連の診断用オリゴ糖は三糖類のＧ４Ｇ３ＧＲおよび四糖類のＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ（式中、Ｇは、β−Ｄ−グルコピラノース、３および４は、それぞれ（１，３）および（１，４）結合を示し、ＧＲは還元末端残基を指す）。８および１１系統ならびに植物１６に由来する２種の独立した系統（１６−１および１６−２系統）由来の葉または葉および茎から調製した細胞壁を、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて処理した場合、可変量のＧ４Ｇ３ＧＲおよびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲが放出された（図３、図９Ａ）。これらのオリゴ糖は、酵素で処理しなかった対照では検出されなかった。Ｇ４Ｇ３ＧＲとＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲとの比（ＤＰ３：ＤＰ４）は、１６−１系統において３．５であることが推定され、これは、オオムギ葉試料由来のβ−グルカンに関して得られたＤＰ３：ＤＰ４比の３．６と同様である。グルコース（Ｇ３ＧＲ）の（１，３）−β結合二糖類であるラミナリビオースと同時溶出したピークが、複数の試料において、８、１１および１６−２系統においてさまざまなレベルで観察された（図９Ａ、データ非掲載）。この産物はオオムギおよび酵素未処理の対照試料には存在せず（図９Ａ）、その出現が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ調製物中の酵素の混入あるいは内在性二糖類またはシロイヌナズナ内の酵素活性によるものではないことが検証される。このプロファイルにおけるオリゴ糖の種類をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によってさらに確認し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、ＨＰＡＥＣプロファイルにおいて観察された比と同様の比でＨｅｘ２、Ｈｅｘ３およびＨｅｘ４の存在を示した（図９Ｂ）。１６−１および１６−２系統におけるβ−グルカンの量は、Ｇ４Ｇ３ＧＲのピーク面積から推定されるように、それぞれ、総細胞壁の０．００５％および０．００３％（ｗ／ｗ）であった。
【実施例３】
【０２０５】
ＨｖＣｓｌＨ１は、ＨｖＣｓｌＨ１を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の、ＥＲ関連小胞およびゴルジ関連小胞内に位置するが、細胞膜には位置しない
１１系統由来の高圧凍結葉の切片を、金標識抗ＨＡ抗体とともにインキュベートし、ＨｖＣｓｌＨ１の細胞内位置を決定した。標識は、小胞体およびゴルジ由来小胞に見出されたが、細胞膜には見出されなかった（図４Ａ、Ｂ）。同様の結果が、根および実生の標識切片において観察された（データ非掲載）。
【実施例４】
【０２０６】
オオムギにおいて、成長中の穀粒、花の組織および二次細胞壁肥厚中の葉の細胞で、ＨｖＣｓｌＨ１は、低レベルで転写される
さまざまなオオムギ組織において、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して決定した。遺伝子特異的プライマーを表４に表す。
【表４】
【０２０７】
図５（Ａ〜Ｃ）は、一連のオオムギの栄養組織および花組織のｃＤＮＡにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物が慣用的に１，０００ｓコピー／μｌ ｃＤＮＡ未満のレベルで蓄積されたことを示す。この値は、本発明者らが通常１０，０００ｓから１００，０００ｓコピー／μｌ ｃＤＮＡの範囲の値で研究した他のオオムギＣＥＳＡおよびＣＳＬの一部より低かった。ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルは、子葉鞘および葉脚を含む、急速に伸長する細胞を含む組織において比較的低く、これらは活発にβ−グルカンを合成する組織である。
【０２０８】
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルは葉頂において最も高く、ここでは、細胞はもはや活発に成長せずβ−グルカンの蓄積も減っている（図５Ｃ；２、４）。葉におけるＨｖＣｓｌＨ１の転写は、１０日齢の実生の葉頂から開始した約１３ｃｍ長の葉内の６か所の範囲から単離されたＲＮＡを使用してさらに特徴を調べた。これらの範囲は、完全に成熟した細胞（範囲Ａ）から分裂細胞を含む葉脚（範囲Ｆ）を含む。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ（実施例５を参照されたい）を使用して、ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡを含む葉頂中のそれらの細胞を同定した。この技術において、遺伝子転写産物が検出された細胞は、紫から暗い褐色に染色される（図５Ｄ、１８Ｓ ＲＮＡ陽性対照）。転写の起こらなかった細胞は、明るい褐色に染色され、陰性対照として検出される（図５Ｅ）。ＨｖＣｓｌＨ１は、維管束間の、厚膜組織の繊維細胞および木部細胞などの二次細胞壁肥厚にある細胞において大部分は転写される（図５Ｆ）。オオムギ葉から採取した切片を使用する免疫ＥＭおよびβ−グルカン抗体での検出により、これらの細胞の細胞壁中のβ−グルカンを同定した。
【０２０９】
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルを、さらに、一連の２４日の成長中の胚乳においてより詳細に調査した（図５Ｂ）。ＨｖＣｓｌＨ１の発現は、成長中のデンプン質胚乳全体で低かった。胚乳細胞壁においてβ−グルカンが最初に検出されるおよそ１日前の４ＤＰＡにおいて、最大転写レベルに達した。この転写パターンは、成長中の穀粒においてもまた発現された、いくつかのオオムギＣＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、７、８および１０）の転写パターンと同様であるが、ＨｖＣＳＬＦ９および６は、さらにより高い転写産物レベルを示す。
【実施例５】
【０２１０】
考察
本明細書に提示したデータは、イネ科植物特異的ＣＳＬＨ遺伝子ファミリーのメンバーであるＨｖＣｓｌＨ１の産物が、シロイヌナズナにおいてβ−グルカンの生合成を仲介することを示している。オオムギは、ＥＳＴデータベース分析、ゲノムＤＮＡブロット分析およびＢＡＣライブラリのスクリーニングに基づき、ＣＳＬＨ遺伝子を一つだけ有すると思われる。パンコムギ、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum）、トールフェスク（Festuca arundinacae）およびミナトカモジグサ（Brachypodium distachon）（すべてイチゴツナギ亜科（Pooideae））などの他のイネ科植物のＥＳＴ分析は、オオムギと同様の１種の同定ＣＳＬＨ遺伝子を有するが、トウモロコシ、ソルガムおよびサトウキビ（すべてキビ亜科（Panicoideae））、コメなど（エールハルタ亜科（Ehrhartoideae））は、複数のＣＳＬＨ遺伝子を有すると思われる。ＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡのエピトープタグ付加形態を、シロイヌナズナにおいて異種発現させた場合、タンパク質が検出された４つの植物系統の３つが、β−グルカン特異的モノクローナル抗体により認識された多糖類を、それらの細胞壁に蓄積した。トランスジェニック系統の単離細胞壁を、特異的（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて消化した場合、特有の三糖類（Ｇ４Ｇ３ＧＲ）および四糖類（Ｇ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ）が、オオムギ胚乳由来のβ−グルカンに見出される比と同様の比で検出され、トランスジェニックシロイヌナズナ系統由来の細胞壁が、β−グルカンを含んだことを実証する。さらに、エピトープタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１は、トランスジェニック植物細胞の小胞体およびゴルジ由来小胞において見出された。ＨｖＣｓｌＨ１を発現したトランスジェニックシロイヌナズナ系統の形態学的表現型は、野生型植物と同一であると思われる。
【０２１１】
（１，３）−および（１，４）−β−グルコシル結合の全割合ならびに１６−１系統植物に由来する細胞壁の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ消化からのＧ４Ｇ３ＧＲおよびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ産物の比は、オオムギ組織から単離されたβ−グルカンにおいて観察される比と同様であるが、観察された一つの独特な特徴は、１６−２系統の細胞壁から、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼにより放出される主要なオリゴ糖がラミナリビオースであることであった（Ｇ３ＧＲ；図９Ａ）。可変レベルのＧ３ＧＲの存在はまた、三糖類の四糖類に対するレベルの増加、したがってＤＰ３：ＤＰ４比の増大に関連した。大部分の植物系統の細胞壁消化物中にＧ３ＧＲが存在することは、交互の（１，３）−β−および（１，４）−β−結合のグルコシル残基（−Ｇ３Ｇ４Ｇ３Ｇ４−）の多糖類含有切片を示す。これらが個別の多糖類中に存在するか、またはさらに通常の微細構造の特徴を有するβ−グルカン鎖の一部を構成するかは分かっていない。交互の（１，３）−β−Ｄ−グルコシルおよび（１，４）−β−Ｄ−グルコシル残基は、オオムギと、他の穀類のβ−グルカンにおいて共通ではないが、非開花植物のトクサ属（Equisetum）由来のβ−グルカンの重要な成分を表し、さらに担子菌類および子嚢菌類を含む多くの真菌由来のβ−グルカン中に検出される。Ｇ３ＧＲはトランスジェニックシロイヌナズナにおけるβ−グルカンシンターゼの誤制御を介して生じる可能性があり、その膜の微小環境が異なるため、またはオオムギにおいて、（１，３）−βグルコシド結合形成を抑制する（または（１，４）−βグルコシド結合形成を促進する）未知の因子が、シロイヌナズナに最適以下のレベルで存在するためと思われる。植物１６に由来する系統の中でこの因子のレベルがわずかに変化することが、得られた構造の違いの原因であろう。β−グルカンの構造のばらつきに関する別の考えられる説明は、組み立て後のプロセシングの微妙な差に関すると思われる（さらに、下記の支援情報を参照されたい）。
【０２１２】
オオムギにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１は、組織が完全に成熟した細胞を含む葉頂で最も高度に転写された。ＨｖＣｓｌＨ１および任意のオオムギＣＳＬＦの連携転写（coordinate transcription）を示す証拠はなく、それらがコードする産物が、タンパク質複合体の成分ではないことを示唆している。例えば、ＨｖＣｓｌＨ１の転写は、オオムギにおいてβ−グルカンが特徴的に蓄積される組織である子葉鞘または成長中の胚乳などの伸長する細胞中では高くない。通常は、細胞増殖の調節、およびおそらく暗所においてエネルギー供給源として動員できるグルコースの一時貯蔵に関係すると思われる栄養組織の一次細胞壁に見出されるが、β−グルカンは、木部管状要素および厚膜組織繊維の木化細胞壁においてもまた見出され、ここでは、β−グルカンに対する抗体を使用する免疫ＥＭにより、中葉領域（一次細胞壁）と膜組織細胞の二次細胞壁との両方において標識が示される。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲは、葉中のＨｖＣｓｌＨ１遺伝子の転写が、維管束間の厚膜組織の繊維細胞および木部細胞などの細胞に限定されていることを示すので、植物中の他の場所における一次細胞壁のβ−グルカン合成における役割を除外することはできないが、この遺伝子の主要な役割は、二次細胞壁成長の間のβ−グルカン合成にあることが示唆される。
【０２１３】
β−グルカンの微細構造がどのように生じたかにかかわらず、ＣＳＬＨがシロイヌナズナにおいてβ−グルカンの合成を仲介できることは明らかであり、どのようにこの多糖類が合成されるかという本発明者らの理解に関する暗示を有する研究成果である。β−グルカンの組み立てに関すると考えられる機序は、優勢なセロトリオシルおよびセロテトラオシル単位の合成、これらの（１，４）−β−単位と単一の（１，３）−β−結合とのランダムな結合、そして三糖類単位と四糖類単位のモル比を制御する手段で説明できるはずである。少なくとも２種のグルコシルトランスフェラーゼ活性が共同して作用すると思われ、一方の活性は、（１，４）−β−結合グルコース残基を連続的に付加し、三糖類および四糖類を組み立て、他方の活性は、単一の（１，３）−β−結合を付加する。多糖類シンターゼの本発明者らの最近の知見に基づき、いくつかの機序は仮定として可能である。最も簡略な説明は、１種のポリペプチドが両方のグルコシド結合型の合成に関与していることである。本発明者らのトランスジェニック実験は、ＣＳＬＨタンパク質が独立してβ−グルカンを作ることができ、したがっておそらく両方の型のβ結合を生成することができることを示している。ＣＳＬＨファミリーは、糖質作用性酵素（Carbohydrate Active Enzymes：ＣＡＺｙ）データベースにより、グリコシルトランスフェラーゼファミリー２（ＧＴ２）のメンバーであると分類され（http://www.cazy.org; Coutinho et al., J Mol Biol 328: 307-317, 2003）、このファミリーは、（１，３）−β−または（１，４）−β−結合のいずれかの合成を独立して触媒できる酵素を含み、二機能性酵素、すなわち２種のグリコシド結合を合成できる酵素の例でもある。例えば、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）は、（１，４）−β−グルクロン酸−（１，３）−β−Ｎ−アセチルグルコサミンの繰り返し二糖単位を合成し、両方のトランスフェラーゼ活性が、１種のポリペプチドにある。マウスＨＡＳ１において、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷモチーフを含む領域は、これらの活性の両方に関与する。Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷモチーフをさらに含む、ＣＳＬＨの活性部位は、同様に二機能性であると思われる。別の可能性は、ＣＳＬＨシンターゼが、単子葉植物および双子葉植物に共通の、第２の結合の合成に関与する別のグルコシルトランスフェラーゼと、唯一のグルコシド結合を合成することである。
【実施例６】
【０２１４】
材料と方法
バイナリーベクターの構築および植物の形質転換
ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦを、オオムギ品種スクーナーの成葉頂のｃＤＮＡから、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）（Stratagene）を用い、プライマーＨｖＨ１ＴＯＰＯｆおよびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を使用して増幅し、ＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングした。製造業者（Invitrogen）のプロトコルを使用し、ＬＲ反応を使用して、ＮＨ２末端に３×ＨＡタグを含むデスティネーションベクターｐＧＷＢ１５にｃＤＮＡをクローニングし（Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007）、ＤＮＡ配列決定により、予測配列を確認した。ＨｖＣｓｌＨｌ：：ｐＧＢＷ１５構築体を、大腸菌（Escherichia coli）からアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＡＧＬ１株に、三親接合を介し、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を使用して移した。シロイヌナズナＣｏｌ−０植物を、フローラルディップ法を使用して形質転換した（Clough and Bent, Plant J 16: 735-743, 1998）。
【０２１５】
ＲＮＡブロット分析
Ｔ１植物の成熟ロゼット葉からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Invitrogen）を使用して抽出した、約１０μｇの総ＲＮＡ試料を調製し、１％ｗ／ｖアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離した（Farrell, RNA methodologies: A laboratory guide for isolation and characterization, Academic Press, Inc., San Diego, 1993）。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋膜に転写し、Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出モジュール（Amersham-Biosciences）に概説された方法に従って、プレハイブリダイズおよびハイブリダイズを行った。プライマーＨ１Ｆ２およびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を用いて増幅したＨｖＣｓｌＨ１断片を、Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅラベリングモジュール（Amersham）を使用し、製造業者のプロトコルに従って標識し、プローブとして使用した。
【０２１６】
定量的ＰＣＲ分析
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＱＰＣＲを、Burton et al.（Plant Physiol 146, 1821-1833, 2008）に記載された変法を用いて、Burton et al.（Science 311, 1940-1942, 2006; Plant Physiol 134, 224-236, 2004）に記載のように実施した。オオムギ対照遺伝子のプライマー配列を表４に記載する。
【０２１７】
ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ
ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲを、Koltai & Bird（Plant Physiol 123: 1203-1212, 2000）の方法に従って、下記の変形を加え実施した。組織を切片にした後、ゲノムＤＮＡを、３７℃において６時間、１×ＤＮａｓｅ緩衝液および４Ｕ ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（Promega）中で処理することによって取り出した。ｃＤＮＡの合成を、ＲＮａｓｅ Ｈステップを省き、遺伝子特異的プライマー（１μｇ、表３）を逆転写に使用したことを除き、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Invitrogen）を使用して実施した。ＰＣＲを、１×ＰＣＲ緩衝液、２００μｍ ｄＮＴＰ（Promega）、０．２ｎｍｏｌジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Roche）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎｇの各プライマーおよび２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含む、最終容量５０μＬ中で実施した。サイクリングパラメーターは、下記のとおりである：初期変性９６℃２分、次いで、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル。その後切片を洗浄し、１．５Ｕのアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（Roche）とともにインキュベートし、Koltai & Bird（2000、上記）により概説されたように、１０〜２０分発色させた。陰性対照切片では、逆転写酵素を省き、すべてのＨｖ １８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを含み、ゲノムＤＮＡから任意の増幅があったかどうかを確認した。
【０２１８】
混合ミクロソーム膜の調製
ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物のＴ１種子を回収し、約１００個の種子を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Sigma）を含有する１×ＭＳ寒天培地上に撒いた。３週間後、カナマイシン耐性の実生をプールし、液体窒素中で凍結し、ホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５、０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、８３μＬ植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma、P9599））を含む乳鉢および乳棒で４℃において粉砕した。ホモジネートを、５０μＭメッシュのフィルターを通してろ過し、Ｓ／Ｎを、６，０００×ｇで１０分間、４℃において遠心した。Ｓ／Ｎをデカントし、５０，０００×ｇで３０分間、４℃において、４．５ｍｌの超遠心管（Beckmann）において遠心した。５０，０００×ｇのＳ／Ｎをデカントし、ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に、ガラス−テフロンホモジナイザーを使用して再懸濁した。再懸濁したペレットを、Ｔｒｉ−ＭＥＳ緩衝液を用いて４．５ｍＬに希釈し、１００，０００×ｇで、１時間、４℃において遠心した。ペレットを、上に概説したように、０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬（BioRad）を使用して測定し、ウシ血清アルブミンを標準として使用した。
【０２１９】
ウェスタンブロッティング
膜タンパク質（３０μｇ）の試料を、６０℃において２０〜６０分間、２００ｍＭジチオスレイトールおよび試料緩衝液（３７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール、３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０２５％ブロモフェノールブルー）中でインキュベートし、ＳＤＳ：タンパク質比を１．５ｍｇＳＤＳ対３０μｇのタンパク質にして、その後８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース（ＯＳＭＯＮＩＣ（商標）Ｎｉｔｒｏｐｕｒｅ ２２μｍ）に、０．０５％ＳＤＳを含有するＴｏｗｂｉｎ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中で４℃において１００Ｖ、９０分間かけてブロットした。次いで、膜を、３％ｗ／ｖ粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）において一晩ブロッキングし、その後、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳで１：１０００に希釈したラット抗ＨＡポリクローナル抗体（Roche）中で室温で１時間インキュベートした。膜を０．０５％ＳＤＳ（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳで３回洗浄し、次いで、３％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含有するＴＢＳで１：１０００に希釈した抗ラットＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Dako）中でインキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Pierce）を用いて検出した。
【０２２０】
免疫電子顕微鏡法
シロイヌナズナ組織を固定し、Burton et al.（Science 311, 1940-1942, 2006）に従って、抗（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的抗体（Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994）を用いて標識した。抗ＨＡ抗体を用いた標識のために、植物組織を２つの銅のプランチェットの間に置き、Ｌｅｉｃａ ＥＭ高圧フリーザーにおいて急速に凍結させた（２．７×１０５ｋＰａおよび−１０，０００℃ｓ−１の適切な速度に設定する）。プランチェットを、−５０℃、７２時間に設定したＬｅｉｃａ自動凍結置換装置中で１００％エタノールに移した。試料を、室温（ＲＴ）で一晩置き、取り出し、ＬＲ Ｗｈｉｔｅ樹脂でろ過し、Burton et al.（2006、上記）に記載のようにゼラチンカプセルに包埋した。包埋した葉組織の切片をフォルムバー被覆金グリッド上に回収し、１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１：２００に希釈したラット抗ＨＡポリクローナル抗体中で室温で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。グリッドをＰＢＳで数回洗浄し、次いで、１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：２０に希釈した１８ｎｍ金（Jackson ImmunoResearch）と結合した抗ラット二次抗体中で室温で１時間インキュベートした。次いで、グリッドを洗浄し、染色後、Burton et al.（2006、上記）に記載のようにＴＥＭ下で見た。
【０２２１】
細胞壁材料の調製
アルコール不溶性画分（ＡＩＲ）を、植物材料を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を使用して粉砕することによって調製した。５倍量の８０％エタノールをホモジネートに加え、その後４℃において１時間回転することによって混合した。３，４００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、残留物を室温で８０％エタノール中で１時間、２回還流し、その後５０％エタノール中で１時間、２回還流した。エタノール可溶性画分を取り除き、ＡＩＲを１００％エタノールで１回洗浄し、その後４０℃において真空乾燥させた。
【０２２２】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的エンドヒドロラーゼ消化
ＡＩＲ（１００ｍｇ、上記のように調製）を、５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ６．５中で２時間、５０℃において、２００ｒｐｍで振とうしてインキュベーター中で連続混合しながらインキュベートした。２時間後、懸濁液を遠心分離（３，４００×ｇ、５分）にかけ、上清（Ｓ／Ｎ）を取り除いた。別の５ｍＬの緩衝液を加え、インキュベートおよび遠心分離を繰り返した。この２次インキュベートで得たＳ／Ｎを、酵素非含有陰性対照として使用した。ペレット化したＡＩＲを、５ｍＬのＮａＰＯ４緩衝液に再懸濁し、これに、１００μｌの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ（McCleary et al., J Inst Brew 91: 285-295, 1985）を加えた。混合物を、連続混合しながら、５０℃において２時間インキュベートし、その後Ｓ／Ｎを、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖として回収した。陰性対照および（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ処理Ｓ／Ｎを、グラファイト化カーボンカートリッジ上で、Packer et al.（Glycoconj J 15: 737-747, 1998）により記載のように脱塩し、乾燥させた。
【０２２３】
ＨＰＡＥＣ分析
乾燥させた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖を、１００μＬのＭｉｌｌｉ Ｈ２Ｏに溶解し、２０μＬを、０．２Ｍ ＮａＯＨ中の５０ｍＭ ＮａＯＡｃを用いて平衡化したＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（Dionex）に、パルスアンペロメトリック検出装置（ＰＡＤ）およびオートサンプラーを搭載したＤｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣ ＩＣＳ ３００システム（Dionex）を使用して注入した。オリゴ糖を、０．２Ｍ ＮａＯＨ中５０ｍＭのＮａＯＡｃから０．２Ｍ ＮａＯＨ中３５０ｍＭまでの線形勾配で、１５分かけて、１ｍＬ／分で溶出した。ラミナリビオース（Seigaku）、マルトースおよびセロビオース（双方ともSigma）を、標準として流した。
【０２２４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
残りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖のアリコート（３０μＬ）を凍結乾燥させ、ＤＭＳＯに溶解し、ＮａＯＨ法（Ciucanu and Kerek, Carb Research 131: 209-217, 1984）を使用してメチル化した。メチル化オリゴ糖を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に分配し、ＤＣＭ相をＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。ＤＣＭ相を、Ｎ２気流下で乾燥させ、その後１０μＬの５０％アセトニトリルに再溶解した。１μＬのアリコートを、１μＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（５０％アセトニトリルに溶解して１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、１μＬの混合物を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計（Voyager DSTR, Applied Biosystems）において分析するために、ＭＡＬＤＩプレートにスポットした。
【０２２５】
ＥＳＴ分析、コンティグの組み立ておよびバイオインフォマティクス
ＢＬＡＳＴサーチツール（Altschul et al., Nucl Acids Res 25: 3389-3402, 1997）を使用して、ＣＳＬＨ ＥＳＴを、現在中止になったＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ ｗｅｂｓｉｔｅ、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、ＨａｒｖＥＳＴ（http://harvest.ucr.edu/）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml）、Ｂａｒｌｅｙ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｅｘ（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）およびＢａｒｌｅｙ Ｂａｓｅ（www. barleybase.org）を含む、公共のデータベースに照会することにより得た。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商標）３．０（GeneCodes）またはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ ９．１．０（Invitrogen）のモジュールであるＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓのいずれかを使用して、コンティグに組み立てた。ＤＮＡまたはタンパク質の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Thompson et al., Nucl Acids Res 24: 4876-4882, 1997）を使用してアライメントした。系統発生学的分析を、固有近隣結合アルゴリズムを使用して実施し、ツリーのロバスト性は、１０００回のブートストラップ反復を使用して評価した。配列類似性を、ＭａｔＧａｔ ２．０２（http://bitincka.com/ledion/matgat/）（Campanella et al., BMC Bioinformatics 4: 29, 2003）を使用して計算した。膜貫通ドメインは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de）（Schwacke et al., Plant Physiol 131: 16-26, 2003）に記載の一連のプログラムを使用して予測した。翻訳後修飾を予測するモチーフは、Ｔｏｏｌｓメニュー（http://www.expasy.org/tools/#pattern）のＥｘＰａｓｙに記載のプログラムを使用して同定した。タンパク質パラメーターは、ＥｘＰａｓｙ（http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam）のＰｒｏｔＰａｒａｍを使用して計算した。
【０２２６】
オオムギＢＡＣスクリーニング
非Ｙｄ２ 品種モレックス（Clemson University Genomics Institute, CUGI）由来のオオムギゲノムの６．５等価体を含有するＢＡＣフィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液（０．５３Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液 ｐＨ７．２、７．５％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１１μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、６５℃において６時間ブロッキングした。プライマーＨ１Ｆ１およびＨ１Ｒ１またはＨ１Ｒ５（表３）を用いて増幅した、放射性標識ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ断片を加え、６５℃において、２４時間インキュベートした。フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、室温で３回洗浄した。最終の洗浄を、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて実施した。フィルターを、Ｘ線フィルムに２ｄで撮影した。陽性ＢＡＣクローンを同定し、ＣＵＧＩウェブサイト（http://www.genome.clemson.edu）に支持されたように整理した。クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に画線し、３７℃において一晩増殖させた。各クローンのコロニーを採取し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に載せた、グリッドの付いたナイロン膜に置き、３７℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡを、膜上に固定し、０．４Ｍ ＮａＯＨに浸したろ紙上に２０分間置くことによって変性させ、次いで、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸したろ紙上に置くことによって中和した。次いで、膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄し、標準的条件（Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989）を使用してハイブリダイズを行った。
【０２２７】
ＢＡＣ ＤＮＡの単離
陽性クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス中で、３７℃において一晩培養した。細胞を、遠心分離（１２，０００×ｇ、３分）によってペレット化し、このペレットを９０μＬのＴＥＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ｗ／ｖスクロース）に再懸濁した。溶解溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）のアリコート（１８０μＬ）を加え、ゆっくりと混合し、その後１３５μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．６を加えた。染色体ＤＮＡを遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）によってペレット化した。Ｓ／Ｎを回収し、２μＬのＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃において１時間インキュベートした。Ｔｒｉｓ飽和フェノール−クロロホルム（比１：１）の４００μＬのアリコートを加え、試料を再度遠心分離にかけた（１２，０００×ｇ、５分）。Ｓ／Ｎを回収し、ＢＡＣ ＤＮＡを、２〜３倍の冷却９５％エタノールを使用して、室温で１０分かけて沈殿させた。ＢＡＣ ＤＮＡを、遠心分離（１５，０００×ｇ、１５分）によりペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、２０〜５０μＬのＴＥに再懸濁し、４℃において保存した。
【０２２８】
ゲノムウォーキング
Siebert et al.（Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995）のアダプターライゲーション法を使用して、公知のＣＳＬＨ ＥＳＴ配列の上流のゲノムＤＮＡ断片を増幅した。オオムギゲノムＤＮＡを消化するために使用した制限酵素は、ＥｃｏＲＶ、ＮｒｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩまたはＳｓｐＩであった。一次ＰＣＲ反応を、２μＬのライゲートＤＮＡ（１：１０希釈）、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、アダプタープライマーＡＰ１およびアンチセンスプライマーＨ１Ｒ７各１００ｎｇ（表３）、０．４ｍＭ ｄＮＴＰならびに１単位のＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する２５μＬ量で実施した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった：９６℃２分、次いで９４℃３０秒間、５９℃３０秒間、７２℃１分間を４０サイクル、および最終ステップ７２℃で７分間。二次ＰＣＲ反応を、１μＬの一次ＰＣＲ産物を用いて、アダプタープライマーＡＰ２およびネスティッドプライマーＨ１Ｒ６各１００ｎｇを使用して実施した。反応組成およびサイクルパラメーターは、アニーリング温度に６１℃を使用した以外は上記と同じであった。
【０２２９】
ＢＡＣの配列決定
配列決定のために、０．５から１μｇの単離ＢＡＣ ＤＮＡを、５ｐｍｏｌのプライマーおよび１×Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（ＢＤＴ）ミックス（Applied Biosystems, USA）と、最終容量２０μＬで混合した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった：９６℃１５分、次いで９６℃１０秒間、５５℃１０秒間および６０℃４分間を６５サイクル。ＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２および２．５容量の９５％エタノールを用いて氷上で１０分間沈殿させ、次いで１２，０００×ｇで３０分回転させることによってペレット化した。ペレットを７０％エタノールですすぎ、乾燥させ、配列決定のためにＡＧＲＦ（Brisbane, Australia）に送付した。
【０２３０】
ＨｖＣｓｌＨ１のマッピング
遺伝子マッピングを、６０系統のＳｌｏｏｐ×Ｈａｌｃｙｏｎの倍加半数体（ＤＨ）マッピング集団を使用して実施した（Read et al., Aust J Agric Res 54: 1145-1153, 2003）。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al.,1989、上記）の標準的方法を使用して、プライマーＨ１Ｆ１およびＨ１Ｒ５（表３）を使用してＰＣＲ増幅したＨｖＣｓｌＨ１プローブを、６種の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ）の１種を用いて消化した、親系統のゲノムＤＮＡを含有する膜とハイブリダイズさせた。次いで、二遺伝子ハイブリッド集団を、明らかな多型をもたらす酵素（ＤｒａＩ）を用いて消化した。多型をスコア化し、ＨｖＣｓｌＨ１マップの位置を、ＭａｐＭａｎａｇｅｒ ＱＴバージョン０．３０（Manly et al., Mamm genome 12: 930-932, 2001）の「find best location」機能を使用して決定した。マップの位置は、http://www.barleyworld.org/において利用可能な供給源を使用したＱＴＬデータと相関した。
【０２３１】
シロイヌナズナの成長条件
シロイヌナズナの種子を、滅菌溶液（次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素２％）、Ｔｗｅｅｎ−２０数滴）中で１５分間表面滅菌し、次いで滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で４回すすいだ。表面滅菌種子を、５０ｍＬの滅菌１×ＭＳ培地（４．３３ｇ／Ｌ ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎塩類（Phytotechnology Laboratories）、２％ｗ／ｖスクロース、１％ｗ／ｖバクトアガー）を含有する８５×２５ｍｍのペトリ皿に広げた。形質転換体の選択のために、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Sigma）を培地に加えた。プレートを、４℃の低温室に３〜５日置き、同時に発芽させた。次いで、低温湿性処理プレートを、昼と夜の温度がそれぞれ２３℃および１７℃の環境制御成長キャビネット（Thermoline L+MモデルTPG1260 TO-5x400、Smithfield、NSW、Australia）に移した。ロゼット葉における平均光強度レベルは、１６時間の明サイクルで、三足蛍光灯（Sylvania Standard F30W/133-T8 Cool White）により供給された、約７０μＥ ｍ−２Ｓ−１であった。ＭＳプレート上で３週間後、個々の苗を、水和させた直径４２ｍｍのＪｉｆｆｙペレットに移した。トレイに６つのペレットを９列並べ、３つのトレイを個々に２×３．５フィート金網台の棚に置き育てた。相対湿度を測定し、６０から７０％の間にした。植物に、地下灌漑によって２〜３日ごとに、Ｐｅｔｅｒ’ｓ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（商標）Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ植物用肥料（Scotts Australia）を補給した水道水を与えた。
【０２３２】
シロイヌナズナトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡの抽出およびＰＣＲ分析
ＤＮＡを、単一のシロイヌナズナの葉から、Edwards et al.（Nucl Acids Res 19: 1349, 1991）に記載の方法に従って抽出した。ゲノムＤＮＡの１μＬアリコートを、プライマーＨ１Ｆ２およびＨｖＣｓｌＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を使用する、下記のサイクリング計画：９４℃２分、その後９４℃２０秒、５７℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクルで、トランスジェニック植物のＰＣＲスクリーニングにおいて鋳型として使用した。
【実施例７】
【０２３３】
コメおよびオオムギ由来のＣｓｌＨ ＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメント
コメおよびオオムギ双方におけるＣｓｌＨ配列に関するＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメントを実施し、配列間の同一性および類似性のパーセントを計算し、その結果を図１０に示す。ＤＮＡおよびタンパク質配列をアライメントし、http://bitincka.com/ledion/matgat/からダウンロードしたＭａｔＧＡＴバージョン２．０２におけるデフォルトパラメーターを使用して比較した。
【０２３４】
マルチプル配列アライメントおよび系統樹作成を、Thompson et al.（Nucl Acids Res 25: 4876-4882,1997）により記載されたＣｌｕｓｔａｌＸプログラムを使用して実施した。タンパク質のアライメントおよび結果としての系統樹を、それぞれ図１１および１２に示す。
【実施例８】
【０２３５】
ＨｖＣｓｌＨ１およびＯｓＣＳＬＦ２トランスジェニックシロイヌナズナ系統の異種交配
タグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質が抗ＨＡ抗体を使用して検出された、２種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統１５−８および１５−１１を、ＯｓＣｓｌＦ２、Ｈ３７およびＨ１７−４を含む他の２種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統と、Burton et al.（Science 311: 1940-1942, 2006）により記載されたように、遺伝的に異種交配させるために選択した。ＨｖＣｓｌＨ１およびＯｓＣＳＬＦ２タンパク質を同じ細胞型の中に発現することによって、単一遺伝子（ＣＳＬＨまたはＣＳＬＦだけ）トランスジェニックシロイヌナズナ植物において観察されるレベルより高いレベルの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンが細胞壁中に堆積される可能性があると考えられた。さらに、このことは、免疫電子顕微鏡研究および化学的細胞壁分析において、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン検出の助けになるはずである。
【０２３６】
親系統の４種すべてが、それらの細胞壁に（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含有することを、免疫電子顕微鏡法により確認した（図１３）。４種の集団それぞれに由来する個体を、雌雄の親として使用した。雌親（例えば、個体Ｈ３７−５）の花はおしべの葯が裂開する前におしべを取り去り、雄親（例えば、個体１５−８−３）の裂開したおしべを使用して受粉した。個々の異種交配した花を標識し、得られた種子の鞘を脱水して回収した。
【０２３７】
個々の異種交配子孫を土に撒き、鋳型として葉のゲノムＤＮＡならびにＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマーおよび、別の反応において、ＯｓＣｓｌＦ２特異的プライマーを使用するＰＣＲによりそれらの遺伝子型を決定した。成葉を固定し、包埋し、切片にし、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンモノクローナル抗体を用いて標識した。図１４に観察されるように、多くの子孫が、親系統より非常に高いレベルの標識を有することが見出された。例えば、パネルＤに示す個体の表皮細胞中の標識は、その１５−８−３×Ｈ３７−７の親と比較して非常に多い（図１３）。同じ遺伝子型の同胞（図１４、パネルＣ）は、表皮細胞壁の標識のレベルが一貫して低いことを示した。
【実施例９】
【０２３８】
オオムギ栽培品種ヒマラヤおよびコムギ由来のＣｓｌＨ ｃＤＮＡおよびゲノム配列のクローニング
ＣｓｌＨ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を、オオムギ栽培品種ヒマラヤから、オオムギＥＳＴ配列、コメＣｓｌＨ１遺伝子配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）に基づくプライマーを使用するｃＤＮＡからのＰＣＲ、および５’ＲＡＣＥの組み合わせを使用して単離した。
【０２３９】
ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ）（配列番号６９）と称する２３３３ｂｐのコンセンサス配列を、図１６に示す。７５１アミノ酸（配列番号７０）の単一の長いオープンリーディングフレームが存在する。
【０２４０】
オリゴヌクレオチドプライマーＳＪ９１およびＳＪ８５を、コンセンサス配列の５’および３’末端から設計し、これらを使用して、図１７においてＨｖＣｓｌＨ１ｇＨｉｍ（配列番号７１）と称するゲノムＤＮＡから３２０３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【０２４１】
オオムギｃＤＮＡ配列およびゲノム配列のアライメントにより、ＣｓｌＨ遺伝子が、コンセンサスＧＴ．．ＡＧスプライスドナー／アクセプター部位に、個々に隣接する８個の小型（およそ１００ｂｐ）のイントロンを有することが示された（図１７）。
【０２４２】
ＣｓｌＨ１のコムギホモログを、ＴＩＧＲデータベースにおいてＴＣ２５５９２９と同定した。ＥＳＴのＣＪ６１４３９２、ＣＪ６０９７２９およびＣＪ７２１２０４により例示されるように、配列の３つのクラスにより、この仮想コンセンサスが構成された。ＰＣＲプライマーを、ＡＴＧ開始コドンの周囲のオオムギ配列（ＳＪ１６３）および３’末端における３種のＥＳＴ型すべてのコンセンサス配列（ＳＪ１６４）から設計し、コムギ栽培品種チャイニーズ・スプリング由来の全長ゲノム断片を増幅するために使用した。２種の配列型を同定し、ＴａＣｓｌＨ１−１（配列番号７８）およびＴａＣｓｌＨ１−２（配列番号７９）と名付けた。
【０２４３】
ＴａＣｓｌＨ１−３（配列番号８０）と称する第３のホモログを、材料および方法においてより詳細に記載した、プライマーＳＪ２０４およびＳＪ１６４を使用して単離した。
【０２４４】
オオムギ配列との比較により、イントロン−エクソン接合部が、３種の遺伝子すべてにおいて保存されていることが示された（図１７）。３種のコムギ遺伝子は、９４．８〜９６．１％同一である。
【０２４５】
３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子の推定コード領域の配列（配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４）は、それぞれ、７５２アミノ酸のポリペプチド（配列番号７５、配列番号７６および配列番号７７）をコードする。
【０２４６】
オオムギおよびコムギのＣＳＬＨ１遺伝子のＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列を、ｍｕｓｃｌｅアライメントプログラムを使用してアライメントし、同一性および類似性のパーセントを、ＰＡＭ２５０マトリックスを使用して計算した。同一性および類似性のパーセントを示す表を、図２７に示す。
【０２４７】
図２７に示すように、コムギタンパク質は、互いに約９４〜９５．０％の同一性を有し、オオムギタンパク質と約９２．６〜９３．１％の同一性を有する。
【実施例１０】
【０２４８】
オオムギおよびコムギにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発現
ＣｓｌＨ１遺伝子の発現を、半定量的（ＲＴ−ＰＣＲおよびゲル電気泳動）と定量的（リアルタイムＰＣＲ）法により調査した。
【０２４９】
βグルカンのレベルは、子葉鞘の成長に伴い増加し、その後成長の停止後に減少するので、子葉鞘は、βグルカンの生合成に関する遺伝子の発現を調べるために良好な組織である。ＣｓｌＨ１遺伝子は、成長の停止後にだけ最大の発現を示し、最も古い組織（６〜８日齢、図１９Ａ／Ｂに示すように）において高い。
【０２５０】
他の組織もまた調べた。成長中の葉において、ＣｓｌＨ１遺伝子は、葉の頂点の最も古い組織において示差的および最大発現を示す（図２０）。これらの結果から、ＣｓｌＨ１遺伝子は、分裂および伸長を停止し、したがって分化する細胞において、選択的に（しかし排他的ではない）発現すると思われる。成熟胚乳中の細胞は、成長の同様の段階にある、すなわち、細胞分裂が停止し、細胞の拡大が緩慢になり、細胞が特殊化したデンプン保存柔組織に分化する。
【０２５１】
オオムギ胚乳組織において、ＣｓｌＨ１遺伝子発現は、開花後４日ほどでピークを迎え、その後、後期の間に増加し、２８日目で最大に達する（図２１）。
【０２５２】
コムギにおいてＣｓｌＨ１遺伝子発現には大きな差があり、開花後４日目で発現はピークを迎え、その後は非常に低い。これらの結果をリアルタイムＰＣＲにより確認し、開花後２８日目において、ＣｓｌＨ遺伝子の発現が、オオムギにおいてコムギより約１０倍高いことが示された（図２２）。
【実施例１１】
【０２５３】
コムギ穀粒におけるオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現
トランスジェニックコムギ植物を、バイオリスティック形質転換により、発現が胚乳組織においてのみ起こるようにグルテニンプロモーターの制御下で全長ゲノムＨｖＣｓｌＨ１（品種ヒマラヤ）遺伝子により作出させた（図２３）。系統を、トランスジーンの有無に関して、若葉材料のＰＣＲによりスクリーニングした。１２種のＰＣＲ陽性系統および３種のＰＣＲ陰性系統（Ｈ１−２、−７および１１）を、成熟まで温室において成長させた。ＲＮＡを、開花約１５日後に成長中の穀粒から単離し、ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩを使用して調製した。その後、オオムギトランスジーンの発現を、リアルタイムＰＣＲにより分析した。使用したプライマーは、コムギおよびオオムギの遺伝子双方を増幅するので、表５は、内在性のコムギＣｓｌＨ遺伝子と比較した相対的発現レベルを示す。
【表５】
【０２５４】
大部分の系統が、対照より数百倍高いレベルでオオムギＣｓｌＨ遺伝子を発現し、９、１０、１２および１４系統は最も高い発現を示した（１０００倍を超えて高い）。
【０２５５】
成熟時に、単一穀粒のβグルカン含有量に関して分析し、結果の要約を表６に示す。
【表６】
【０２５６】
ＰＣＲ陰性系統はすべて、平均すると穀粒重量の０．６９％の、最も低いβ−グルカン含有量を有し、一方、ＰＣＲ陽性系統由来の穀粒は、０．９７％の高い平均β−グルカン含有量を有した。表６の最後の列は、所与の系統由来の任意の単一穀粒の最大β−グルカン含有量を示し、最も高いＰＣＲ陰性系統は１．０％（大部分の穀粒はこれより非常に低い）であるが、いくつかのＰＣＲ陽性系統は有意に高いβ−グルカンレベルの穀粒を有し、９系統および１０系統（最も発現が高い）は、最大１．９％のβ−グルカンを含む穀粒を有する。β−グルカンのこれらのレベルは、以前はコムギでは見られなかった。
【０２５７】
これらのＴ０植物の先端は、トランスジーンについて分離するＴ１種子を含有する。ＤＮＡを単一の遺伝子座に挿入した場合、３種のトランスジェニック対１種の野生型種子の比が観察されるはずである。図２５は、Ｈ１トランスジェニック１０系統由来の個々のＴ１種子のβ−グルカンレベルを示し、これにより、およそ３／４（４７／６１）が、ＰＣＲ陰性系統の平均（０．７％）より高いβ−グルカンレベルを有することを見出すことができる。最も高いβ−グルカンレベル（１．９％）と平均ＰＣＲ陰性レベル（０．７％）との比から、β−グルカン含有量の増加は、野生型コムギ穀粒で通常見られる量の２．７倍である。さらに重要な観察結果は、穀粒の多くの割合が、少なくとも１．４％のβグルカンを有することである。
【０２５８】
系統がホモ接合性になり、遺伝子量が増加した場合、これらの穀粒においてβ−グルカンのさらなる増加が見られることが予想される。
【実施例１２】
【０２５９】
実施例９から１１までの材料および方法
植物材料
オオムギ（Hordeum vulgare）栽培品種ヒマラヤおよびコムギ（Triticum aestivum）栽培品種チャイニーズ・スプリング、ウェストニア（Westonia）およびボブホワイト（Bob White26）を、標準的温室条件下で成長させた。
【０２６０】
プライマー配列
実施例９から１１まで、および本実施例において参照するプライマー配列を、下記の表７に示す：
【表７】
【０２６１】
ＤＮＡ、ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
植物ＤＮＡを、十分に膨張した葉の組織から、ＣＴＡＢに基づく方法（Murray and Thompson, Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325, 1980）を使用して単離した。総ＲＮＡを、葉および子葉鞘の組織から、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡｅａｓｙキットを使用して単離した。ＲＮＡを、成長中の胚乳からフェノールＳＤＳ法およびＬｉＣｌ沈殿（Clarke et al., Functional and Integrative Genomics 8, 211-221, 2007）を使用して単離した。ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅを用いて、Ambion社の「ＤＮＡフリー」キットを使用して処理し、次いでｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｌＩＩ逆転写酵素を使用して、製造業者（Clontech）の指示書に従って合成した。
【０２６２】
ＣｓｌＨ遺伝子のクローニング
ＣｓｌＨ遺伝子をクローニングする方法は、ＣｓｌＦ遺伝子のクローニングおよび特性決定において記載された方法と同様であった（Burton et al., Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）。コメセルロースシンターゼ様Ｈ１遺伝子（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）のオオムギホモログの１．８ｋｂ仮想コンセンサス配列（ＴＣ１４０３２７）を、ＴＩＧＲデータベースにおいて同定した。ＰＣＲプライマー対（ＳＪ２７−ＳＪ７３およびＳＪ７２−ＳＪ７５）を、コメＣｓｌＨ１配列に基づいて設計し、これらを用いてｃＤＮＡ由来の配列を増幅した。次いで、遺伝子の５’末端を５’ＲＡＣＥにより、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリと、ネステッドＣｓｌＨ１プライマーＳＪ２８およびＳＪ７９を使用して、製造業者（Clontech）の指示書に従って増幅した。
【０２６３】
全長ゲノムクローンを、プライマーＳＪ９１およびＳＪ８５ならびにＰｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて、製造業者の推奨するサイクリング条件（変性９８℃３０秒、その後、９８℃５秒、６３℃７秒および７２℃３分を３５サイクル）に従って増幅することによって単離し、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングした。
【０２６４】
コムギＣｓｌＨゲノムクローンを、ＰＣＲによって、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、栽培品種チャイニーズ・スプリングからプライマーＳＪ１６３およびＳＪ１６４を使用して７０℃のアニーリング温度で単離した。ゲノムウォーキングキットを、製造業者（Clontech）の指示書に従って使用し、さまざまなボブホワイト（データ非掲載）から、３種のコムギＣｓｌＨホモログすべてのコード領域の上流に伸長する配列を得た。第３のホモログに特異的なプライマー（ＳＪ２０４）を設計し、ＳＪ１６４とともに使用して第３の全長単離ゲノムクローンを単離した。予測エクソン／イントロン境界が、配列決定ｃＤＮＡ断片により正しくスプライシングされ得ることを確認した（データ非掲載）。
【０２６５】
ＲＴ−ＰＣＲによるコムギおよびオオムギ中のＣｓｌＨ遺伝子の発現分析
総ＲＮＡを、７日齢の植物の第１葉、さまざまな年齢の濃い色の成長した子葉鞘および開花後４日（ＤＰＡ）間隔をあけて回収した成長中の穀粒の切片から単離し、ＤＮＡｓｅ処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩを用いて製造業者（Invitrogen）の指示書に従って逆転写した。ＰＣＲ反応を、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Qiagen）を使用して実施した。ｃＤＮＡを希釈し、１μｌ当たり１ｎｇの元のＲＮＡと等量のレベルでＰＣＲ反応に使用した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲのためにはＣｓｌＨ１プライマーＳＪ７２およびＳＪ７４、ＣｓｌＦ遺伝子のためのプライマー対は下記のとおりであった；（ＣｓｌＦ６；ＳＪ１０７−ＳＪ８２）、（ＣｓｌＦ４；ＳＪ９４−ＳＪ９５）、（ＣｓｌＦ９；ＳＪ９７−ＳＪ９３）、（ＣｓｌＦ３；ＳＪ４４−ＳＪ３８）、（ＣｓｌＦ８；ＳＪ９６−ＳＪ３７）。アニーリング温度は５９℃を使用した。試験増幅を実施して、増幅が飽和（チューブリンの２４サイクルを除き、およそ３２〜３５サイクル）でなかったことを確実にし、産物を、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。リアルタイムＰＣＲを３連の試料について、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００装置（Corbett Life Sciences, AU）においてＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Qiagen）、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎならびにプライマーＳＪ１８３およびＳＪ１６４ならびにアニーリング温度６０℃を使用して実施した。相対的発現レベルを、コムギ０ｄｐａ試料を比較因子（１に設定）として用いて、装置のソフトウェアを使用して計算した。この試料のＣｔ値は２５．５サイクルであった。１５ｄｐａにおけるトランスジェニック穀粒の分析のために、相対的発現値を、チューブリンに対して正規化し、最も低い発現系統（Ｈ１−１３）と比較した。
【０２６６】
Ｑ−ＰＣＲによるオオムギ中のＣｓｌＨ遺伝子の発現分析
ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を、発芽後０．５から７日の成長中の子葉鞘において測定した。ＨｖＣｓｌＨ１転写産物は、伸長段階の完了および葉の出現後にだけ蓄積されることが示された。発現の最も高いレベルは、子葉鞘が老化（ねじれおよび収縮）する７日後に見られた（Gibeaut et al., Planta 221:729-738, 2005）。
【０２６７】
胚乳においてオオムギＣｓｌＨ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックコムギ植物の作製
全長オオムギ品種ヒマラヤのゲノムＣｓｌＨ配列（配列番号７１）を、プライマーＳＪ９１およびＳＪ８５を使用して増幅し、高分子量グルテニンＢｘ１７プロモーターの１．９ｋｂ断片とノパリンシンターゼターミネーターの間に、ＥｃｏＲＩ断片として挿入した（図２３）。Ｂｘ１７プロモーターは、成長中の胚乳において高レベルの発現をもたらす（Reddy and Appels, Theor Appl Genet 85: 616-624, 1993）。
【０２６８】
ボブホワイト２６コムギ植物を、バイオリスティック法（Pellegrineschi et al., Genome 45: 421-430, 2002）を使用して、５０ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８を選択試薬として用い形質転換させた。ＨｖＣｓｌＨ発現ベクター（ｐＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１）とＮＰＴＩＩ選択可能なマーカー（ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏ、図２４）の発現を駆動するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを有する第２のプラスミドとを等モル量で混合し、未熟胚に同時に撃ち込んだ。
【０２６９】
トランスジェニック植物を、トランスジーンの存在に関して、若葉組織およびSigma社のＲｅｄＥｘｔｒａｃｔｎＡｍｐ（商標）キットを使用して、プライマーＳＪ２４４およびＳＪ７９を用いてスクリーニングした。
【０２７０】
開花（葯の出現および花粉の脱落）において、先端をタグ付加し、穀粒をおよそ１５ｄｐａにおいて試料採取可能にした。先端由来の３種の穀粒をプールし、ＲＮＡを抽出し、逆転写し、トランスジーンの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによりプライマーＳＪ１８３およびＳＪ８５を使用して分析した。発現レベルを、α−チューブリン（プライマーＴＵＢおよびＴＵＢ２Ｆ）に対して正規化し、最終的に最も低い発現体と比較した比で表した。
【０２７１】
成熟単一穀粒由来の粉を、β−グルカン含有量に関して、リケナーゼ酵素法（AACC Method 32-33, Megazyme assay kit, McCleary and Glennie-Holmes, J. Inst Brewing 91: 285-295, 1985）の小規模バージョンを使用して分析した。β−グルカン含有量を、粉砕全粒粉のパーセント（ｗ／ｗ）として表した。
【実施例１３】
【０２７２】
オオムギ品種ゴールデンプロミス（Golden Promise）中のオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現
オオムギＣｓｌＨ ｃＤＮＡ（配列番号１）の全長コード領域を、２種のＧａｔｅｗａｙ可能なオオムギ形質転換ベクターに移した。ベクターｐＲＢ４７４は、胚乳特異的発現を提供するオートムギグロブリンプロモーターを含有し（Vickers et al., Plant Mol Biol 62: 195-214, 2006）、ベクターｐＭＤＣ３２（Curtis and Grossniklaus, Plant Physiol. 133: 462-9, 2003）は、すべての植物組織において構成的発現を駆動する二重３５Ｓプロモーターを含有する。
【０２７３】
オオムギの形質転換
ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに移し、オオムギ栽培品種ゴールデンプロミスの未熟胚盤を、確立されたプロトコルを使用して形質転換し、トランスジェニック植物の２種の集団を作製した。トランスジーンの挿入は、サザンブロッティングにより確認した。植物２３６−１から２３６−１８は、オートムギグロブリンプロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ遺伝子を含有する。植物２３７−１および２は、３５Ｓプロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ遺伝子を含有する。植物２０８−２、−３、−５および−７は対照植物であり、オートムギグロブリンプロモーターのみを有する空ベクターｐＲＢ４７４についてトランスジェニックである。
【０２７４】
転写産物の分析
葉および受粉後７および１４日（ＤＡＰ）の成長中の穀粒の試料を、２３６種の植物から回収した。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を使用して、標準的プロトコルに従って抽出し、ｃＤＮＡを、Burton et al.（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）に従って合成した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、Burton et al.（2008、上記）に従って実施した。ＣｓｌＨ遺伝子の転写産物レベルを、トランスジェニック穀粒の胚乳において、一般的に非常に低い野生型胚乳レベルと比較した。
【０２７５】
図２６に示すように、空ベクター対照系統（２０８）は、ＣｓｌＨ転写産物の典型的な野生型のレベルを有する。トランスジェニック系統（２３６）は、７日目（７Ｄ）においてＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡレベルの有意な増加を示し、受粉後１４日目（１４Ｄ）においてさらに増加する。
【０２７６】
β−グルカンの分析
トランスジェニック植物由来のＴ１種子を回収した。個々の個体植物由来のバルクＴ１穀粒の試料を粉砕して粉にし、存在するβ−グルカンの量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ法（上記）を使用して分析した。個々の植物からのデータを、２回の再現の平均値として表し、β−グルカンの量を穀粒重量のパーセントとして、下記の表８に示す。
【表８】
【０２７７】
空ベクター対照系統（２０８）は、およそ４％の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量を有し、これは野生型ゴールデンプロミス穀粒では典型的である。Ｔ１穀粒をバルク化した（したがって、ヌル分離穀粒（null-segregant grain）を含有する）にもかかわらず、有意な数のトランスジェニック系統（網掛け部分）が対照より高い総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量を示し、最も高い値は５．９％であった。
【０２７８】
当業者であれば、本明細書に記述されている本発明が、具体的に記述されているもの以外の変形および変更を許容することを理解するであろう。本発明はそのような全ての変形および変更を含むと理解されるべきである。本発明は同様に、個別的にまたは集合的に、本明細書において述べられ、または示されているステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに該ステップまたは特徴のいずれか２つ以上の任意のおよび全ての組合せを含む。
【０２７９】
同様に、本明細書において用いられる単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上既に特段の指示がないかぎり、複数の態様を含むことに留意しなければならない。すなわち、例えば、「トランスジーン（a transgene）」への言及は、単一のトランスジーンだけでなく２以上のトランスジーンを含み、「植物細胞(a plant cell)」は単一の細胞だけでなく２以上の細胞を含むなどである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法。
【請求項２】
細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法。
【請求項３】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップ、および該細胞に該単離されたＣｓｌＨ核酸を発現させるステップを含む方法。
【請求項４】
前記細胞が植物細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が単子葉植物細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が穀類植物細胞である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン。
【請求項８】
以下：
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
のいずれか１以上を含む細胞。
【請求項９】
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンをさらに含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の方法により作製された、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
植物細胞である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
単子葉植物細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
穀類植物細胞である、請求項１１または１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物。
【請求項１５】
植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、請求項１４に記載の多細胞構造物。
【請求項１６】
穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、請求項１４または１５に記載の多細胞構造物。
【請求項１７】
穀粒を含む、請求項１６に記載の多細胞構造物。
【請求項１８】
そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒。
【請求項１９】
以下：
請求項１７または１８に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含む穀粉。
【請求項２０】
単離されたＣｓｌＨ核酸、又はその相補体、逆相補体もしくは断片。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の単離された核酸分子または請求項２１に記載の遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項２３】
植物細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
単子葉植物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
穀類植物細胞である、請求項２３または２４に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物。
【請求項２７】
植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、請求項２６に記載の多細胞構造物。
【請求項２８】
穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、請求項２６または２７に記載の多細胞構造物。
【請求項２９】
穀粒を含む、請求項２８に記載の多細胞構造物。
【請求項３０】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはその断片を規定するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドまたはその断片が、ＣｓｌＨによりコードされる１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含む、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片に対して生起された抗体またはそのエプトープ結合性フラグメント。
【請求項１】
細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するステップを含む方法。
【請求項２】
細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法。
【請求項３】
（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップ、および該細胞に該単離されたＣｓｌＨ核酸を発現させるステップを含む方法。
【請求項４】
前記細胞が植物細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が単子葉植物細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が穀類植物細胞である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン。
【請求項８】
以下：
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；ならびに／あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸
のいずれか１以上を含む細胞。
【請求項９】
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンをさらに含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の方法により作製された、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
植物細胞である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
単子葉植物細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
穀類植物細胞である、請求項１１または１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物。
【請求項１５】
植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、請求項１４に記載の多細胞構造物。
【請求項１６】
穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、請求項１４または１５に記載の多細胞構造物。
【請求項１７】
穀粒を含む、請求項１６に記載の多細胞構造物。
【請求項１８】
そのレベルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒。
【請求項１９】
以下：
請求項１７または１８に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉；および
任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含む穀粉。
【請求項２０】
単離されたＣｓｌＨ核酸、又はその相補体、逆相補体もしくは断片。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の単離された核酸分子または請求項２１に記載の遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項２３】
植物細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
単子葉植物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
穀類植物細胞である、請求項２３または２４に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物。
【請求項２７】
植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、請求項２６に記載の多細胞構造物。
【請求項２８】
穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、請求項２６または２７に記載の多細胞構造物。
【請求項２９】
穀粒を含む、請求項２８に記載の多細胞構造物。
【請求項３０】
ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはその断片を規定するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドまたはその断片が、ＣｓｌＨによりコードされる１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含む、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片に対して生起された抗体またはそのエプトープ結合性フラグメント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公表番号】特表２０１１−５０９０７２（Ｐ２０１１−５０９０７２Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８２８３（Ｐ２０１０−５３８２８３）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１９０６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９７１４
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１０１７４１３０）ザ ユニバーシティ オブ メルボルン (2)
【出願人】（３０５０３９９９８）コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション (92)
【出願人】（５０４２６５０４２）ザ ユニバーシティー オブ アデレード (2)
【出願人】（５０８０３４９１２）グレインズ リサーチ アンド ディベロップメント コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１９０６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９７１４
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１０１７４１３０）ザ ユニバーシティ オブ メルボルン (2)
【出願人】（３０５０３９９９８）コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション (92)
【出願人】（５０４２６５０４２）ザ ユニバーシティー オブ アデレード (2)
【出願人】（５０８０３４９１２）グレインズ リサーチ アンド ディベロップメント コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
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