マイコラクトン遺伝子座:新規ポリケチド製造のためのアッセンブリーライン、治療的および防御的使用法
本発明は、マイコバクテリア(Mycobacterium ulcerans)病原性プラスミド、pMUM001に関し、特にはこのプラスミドが担持する、マイコラクトン生合成にとって必要かつ十分なポリケチド合成酵素(PKS)およびポリケチド修飾酵素をコードしている遺伝子のクラスターに関する。より具体的には、本発明は、精製または単離された新規なポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを産生する工程、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、診断方法、キット、ワクチン、治療におけるこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびコンビナトリアル合成によるマイコラクトン誘導物または新規ポリケチドの製造のための使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離または精製されたポリヌクレオチド:
a)配列番号:1〜6の配列のいずれか一つと少なくとも80%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号:1〜6の配列の少なくとも15連続ヌクレオチドを有するその断片;
b)配列番号:1〜6のDNA配列を含むポリヌクレオチド;
c)配列番号:7〜12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド;
d)配列番号:1〜6の核酸配列を有する変性二本鎖DNAのどちらかの鎖と、高厳密条件下でハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド;
e)配列番号:1〜6からインビトロ突然変異により得たポリヌクレオチドである、d)の該ポリヌクレオチド;
f)遺伝コードの結果として、配列番号:1〜6由来の縮重ポリヌクレオチド;
g)a)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異または相同体であるポリヌクレオチド。
【請求項2】
細菌の人工染色体である、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項3】
ポリヌクレオチドが、マイコバクテリア(Mycobacterium ulcerans)から抽出された、GC含有量が62.8%であり、81CDSを担持している約174kbを含むプラスミドである、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項4】
マイコラクトン産生に必要な酵素をコードしている、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項1記載のポリヌクレオチドがコードする単離または精製されたポリペプチド。
【請求項6】
配列番号:7〜12の配列のいずれか一つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項5記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項7】
配列番号:7〜12のアミノ酸配列を含む、請求項5または6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項8】
マイコラクトンの産生に必要とされる、請求項6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項9】
非グリコシル化形態の請求項5〜8記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項10】
請求項1〜4記載のポリヌクレオチドの発現を指示する組換えベクター。
【請求項11】
請求項10記載のベクターでトランスフェクションまたは形質導入された宿主細胞。
【請求項12】
請求項1〜4のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチドを含有する、形質転換またはトランスフェクションされた細胞。
【請求項13】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項11または12記載の細胞。
【請求項14】
大腸菌(Escherichia coli)からなる、請求項13記載の細胞。
【請求項15】
大腸菌が、登録番号CNCM I-3121またはCNCM I-3122によって、2003年11月3日にInstitut Pasteur(フランス)のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(C.N.C.M.)に寄託された細胞である、請求項14記載の細胞。
【請求項16】
発現および培地からのポリペプチドの回収を促進する条件下で請求項11〜15記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ポリペプチド産生するための方法。
【請求項17】
請求項5〜9記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項18】
モノクローナル抗体である、請求項17記載の抗体。
【請求項19】
MUのMLSポリペプチドおよび該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む免疫学的複合体。
【請求項20】
MU感染を検出するための方法であって、MU感染が疑われる生物材料を含む組成物提供する段階、およびMUのMLSポリペプチドの存在をアッセイする段階を含む、方法。
【請求項21】
MLSポリペプチドを、MLSポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を用いた電気泳動または免疫アッセイによりアッセイする、請求項20記載の方法。
【請求項22】
MLSポリペプチドを含む抗原に結合する抗体の有無を検出するためのインビトロ診断法であって、抗原を生物材料と、抗原が生物材料中の抗体と抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で接触させる段階、および複合体の形成を検出する段階を含む、方法。
【請求項23】
抗原−抗体複合体の形成を測定する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項24】
抗原−抗体複合体の形成を、ウエスタンブロット技術、ELISA、間接免疫蛍光アッセイまたは免疫沈降アッセイに基づく免疫アッセイにより検出する、請求項22記載の方法。
【請求項25】
MLSポリペプチドまたはその混合物に結合する抗体の有無を検出するための診断キットであって、MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドの混合物を含む抗原、および抗原と抗体の間の免疫複合体の形成を検出するための手段を含み、該手段が該検出を実施するのに十分な量存在している、キット。
【請求項26】
インビボで免疫原性または防御反応を誘導するのに十分な量の、少なくとも一つのMLSポリペプチド、およびそのための薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項27】
組成物が少なくとも一つのMLSポリペプチドを中和する量を含む、請求項26記載の免疫原生組成物。
【請求項28】
MUの有無を検出するための方法であって:
(1)MUの遺伝物質を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも一つのヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
(2)ヌクレオチドプローブとサンプル中の遺伝物質との間のハイブリダイゼーションを検出する段階
を含み、
該ヌクレオチドプローブが請求項1d)記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項29】
以下の段階を含む、マイコラクトンの変種を産生する工程:
a)請求項1a)記載の単離または精製されたポリヌクレオチドの突然変異を誘発する段階、
b)マイコバクテリア株(Mycobacterium strain)での該変異ポリヌクレオチドの発現段階、
c)DNAシーケンシングおよび質量分析法による、マイコラクトン産生が変化したマイコバクテリア突然変異体を選択する段階、
d)選択された、トランスフェクションされたマイコバクテリアの培養段階、ならびに
e)該培養の培養物からマイコラクトン変種抽出段階。
【請求項30】
単離または精製されたポリヌクレオチドが配列番号:4の配列またはその断片に対し少なくとも80%同一である核酸配列を有する、請求項29記載の工程。
【請求項31】
以下の段階を含む、成長の速いマイコバクテリアにマイコラクトンを産生させる工程:
a)成長の速いマイコバクテリアの中に配列番号:1、2および3のDNA配列を含む少なくとも三種類の単離されたポリヌクレオチド、または配列番号:1、2および3のヌクレオチド配列を含む、変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖にハイブリダイゼーションする三種類の単離されたポリヌクレオチドをクローニングする段階、
b)適当な培養条件で組換えマイコバクテリアを増殖させることによって単離されたポリヌクレオチドを発現させる段階、および
c)産生したマイコラクトンを精製する段階。
【請求項32】
単離されたポリヌクレオチドが、配列番号:1〜6のDNA配列か、または配列番号:1〜6のヌクレオチド配列を含む変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖とハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含む、請求項31記載の工程。
【請求項1】
以下のポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離または精製されたポリヌクレオチド:
a)配列番号:1〜6の配列のいずれか一つと少なくとも80%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号:1〜6の配列の少なくとも15連続ヌクレオチドを有するその断片;
b)配列番号:1〜6のDNA配列を含むポリヌクレオチド;
c)配列番号:7〜12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド;
d)配列番号:1〜6の核酸配列を有する変性二本鎖DNAのどちらかの鎖と、高厳密条件下でハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド;
e)配列番号:1〜6からインビトロ突然変異により得たポリヌクレオチドである、d)の該ポリヌクレオチド;
f)遺伝コードの結果として、配列番号:1〜6由来の縮重ポリヌクレオチド;
g)a)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異または相同体であるポリヌクレオチド。
【請求項2】
細菌の人工染色体である、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項3】
ポリヌクレオチドが、マイコバクテリア(Mycobacterium ulcerans)から抽出された、GC含有量が62.8%であり、81CDSを担持している約174kbを含むプラスミドである、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項4】
マイコラクトン産生に必要な酵素をコードしている、請求項1記載の単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項1記載のポリヌクレオチドがコードする単離または精製されたポリペプチド。
【請求項6】
配列番号:7〜12の配列のいずれか一つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項5記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項7】
配列番号:7〜12のアミノ酸配列を含む、請求項5または6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項8】
マイコラクトンの産生に必要とされる、請求項6記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項9】
非グリコシル化形態の請求項5〜8記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項10】
請求項1〜4記載のポリヌクレオチドの発現を指示する組換えベクター。
【請求項11】
請求項10記載のベクターでトランスフェクションまたは形質導入された宿主細胞。
【請求項12】
請求項1〜4のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチドを含有する、形質転換またはトランスフェクションされた細胞。
【請求項13】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項11または12記載の細胞。
【請求項14】
大腸菌(Escherichia coli)からなる、請求項13記載の細胞。
【請求項15】
大腸菌が、登録番号CNCM I-3121またはCNCM I-3122によって、2003年11月3日にInstitut Pasteur(フランス)のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(C.N.C.M.)に寄託された細胞である、請求項14記載の細胞。
【請求項16】
発現および培地からのポリペプチドの回収を促進する条件下で請求項11〜15記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ポリペプチド産生するための方法。
【請求項17】
請求項5〜9記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項18】
モノクローナル抗体である、請求項17記載の抗体。
【請求項19】
MUのMLSポリペプチドおよび該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む免疫学的複合体。
【請求項20】
MU感染を検出するための方法であって、MU感染が疑われる生物材料を含む組成物提供する段階、およびMUのMLSポリペプチドの存在をアッセイする段階を含む、方法。
【請求項21】
MLSポリペプチドを、MLSポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を用いた電気泳動または免疫アッセイによりアッセイする、請求項20記載の方法。
【請求項22】
MLSポリペプチドを含む抗原に結合する抗体の有無を検出するためのインビトロ診断法であって、抗原を生物材料と、抗原が生物材料中の抗体と抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で接触させる段階、および複合体の形成を検出する段階を含む、方法。
【請求項23】
抗原−抗体複合体の形成を測定する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項24】
抗原−抗体複合体の形成を、ウエスタンブロット技術、ELISA、間接免疫蛍光アッセイまたは免疫沈降アッセイに基づく免疫アッセイにより検出する、請求項22記載の方法。
【請求項25】
MLSポリペプチドまたはその混合物に結合する抗体の有無を検出するための診断キットであって、MLSポリペプチドまたはMLSポリペプチドの混合物を含む抗原、および抗原と抗体の間の免疫複合体の形成を検出するための手段を含み、該手段が該検出を実施するのに十分な量存在している、キット。
【請求項26】
インビボで免疫原性または防御反応を誘導するのに十分な量の、少なくとも一つのMLSポリペプチド、およびそのための薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項27】
組成物が少なくとも一つのMLSポリペプチドを中和する量を含む、請求項26記載の免疫原生組成物。
【請求項28】
MUの有無を検出するための方法であって:
(1)MUの遺伝物質を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも一つのヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
(2)ヌクレオチドプローブとサンプル中の遺伝物質との間のハイブリダイゼーションを検出する段階
を含み、
該ヌクレオチドプローブが請求項1d)記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項29】
以下の段階を含む、マイコラクトンの変種を産生する工程:
a)請求項1a)記載の単離または精製されたポリヌクレオチドの突然変異を誘発する段階、
b)マイコバクテリア株(Mycobacterium strain)での該変異ポリヌクレオチドの発現段階、
c)DNAシーケンシングおよび質量分析法による、マイコラクトン産生が変化したマイコバクテリア突然変異体を選択する段階、
d)選択された、トランスフェクションされたマイコバクテリアの培養段階、ならびに
e)該培養の培養物からマイコラクトン変種抽出段階。
【請求項30】
単離または精製されたポリヌクレオチドが配列番号:4の配列またはその断片に対し少なくとも80%同一である核酸配列を有する、請求項29記載の工程。
【請求項31】
以下の段階を含む、成長の速いマイコバクテリアにマイコラクトンを産生させる工程:
a)成長の速いマイコバクテリアの中に配列番号:1、2および3のDNA配列を含む少なくとも三種類の単離されたポリヌクレオチド、または配列番号:1、2および3のヌクレオチド配列を含む、変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖にハイブリダイゼーションする三種類の単離されたポリヌクレオチドをクローニングする段階、
b)適当な培養条件で組換えマイコバクテリアを増殖させることによって単離されたポリヌクレオチドを発現させる段階、および
c)産生したマイコラクトンを精製する段階。
【請求項32】
単離されたポリヌクレオチドが、配列番号:1〜6のDNA配列か、または配列番号:1〜6のヌクレオチド配列を含む変性した、二本鎖DNAのいずれかの鎖とハイブリダイゼーションする、少なくとも15ヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含む、請求項31記載の工程。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6−1】
【図6−2】
【図6−3】
【図6−4】
【図6−5】
【図6−6】
【図6−7】
【図6−8】
【図6−9】
【図6−10】
【図6−11】
【図6−12】
【図6−13】
【図6−14】
【図6−15】
【図6−16】
【図6−17】
【図6−18】
【図7−1】
【図7−2】
【図7−3】
【図8−1】
【図8−2】
【図8−3】
【図8−4】
【図8−5】
【図8−6】
【図8−7】
【図8−8】
【図8−9】
【図8−10】
【図8−11】
【図8−12】
【図8−13】
【図8−14】
【図8−15】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12−1】
【図12−2】
【図12−3】
【図12−4】
【図12−5】
【図13】
【図14−1】
【図14−2】
【図14−3】
【図14−4】
【図14−5】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18−1】
【図18−2】
【図18−3】
【図18−4】
【図18−5】
【図18−6】
【図18−7】
【図18−8】
【図18−9】
【図18−10】
【図18−11】
【図18−12】
【図18−13】
【図18−14】
【図18−15】
【図18−16】
【図18−17】
【図18−18】
【図18−19】
【図18−20】
【図18−21】
【図18−22】
【図18−23】
【図18−24】
【図18−25】
【図18−26】
【図18−27】
【図18−28】
【図18−29】
【図18−30】
【図18−31】
【図18−32】
【図18−33】
【図18−34】
【図18−35】
【図18−36】
【図18−37】
【図18−38】
【図18−39】
【図18−40】
【図18−41】
【図18−42】
【図18−43】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6−1】
【図6−2】
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【図6−5】
【図6−6】
【図6−7】
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【図6−12】
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【図6−14】
【図6−15】
【図6−16】
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【図6−18】
【図7−1】
【図7−2】
【図7−3】
【図8−1】
【図8−2】
【図8−3】
【図8−4】
【図8−5】
【図8−6】
【図8−7】
【図8−8】
【図8−9】
【図8−10】
【図8−11】
【図8−12】
【図8−13】
【図8−14】
【図8−15】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12−1】
【図12−2】
【図12−3】
【図12−4】
【図12−5】
【図13】
【図14−1】
【図14−2】
【図14−3】
【図14−4】
【図14−5】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18−1】
【図18−2】
【図18−3】
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【図18−5】
【図18−6】
【図18−7】
【図18−8】
【図18−9】
【図18−10】
【図18−11】
【図18−12】
【図18−13】
【図18−14】
【図18−15】
【図18−16】
【図18−17】
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【図18−19】
【図18−20】
【図18−21】
【図18−22】
【図18−23】
【図18−24】
【図18−25】
【図18−26】
【図18−27】
【図18−28】
【図18−29】
【図18−30】
【図18−31】
【図18−32】
【図18−33】
【図18−34】
【図18−35】
【図18−36】
【図18−37】
【図18−38】
【図18−39】
【図18−40】
【図18−41】
【図18−42】
【図18−43】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【公表番号】特表2007−511218(P2007−511218A)
【公表日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−538998(P2006−538998)
【出願日】平成16年11月15日(2004.11.15)
【国際出願番号】PCT/IB2004/003999
【国際公開番号】WO2005/047509
【国際公開日】平成17年5月26日(2005.5.26)
【出願人】(506164420)インスティテュート パストゥール (1)
【出願人】(506163799)ユニバーシティー オブ テネシー (1)
【出願人】(304044531)モナシュ ユニバーシティー (9)
【出願人】(506163445)オースティン ユニバーシティー (1)
【出願人】(506163641)バイオティカ テクノロジー (1)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年11月15日(2004.11.15)
【国際出願番号】PCT/IB2004/003999
【国際公開番号】WO2005/047509
【国際公開日】平成17年5月26日(2005.5.26)
【出願人】(506164420)インスティテュート パストゥール (1)
【出願人】(506163799)ユニバーシティー オブ テネシー (1)
【出願人】(304044531)モナシュ ユニバーシティー (9)
【出願人】(506163445)オースティン ユニバーシティー (1)
【出願人】(506163641)バイオティカ テクノロジー (1)
【Fターム(参考)】
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